TECNICHE ANALITICHE DI RIVELAZIONE PER PROTEINE TECNICHE SPETTROSCOPICHE: Rivelazione in base all interazione fra proteine e radiazione

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1 TECNICHE ANALITICHE DI RIVELAZIONE PER PROTEINE TECNICHE SPETTROSCOPICHE: Rivelazione in base all interazione fra proteine e radiazione elettromagnetica. Determinazione della concentrazione (quantificazione) Studio della struttura TECNICHE ELETTROFORETICHE: Rivelazione in base alla migrazione differenziale delle proteine in un campo elettrico Valutare il grado di purezza Determinazione peso molecolare (approssimativo) e del pi Identificazione se accoppiate a spettrometria di massa e immuno-rivelazione Quantificazione SAGGI FUNZIONALI: per es. enzimatici, interazione con ligandi, attività antibatterica/antivirale.. SPETTROMETRIA DI MASSA: Identificazione della/e proteina/e mediante la misura della massa molecolare con elevata accuratezza e precisione, determinazione della sequenza e delle modificazioni post-traduzionali Quantificazione Elevata sensibilità TECNICHE IMMUNOLOGICHE: Identificazione mediante interazione con anticorpi specifici (es: western-blotting) Determinazione della concentrazione (ELISA) Elevata sensibilità

2 TECNICHE SPETTROSCOPICHE (si rimanda alla chimica analitica) Implicano l utilizzo di radiazioni elettromagnetiche di diversa lunghezza d onda (λ) La luce bianca può essere scomposta con un prisma Ultravioletto (UV) = nm Visibile (VIS) = nm

3 ASSORBIMENTO Le radiazione ultraviolette o nel visibile (UV = nm; VIS = nm) hanno energia sufficiente per provocare il fenomeno dell assorbimento. Quando la radiazione elettromagnetica colpisce la molecola provoca una transizione TEMPORANEA di elettroni tra orbitali a diverse energie (STATO ECCITATO). La capacità di una molecola di assorbire la radiazione elettromagnetica può essere misurata e utilizzata per identificarla e quantificarla La lunghezza d onda della luce assorbita da una molecola dipende dai suoi gruppi funzionali (CROMOFORI) e quindi può essere d aiuto per identificare la natura della molecola.

4 SPETTROFOTOMETRO Misura l assorbimento che le molecole hanno quando sono colpite dai fotoni di luce UV-VIS Sorgente luminosa. VIS: lampada al tungsteno (radiazioni fra 380 e 800 nm) UV: lampada a deuterio o a idrogeno con involucro di quarzo (radiazioni fra 190 e 340 nm) Cuvetta. Contiene la soluzione dell analita da analizzare Rivelatore = superficie sensibile ai fotoni che genera un segnale elettrico proporzionale all intensità di luce che la colpisce. Fenditura. Rende paralleli i raggi luminosi. Monocromatore. Seleziona una data radiazione, con una certa λ, Solo quella desiderata uscirà attraverso la fenditura d uscita e attraverserà il campione nella cuvetta.

5 CUVETTE VIS = cuvette in plastica o vetro UV = cuvette in quarzo Possono avere 4 facce ottiche o 2 facce ottiche e 2 opache.

6 MONOCROMATORI Dispositivi per selezionare le lunghezze d onda FILTRI DI ASSORBIMENTO PER IL VISIBILE: costituiti da vetri colorati, lasciano passare solo una lunghezza d onda e assorbono tutte le altre. Usati nei COLORIMETRI ELEMENTI DISPERDENTI. Disperdono la luce deviando le diverse lunghezze d onda che la costituiscono: PRISMA: disperde le radiazioni con diversa λ per rifrazione: quando un raggio di luce passa da un mezzo ad un altro subisce una deviazione di un angolo inversamente proporzionale alla λ della radiazione (cioè, radiazioni con diversa λ subiscono diversa deviazione). RETICOLO. Agisce come il prisma ma per effetto della riflessione. Sono costituiti da serie di solchi o fenditure parallele tracciati su una superficie lucida a distanza ravvicinata.

7 Che succede quando le molecole contenute in soluzione dentro la cuvetta sono attraversate dalla radiazione elettromagnetica? Campione Cuvetta I 0 = Intensità della radiazione incidente I = intensità della radiazione trasmessa (se le molecole dentro la cuvetta assorbono la radiazione trasmessa sarà meno intensa di quella incidente) I/I 0 = TRASMITTANZA l = 1 cm Il valore della trasmittanza è compreso fra 0 e 1 espresso in % se I = I 0 T= I/I 0 =1 (100%) soluzione completamente trasparente, la radiazione è completamente trasmessa se I=0 T= I/I 0 = 0 (0%) soluzione completamente opaca, la radiazione è completamente assorbita log 1 / T = A = ASSORBANZA Frazione di luce che attraversa il campione senza essere assorbita Lo spettrofotometro misura la trasmittanza e la trasforma in ASSORBANZA, Quindi ci fornisce una misura della quantità di luce assorbita dalla molecola.

