La generazione dei recettori x antigeni

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1 La generazione dei recettori x antigeni

2 Il repertoire anticorpale Il numero totale di anticorpi disponibili per ogni individuo è altissimo: almeno 100 miliardi di molecole diverse, e forse molte di più Questa diversità è solo minimamente garantita da diversità nella linea germinale, mentre è principalmente generata da riarrangiamenti genici nelle cellule somatiche che producono I recettori antigenici

3 I geni per le Ig sono riarrangiati nelle cellule B Analisi per Southern blot di una digestione con enzimi di restrizione di DNA genomico da cellule non-linfoidi (a sinistra) e linfociti B. I probe corrispondono a frammenti della regione C e della regione V.

4 Le regioni variabili sono generate a partire da diversi segmenti genici Regioni variabili delle catene pesanti e leggere sono generate dalla ricombinazione somatica di diversi segmenti genici Catene leggere: Due segmenti: Segmento V (I primi 100 aa circa) Segmento J (altri 13 aa) Catene pesanti: Tra I segmenti V e J c è il segmento D Produzione di una catena leggera completa di IgG Congiunzione dei segmenti V-J x riarrangiamento genico Questo porta VJ >> vicino alla regione C, quindi il trascritto che si forma genera la catena leggera per RNA splicing Produzione di una catena pesante di Ig Produzione di DJ per riarrangiamento Produzione di VDJ per riarrangiamento Catena completa come per quella leggera (x splicing)

5 Le regioni variabili sono generate a partire da diversi segmenti genici

6 I diversi segmenti genici della regione V sono presenti in multiple copie Esistono multipli segmenti genici Molti sono pseudogeni non funzionali (scarsa pressione genica vista la ridondanza, che favorisce la variabilità e mutazioni) Per ogni catena immunoglobulinica (H e L, questa ultima divisa in κ e λ) c è un distinto locus genico Importante : il locus per la regione C della catena pesante è organizzato in modo da contenere diverse regioni C che corrispondono alla diversa classe anticorpale

7 L organizzazione germinale dei loci per le varie catene delle Ig

8 Come è regolata la ricombinazione? I complessi riarrangiamenti genici necessari devono avvenire correttamente nello spazio e nel tempo Sequenze conservate: recombination signal sequences (RSS), blocchi di 7 nucleotidi +spacer+9 nucleotidi che si trovano in adiacenza dei vari segmenti genici La lunghezza degli spacer determina l accoppiamento dei vari segmenti

9 Come è regolata la ricombinazione?

10 Enzimi necessari per la ricombinazione Nella maggior parte dei casi, I due segmenti che vanno incontro a riarrangiamento sono nello stesso orientamento sul DNA, il risultato della ricombinazione è un circolo di DNA extracromosomale che contiene la regione escissa Gli enzimi che effettuano la ricombinazione sono chiamati V(D)J ricombinasi Specifici per I linfociti: RAG-1 e RAG-2 Quando sono espressi artificialmente in cellule non linfocitarie le rendono in grado di fare riarrangiamenti Protein coinvolte normalmente nel processo di riparo del DNA DNA PK Artemis DNA ligase IV Il ruolo di questi enzimi è stato stabilito studiando le loro mutazioni Nell uomo la sindrome di Omenn è causata da mutazioni di RAG1 o RAG2, con assenza di linfociti B circolanti e problemi ai linfociti T, mutazioni in geni del DNA repair causano altri tipi di malattie complesse Nel topo mutazioni nei geni della ricombinazione danno origine ai topi SCID (severe combined immuno deficiency)

11 Differenze nella ricombinazione fra regioni geniche con simile vs opposto orientamento trascrizionale Nel caso di regioni con orientamento opposto, c è un rimodellamento topologico più complesso del DNA, il risultato finale è che c è inversione ed integrazione del DNA frapposto alle due regioni V e J che devono essere cucite fra loro

12 Dettagli molecolari della ricombinazione

13 Come si genera la diversità del repertoire anticorpale? Meccanismo combinatorio Riarrangiamento di segmenti diversi Utilizzo di catene diverse Insieme I due meccanismi garantiscono circa 2,000,000 di combinazioni diverse Meccanismo di riarrangiamento impreciso Alcuni nucleotidi possono venire aggiunti o sottratti dagli enzimi ricombinativi nel sito di giunzione, generando cambi di sequenza proteica Meccanismo di ipermutazione somatica (lo spieghiamo dopo) Tutti insieme questi processi garantiscono > diversità anticorpale

14 Come si genera la diversità del repertoire anticorpale? Meccanismo combinatorio Riarrangiamento di segmenti diversi Utilizzo di catene diverse Insieme I due meccanismi garantiscono circa 2,000,000 di combinazioni diverse Meccanismo di riarrangiamento impreciso Alcuni nucleotidi possono venire aggiunti o sottratti dagli enzimi ricombinativi nel sito di giunzione, generando cambi di sequenza proteica Meccanismo di ipermutazione somatica (lo spieghiamo dopo) Tutti insieme questi processi garantiscono > diversità anticorpale

