Cosa determina l assorbanza di un cromoforo?

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1 Cosa determina l assorbanza di un cromoforo? I cromofori sono di solito caratterizzati da doppi legami e sistemi di risonanza Lo spettro di assorbimento di un cromoforo è solo parzialmente determinato dalla sua natura chimica L ambiente del cromoforo influenza le proprietà dello spettro - ph - polarità del solvente - effetti di orientamento I cromofori possono agire da molecole reporter che possono dare informazioni circa il loro ambiente. Effetti di protonazione/deprotonazione dovuti a cambiamenti di ph o effetti di ossidazione/riduzione influenzano la distribuzione elettronica dei cromofori Polarità del solvente. Gli spettri cambiano in differenti solventi. Effetti di orientamento derivano da molecole di cromofori vicini. Ad es. ipercromia degli acidi nucleici.

2 Spettri di assorbimento degli acidi nucleici

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4 Melting del DNA: Assorbanza relativa a 260 nm Basi libere 1.67 DNA singolo filamento 1.37 DNA doppio filamento 1.00

5 Denaturazione del DNA È possibile seguire la denaturazione del DNA a 260 nm. Basi accoppiate e impilate assorbono meno nell UV di quelle separate - effetto ipercromico. La temperatura corrispondente a metà dell aumento osservato nell A 260 è definita come temperatura di melting, T m o temperatura di fusione del DNA. Il valore di T m varia con il rapporto GC/AT - un maggior contenuto di GC conduce ad una T m più alta. Una maggior forza ionica fa aumentare T m, limitando la repulsione elettrostatica tra fosfati

6 Denaturazione del DNA

7 Tm: dipendenza dalla composizione

8 Il valore di densità ottica a 260 nm è usata per calcolare la quantità di acidi nucleici in un campione. Si sa che 50 mg/ml di un dsdna in 1 cm di cammino ottico mostrano una A 260 = 1 facendo la proporzione otterremo la concentrazione del nostro campione incognito con una assorbanza pari ad AX 260 : X mg/ml DNA: AX 260 = 50 mg/ml= 1 X mg/ml DNA= AX 260 x 50 mg/ml Mentre per l RNA 40 mg/ml in 1 cm di cammino ottico mostrano una A 260 = 1 X mg/ml DNA o RNA= AX 260 x 40 mg/ml

9 Ma acidi nucleici e proteine assorbono entrambi nell UV

10 A260/A280 per misurare la contaminazione proteica Preparazioni pure di DNA hanno un rapporto A260/A280 di circa 1.8 Se inferiore ci può essere contaminante proteica o da solventi organici quali il fenolo Preparazioni pure di RNA hanno un rapporto A260/A280 di circa 2 A260/A230 per misurare la contaminazione da altre sostanze Preparazioni pure di DNA hanno un rapporto A260/A230 fra 1.5 e 1.8 Se inferiore ci può essere contaminante da fenolo, guanidina, carboidrati,

11 Determinazione della concentrazione di una proteina purificata: La legge di Lambert e Beer A = e l cl A = assorbanza alla lunghezza d onda l e l = coeff. di estinzione molare c = concentrazione molare l = lunghezza del cammino ottico (1 cm) c = A/e l

12 Determinazione della quantità di proteine in una miscela: 1. Assorbimento alla luce ultravioletta Principio: gli aminoacidi aromatici (tirosina e triptofano) hanno un massimo di assorbimento a l = 280 nm Svantaggi: Interferenze con acidi nucleici --> approssimatività Vantaggi : rapidità, possibilità di correzione Proteine (mg/ml) = 1.55 A A 260

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14 Determinazione della quantità di proteine in una miscela: 2. Saggi colorimetrici Numerose sostanze possono reagire quantitativamente con un'altra sostanza a formare un complesso colorato. Proteine + Colorante COMPLESSO COLORATO L assorbimento è proporzionale alla quantità di colorante legato (e di conseguenza alla quantità di proteine)

15 Nei saggi colorometrici è fondamentale costruire una retta di taratura per dosare la quantità di proteina incognita Si misura l assorbanza del campione rispetto a quello di un bianco (tutti i reagenti tranne la sostanza che si vuole dosare) Si costruisce una retta di taratura riportando in grafico i valori di O.D. di quantità note della sostanza da misurare che hanno reagito con lo stesso reattivo per dare il complesso colorato (almeno 5 punti) Dalla retta di taratura si ricava la quantità della sostanza nella soluzione incognita

16 Principali metodi colorimetrici: a)metodo di Bradford (o del Blue Coomassie) a)metodo di Lowry c) Metodo del Biureto d) Metodo dell Acido Bicinconinico (BCA)

17 Determinazione della quantità di proteina: 2a. Metodo di Bradford Principio: colorazione con Coomassie Brilliant Blue primariamente Arg, Lys e His, ma anche Trp, Tyr. A 595 Svantaggi: dipende dal contenuto di aminoacidi che si legano al Coomassie della singola proteina - difficoltà di standardizzazione Vantaggi: rapidità di esecuzione

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19 Determinazione per interpolazione grafica rispetto ad una curva standard (retta di taratura) A mg BSA

20 Retta di taratura La sensibilità è massima al picco di estinzione del cromoforo Il bianco deve contenere tutti i reagenti, tranne la sostanza da determinare Occorrono possibilmente cinque punti, misurati in doppio Non si deve estrapolare la curva oltre il valore più alto determinato

21 Determinazione della quantità di proteina: 2b. Metodo di Lowry Principio: miscela da saggiare viene portata in ambiente alcalino (ph ) e fatta reagire con citrato o tartrato di rame (II) (complessazione del rame da parte delle proteine). Si aggiunge la miscela di Folin-Ciocalteau, il cui componente attivo è rappresentato da una miscela di sodio molibdato, fosfato e tungstato, con formazione di complessi colorati (riduzione del reattivo da parte degli ioni rameici). Svantaggi : Interferenze con tamponi comuni (TRIS, HEPES, PIPES) e detergenti Vantaggi : riproducibilità rispetto allo standard

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23 Determinazione per interpolazione grafica rispetto ad una curva standard Sulla base dei seguenti dati sperimentali, ottenuti in un saggio con il metodo di Lowry, calcolare il valore della concentrazione (in mg/ml) del campione X A mg BSA 5 ml 10 ml 15 ml 20 ml 30 ml 40 ml 60 ml BSA 1 mg/ml Campione X diluito 1: