CHIMICA BIOLOGICA. Seconda Università degli Studi di Napoli. Prof. Augusto Parente. Lezione 7. DiSTABiF. Corso di Laurea in SCIENZE BIOLOGICHE

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1 Seconda Università degli Studi di Napoli DiSTABiF Corso di Laurea in SCIENZE BIOLOGICHE Insegnamento di CHIMICA BIOLOGICA Prof. Augusto Parente Anno Accademico Lezione 7

2 Mioglobina Emoglobina

3 po 2 = 1 Torr po 2 = 26 Torr Curve di saturazione

4 Prologo L'ossigeno è richiesto per il metabolismo aerobico e per la produzione di energia nelle delle cellule. L'ossigeno è l accettore finale di elettroni ottenuti all ossidazione dei substrati introdotti dall'alimentazione con guadagno netto di energia.

5 L ossigeno è poco solubile in acqua La sua diffusione è inefficiente se le distanze superano pochi millimetri

6 DOBBIAMO TRASPORTARE OSSIGENO Nessuna catena laterale amminoacidica è in grado di legare ossigeno reversibilmente

7 Possiamo utilizzare metalli (per esempio il ferro). Però il ferro libero provoca la formazione di specie dell ossigeno altamente reattive (tossiche). Quindi si utilizza nei vertebrati un gruppo prostetico che lega con legami di coordinazione il Fe(II) (ha la possibilità di farne 6!)

8 Ricordiamoci che il gruppo potfirinico è presente anche in citocromi e in enzimi che eliminano l acqua ossigenata. In tali caso il ferro passa normalmente da stato ferroso a ferrico.

9 Quando l eme isolato reagisce con l ossigeno, il ferro passa irreversibilmente dallo stato ferroso allo stato ferrico. Inoltre, forma dei dimeri in presenza di ossigeno

10 Per evitarlo dobbiamo utilizzare un impalcatura per l eme che impedisca sia l ossidazione del Fe +2 a Fe +3 sia la dimerizzazione dei gruppi eme; una struttura proteica. Ciò lo allontana anche dall acqua

11 La % di similitudine si rispecchia nella struttura tridimensionale; si nota in proteine omologhe anche con basse % di similitudine

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13 All inizio. proteina monomerica Alla fine. Mioglobina, nei muscoli Emoglobina, nel sangue

14 Pre e pro cordati Il tessuto ha pochi strati L ossigeno può diffondere attraverso i tessuti globina tipo mioglobina cioè monomerica

15 Vertebrati inferiori La dimensione dell organismo aumenta La complessità aumenta Una gobina monomerica non è più sufficiente La prima globina dimerica appare in Agnatha E un dimero, debolmente cooperativo Le prime catene alfa e beta appaiono nei pesci

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17 Cosa accadeva oltre a ciò? Si aveva lo sviluppo di tutte le attrezzature che erano indispensabili per far in modo che il processo di ossigenazione avesse con le massime prestazioni. Evoluzione dell apparato circolatorio.

18 Mioglobina Cuore e muscoli Funziona come riserva di ossigeno nei muscoli Singola catena 1 eme 8 alfa eliche, 153 amminoacidi Emoglobina Eritrociti, globuli rossi Riserva e trasporto di ossigeno dai polmoni ai capillari 4 catene (2 alfa e 2 beta) 4 eme Ogni catena è simile in sequenza e struttura alla mioglobina Le catene sono tenute insieme da interazioni non covalenti Struttura Myo Struttura tura Emog

19 MIOGLOBINA Cuore e muscoli Funziona come riserva di ossigeno nei muscoli Singola catena 1 eme 8 alfa eliche, 153 amminoacidi Proteina monomerica, presente nei muscoli (mios = muscolo) e nel cuore.

20 75% α elica Elica n. residui A 16 B 16 C 7 D 7 E1+E2 20 F 10 G 19 H 26 Totale 121

21 La struttura proteica interagisce con la porfirina IX tramite legami ionici e ad idrogeno tramite i gruppi propionici, oltre ad interazioni idrofobiche.

22 Il Fe(II) presenta la possibilità di 6 legami di coordinazione: quattro sono con i gruppi amminici della porfirina, uno con un istidina (chiamata prossimale) e l ultimo con l ossigeno (in linea con tale legame di coordinazione vi una seconda istidina chiamata distale). L altra cosa da ricordare per il seguito è che l atomo di ferro rispetto al piano dell eme eme è sposto verso l istidina prossimale.