8 SPETTROFOTOMETRI SPETTROFOTOMETRI MONORAGGIO SPETTROFOTOMETRI A DOPPIO RAGGIO SPETTROFOTOMETRI A SERIE DI DIODI SPETTROFOTOMETRI A SINGOLO RAGGIO Usati prevalentemente in analisi quantitativa e non sono comodi per ottenere spettri di assorbimento. PRIMA di effettuare la lettura del campione, bisogna effettuare L AZZERAMENTO CON UN BIANCO: contiene solo il tampone ma non l analita. Il valore di assorbanza del bianco andrà sottratto a quello del campione per eliminare l interferenza dovuta al tampone.

9 SPETTROFOTOMETRO A DOPPIO RAGGIO Invia due raggi, identici per frequenza e intensità, uno attraverso il campione e l'altro attraverso il bianco, per cui si ha un confronto continuo tra l'assorbanza del campione e quella del bianco. AZZERAMENTO AUTOMATICO

10 SPETTROFOTOMETRO A FOTODIODO (DIODE ARRAY DAD) Rivelatore composto da centinaia di microcircuiti allineati su chip, può registrare simultaneamente l assorbanza di un analita a diverse lunghezze d onda. Permette un acquisizione molto rapida da 190 a 820 nm in 100 msec, quindi dall UV al VIS. Tutta la luce è inviata sul campione, la radiazione trasmessa dal campione è poi dispersa e convogliata sul fotodiodi Utile quando associato ad una CELLA A FLUSSO: in cui vengono fatti fluire per mezzo di un solvente/tampone gli analiti separati a monte (per cromatografia, HPLC). Il loro assorbimento può essere registrato in tempo reale mano a mano che passano nella cella a flusso. Cella a flusso Fessura ottica Grata

11 APPLICAZIONI DELLA SPETTROFOTOMETRIA UV/VIS 1. Spettro di assorbimento: Misurazione dell assorbanza in un intervallo di lunghezze d onda (soprattutto per avere informazioni dal punto di vista qualitativo, strutturale) 2. Misurazione dell assorbanza a lunghezza d onda prefissata (soprattutto per determinare la concentrazione del campione d interesse) 3. Attività e cinetica enzimatica: si misura la velocità di comparsa o scomparsa di una sostanza con un picco caratteristico di assorbimento che partecipi come substrato o come prodotto alla reazione enzimatica in esame

12 1. Misurazione dell assorbanza in un intervallo di lunghezze d onda: SPETTRO DI ASSORBIMENTO Una proteina può assorbire le radiazioni elelttromagnetiche nella regione dell UV-VIS grazie alla presenza di GRUPPI CROMOFORI Legami peptidici: assorbimento a 190 nm e a nm Transizione di 1 e- dall orbitale di legame π all orbitale di non-legame π* Amminoacidi aromatici: transizione π π* Phe: 250 nm Tyr: 274 nm Trp: 280 nm Transizione di 1 e- dall orbitale di nonlegame n (con 1 doppietto elettronico) all orbitale di non-legame π* (in O e N) Gruppi prostetici in proteine coniugate: EME, FAD, NAD+, IONI METALLICI.. Ognuno ha delle caratteristiche di assorbimento particolari e riconoscibili.

13 ASSORBANZA SPETTRO DI ASSORBIMENTO Quando su una soluzione di un dato analita (per es.: proteina) è attraversata da un intervallo (spettro) di lunghezze d onda (per es.: nm) lo spettrofotometro registra uno spettro di assorbimento: Grafico che rappresenta l assorbanza della molecola nell intervallo di lunghezze d onda incidenti. Assorbanza, ε, sono parametri che ci servono a misurare dal punto di vista quantitativo il processo di assorbimento della radiazione elettromagnetica nm

14 Proteine coniugate con Gruppi prostetici, es. Hb, Mb, citocromi, catalasi, sono coniugate con un gruppo EME e presentano tutte un caratteristico picco di assorbimento a nm, assorbono nel visibile. Maggiore è il numero dei doppi legami coniugati, maggiore è la di assorbimento ->VIS Per l EMOGLOBINA si misura un caratteristico spettro di assorbimento per la forma OSSI-Hb (picchi a 415, 540, 577 nm) e uno per la forma DEOSSI-Hb (picchi a 430 e 560 nm). Riconosco lo stato di ossigenazione, Posso quantificare la concentrazione di OSSI-Hb rispetto alla concentrazione di Hb totale (frazione saturazione)

15 Alle di 540, 560 e 577 nm = massima differenza nell assorbanza fra la forma DEOSSI- e la forma OSSI-Hb. Queste possono essere usate per misurare la variazione di assorbanza in funzione dell aumento della po 2 In base alla variazione di assorbanza (che è proporzionale alla concentrazione ricavo la frazione di saturazione (Y) di HbO 2 1,00 0 mmhg 0.75 Y mmhg ,0 40,0 60,0 80,0 po 2 (mmhg)

16 Citocromi: REAZIONI DI TRASFERIMENTO REVERSIBILE MONOELETTRONICHE (Fe 3+ Fe 2+ ) cit. b l 560nm cit. c l 550nm l 605nm cit. a

17 Un estratto proteico può contenere acidi nucleici, nucleotidi Posso verificare la loro presenza mediante la misura di uno spettro di assorbimento. Gli acidi nucleici e i nucleotidi assorbono nell UV, grazie alla presenza di basi azotate (sistemi con doppi legami coniugati): il picco di massimo assorbimento per il DNA/RNA è 260 nm Tra nm Nucleotidi mono-fosfato A 260 nm > 1.6 soluzioni contaminate da DNA A 280 nm Gli acidi nucleici possono essere allontanati mediante precipitazione (protamina solfato) o mediante Dnasi e RNasi

18 Picco a λ 260 nm Contiene nella struttura una porzione nucleotidica (NAD = nicotinamide adenina dinucleotide) In base allo spettro di assorbimento possiamo distinguere le forme OSSIDATA E RIDOTTA del NAD NAD + NADH Picco a λ 340 nm Tipico della forma ridotta (che ha subito un riarrangiamento elettronico nell anello nicotinammidico) Posso sfruttare le diverse proprietà di assorbimento delle due forme ossidata e ridotta per seguire la cinetica di enzimi, DEIDROGENASI, che catalizzano reazioni di ossidoriduzione NAD(P)- dipendenti

19 2. Misurazione dell assorbanza a lunghezza d onda prefissata a) Conosco il coefficiente di estinzione molare dell analita e applico la legge di Lambert-Beer LEGGE DI LAMBERT-BEER Mette in relazione la quantità di luce assorbita da un certo analita con la sua concentrazione legge di Lambert-Beer A= λ l c l= cammino ottico, generalmente = 1 cm λ = coefficiente di estinzione c = concentrazione dell analita

20 Cammino ottico. Il campione è contenuto in un contenitore parallelepipedo chiamato CUVETTA che è attraversato dalla radiazione, questa percorre una distanza di 1 cm (in genere) tra 2 facce parallele della cuvetta. l

21 ASSORBANZA: A = log 1 / T TRASMITTANZA : I/I 0 A Perché utilizzare l assorbanza e non la trasmittanza? Esiste una relazione di proporzionalità diretta fra assorbanza e concentrazione. Mentre la relazione esistente fra trasmittanza e concentrazione non è lineare.

22 ε = COEFFICIENTE DI ESTINZIONE MOLARE = dipende dalla natura del campione e definisce l efficienza dell assorbimento. È l assorbanza di un analita a concentrazione 1M, e quando il cammino ottico è 1 cm, ottenuta ad una determinata lunghezza d onda. A = = A quando c=1 M, l =1cm c l Il coefficiente di estinzione può essere espresso come: coefficiente di estinzione molare M -1 cm -1 coefficiente di estinzione millimolare mm -1 cm -1 coefficiente di estinzione E λ 1% 1% = 1g/100 ml Per numerose proteine e peptidi ε è stato determinato, per es.: emoglobina 540 mm HbO2 = 13.5 mm -1 cm -1 risulta che A= 13.5 quando HbO 2 è 1mM e il cammino ottico 1cm

23 In quale intervallo di concentrazioni è consigliato effettuare misure di Assorbimento? La soluzione non deve essere: Troppo concentrata = intensità della luce trasmessa (I) molto bassa, misura dell assorbanza soggetta ad errore Troppo diluita = la differenza fra I e I 0 sarà molto piccola e l assorbanza soggetta ad errori Regola generale: una determinazione accurata della concentrazione di un campione è possibile in un intervallo di valori di assorbanza Limite strumentale: a concentrazioni maggiori la relazione tra A e c non è più lineare