15 Introduzione di nucleotidi P ed N alle giunzioni dei segmenti D e J durante la ricombinazione

16 Meccanismi di riarrangiamento del TCR Il riarrangiamento avviene nel timo Alpha locus: segmenti V e J Beta locus: segmenti V, D e J Simile nella struttura ai loci per le Ig

17 Meccanismi di riarrangiamento del TCR Meccanismo simile a quello delle Ig Sono coinvolti gli stessi enzimi Dal momento che la C-region delle IgG svolge > funzioni effettrici, c è maggiore variabilità nella C region delle Ig rispetto ai TCR, che contengono solo 1 segmento genico per C-alpha e due segmenti genici per C-beta

18 Variazione strutturale nella regione costante delle Ig La cellula B naïve sfrutta solo I segmenti genici per due regioni C (Cµ e Cδ, localizzate in vicinanza della regione V) Questo porta all espressione di IgM ed IgD Durante l attivazione delle cellule B avviene il cosiddetto class switching, ed abbiamo la produzione di altre Ig con differenti funzioni La regione costante è importantissima per molte funzioni effettrici degli anticorpi Legame a recettori cellulari Legame al complemento Trasporto (p.es. latte, secrezioni come saliva e lacrime )

19 I diversi isotipi di Ig

20 Organizzazione genica della regione C La produzione di IgM o IgD avviene mediante la trascrizione di un lunga molecola che viene poi sottoposta a splicing per generare la Ig matura

21 Espressione di IgM ed IgD

22 Produzione della forma di membrana vs la forma solubile per uso di trascritti alternativi

23 Forme polimeriche di Ig IgM: come pentameri IgA: come dimeri (nelle secrezioni) Le regioni C di queste Ig contengono una coda di 18aa essenziale per la polimerizzazione che contiene un residuo di cisteina Una catena di 15kda chiamata catena J (niente a che fare con il segmento genico J!) promuove la polimerizzazione legandosi alla cisteina della coda delle regioni C La polimerizzazione potrebbe essere utile per il legame delle Ig ad epitopi ripetitivi come quelli presenti sulle superfici batteriche Inoltre l aumento del numero di siti/molecola (10 per IgM) porta ad un legame molto >>> con l antigene (maggiore avidità)

24 Struttura delle forme polimeriche di Ig

25 La diversificazione del repertoire anticorpale dopo l attivazione I meccanismi di diversificazione discussi finora riarrangiamenti genici- avvengono durante la maturazione delle cellule B Quando la cellula B riconosce l antigene va incontro ad attivazione, inducendo nuovi meccanismi di diversificazione Tentativo di ottimizzazione della risposta anticorpale Mutazione ipersomatica class switch Conversione genica

26 La risposta secondaria

27 AID e mutazione ipersomatica Mutazione ipersomatica: iniziata dall enzima AID (Activation-induced cytidine deaminase), espressa solo nelle cellule B (e non T) attivate Malattia da deficit di enzima: I malati producono solo IgM e non aumentano tramite mutazione ipersomatica l affinità delle Ig per l antigene AID agisce da citidina-deaminasi sul DNA Quando agisce nei segmenti variabili dei geni per le Ig, inizia la fase di mutazione ipersomatica Quando agisce nei segmenti di switch inizia lo switch di classe di Ig

28 L attività di AID AID induce lesioni del DNA il cui riparo porta alla risposta secondaria Il meccanismo di riparo utilizzato determina il tipo di evento ricombinativo Mutazioni -> mutazione ipersomatica ssdna break -> conversione genica dsdna break -> class switch

29 Conseguenze delle mutazioni ipersomatiche Le cellule B attivate sono indotte da cellule T Mutazione ipersomatica avviene nei centri germinativi Centri germinativi: competizione di cloni di cellule B Le mutazioni ipersomatiche distruttive portano all eliminazione della cellula B corrispondente Le mutazioni ipersomatiche che migliorano l affinità dell Ab per l antigene sono selezionate Maturazione dell anticorpo

30 Maturazione anticorpale e clustering delle mutazioni nelle CDR

31 Che cosa succede nelle cellule T? La diversità nei TCR è generata durante il riarrangiamento genico Non avviene mutazione ipersomatica Probabilmente la mutazione ipersomatica è stata selezionata nelle cellule B per permettere la produzione di anticorpi secreti ad altissima affinità, mentre le cellule T non secernendo anticorpi hanno sufficiente diversità/affinità senza ricorrere alla mutazione ipersomatica

32 Class switch Le cellule B esprimono IgM ed IgD Dopo che sono state attivate dall antigene, avviene lo switch di classe

33 La presenza di sequenze ripetute fiancheggianti regola lo switch di classe

34 Lo switch di classe Switch da catena mu a catena epsilon Rilevanza di trascrizione per generare aree di ssdna che fungono da substrati per le varie attività enzimatiche Formazione di ssdna break e poi di dsdna break Attivazione della machinery di riparo del DNA, che congiungono le due regioni switch ed eliminano il DNA che si frappone ad esse