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24 Ingrandimento di tale situazione che mette ben in evidenza le due istidine (ovviamente conservata in tutte le globine ). Prossimale Distale

25 LE INTERAZIONI CON I LIGANDI DIPENDONO DALLA STRUTTURA DELLA PROTEINA. L EME LEGA IL CO CIRCA VOLTE MEGLIO DELL OSSIGENO, NOI VOGLIAMO RIDURRE QUESTO RAPPORTO

26 Il fattore scende a circa 200 quando l eme è all interno della globina

27 Saturazione, siti con ligando sui siti totali Saturazione (θ) po 2 = 1 torr La cinetica di legame dell ossigeno alla mioglobina è una semplice curva di saturazione iperbolica. Tale curva è non cooperativa e non assomiglia alla curva della denaturazione delle proteine (curva sigmoide)

28 Come dovrebbe essere una proteina che trasporta ossigeno e lo cede alla mioglobina? A Proteina di trasporto efficiente nel legame ma inefficiente nel rilascio

29 B Proteina di trasporto efficiente nel rilascio ma inefficiente nel legame

30 C Proteina di trasporto efficiente sia nel legame che nel rilascio

31 Emoglobina La transizione tra gli stati di legame debole e forte spiega la curva sigmoide

32 Vi è cooperatività se vi è più di un unità unità Senza ossigeno, deossiemoglobina con ossigeno, ossiemoglobina

33 Interazioni dominanti tra le subunità di Hb Interazioni idrofobiche, 30 aa circa

34 po 2 = 1 Torr po 2 = 26 Torr Curva di saturazione dell emoglobina

35 Il significato della curva di legame sigmoidale dell'ossigeno Si può apprezzare il significato di questa curva riguardando il grafico. Mentre entrambe Hb e Mb sono saturate con O 2 alla pressione parziale di O 2 nei polmoni, solo l'emoglobina rilascerà significative quantità di O 2 nei tessuti. Infatti l'o 2 rilasciato da Hb può legarsi alla Mb nei i muscoli.

36 L emoglobina è una proteina molto più complessa del mioglobina; oltre a O 2, l emoglobina trasporta la CO 2 e H +. Inoltre 1. Il legame della prima molecola di O 2 all emoglobina favorisce il legame di altre molecole; 2. L affinità dell emoglobina per l ossigeno dipende dal ph e dalla CO 2. Sia la concentrazione di H + che la CO 2 promuovono il rilascio di O 2 3. L affinità dell emoglobina per l ossigeno è inoltre regolata da composti organici contenenti gruppi fosforici come il 2, 3-bisfosfoglicerato (BPG). Il risultato è che in presenza di tali composti l emoglobina presenta un affinità per l ossigeno più bassa.

37 L emoglobina è una proteina allosterica (dal greco allos, altro, e stereos, solido o forma). E una proteina in cui il legame di un ligando a un sito modifica le proprietà di un altro sito sulla stessa molecola proteica. In generale le proteine possono avere forme o conformazioni diverse indotte dal legame di ligandi chiamati anche modulatori. I modulatori di una proteina allosterica la convertono in una forma più o meno attive delle stessa proteina. I modulatori possono quindi avere effetti attivatori o inibitori

38 EFFETTO BOHR O 2 Hb + H + + CO 2 Negli alveoli polmonari Tessuti con attivo metabolismo Hb-H + -CO 2 + O 2 Effetto del ph sull affinità per l ossigeno. Abbassando il ph si provoca il rilascio di ossigeno dall ossiemoglobina.

39 Il rilascio di anidride carbonica da parte delle cellule abbassa l affinità dell emoglobina per l ossigeno in due modi: Una parte dell anidride carbonica si trasforma tramite l anidrasi carbonico in bicarbonato e rilascia H + CO 2 + H 2 O <> HCO 3- + H + Parte del bicarbonato è trasportato all esterno degli eritrociti, ma una parte reagisce direttamente con l emoglobina, legandosi agli amminogruppi N-terminali delle catene formando carbammati: -NH 2+ + HCO 3- <> -HNCOO - + H + + H 2 O Quindi di nuovo abbassiamo il ph e in più formiamo un legame salino tra catene α e β caratteristico dello stato deossi

40 L emoglobina lega composti con gruppi fosfato BPG ABBASSA L AFFINITÀ DI Hb PER L OSSIGENO Anfibi Tale composto si forma durante la glicolisi

41 Il BPG abbassa l affinità di Hb per l ossigeno

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43 Il tutto può essere spiegato considerando che l emoglobina presenta due stadi conformazionali. Lo stato T (Teso) Lo stato R (Rilassato) I cambi sono dovuti a variazioni di legami deboli tra le subunità

44 Lo stato Teso è cosi chiamato perché presenta un numero superiore di legami non covalenti (ionici ed ad idrogeno), che mantengono la conformazione intrappolata nello stato TESO Nello stato Rilassato alcuni di questi legami vanno persi, dopo l interazione con l ossigeno molecolare

45 Struttura Tesa Struttura Rilassata

46 Legami che stabilizzano la forma T His146 in beta Asp94 in alfa

47 COSA SUCCEDE A LIVELLO MOLECOLARE PER DARE ALL EMOGLOBINE QUESTE PROPRIETÀ Allosteriche?

48 L istidina prossimale è legata al Fe quindi si muoverà anch'essa causando un contemporaneo spostamento dell'elica F in cui si trova

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50 Residuo di Aspartico94 alfa (elica FG1) e Istidina146 beta (elica HC3)

51 Cominciano a saltare i legami deboli che stabilizzano la forma T (deossiemoglobina) Il ph c entra perché a ph più basso stabilizzo la His146 protonata (che può fare legame) Quindi un alta concentrazione di H + favorisce la forma deossi e quindi il rilascio dell ossigeno.

52 Questo movimento altera la struttura di ogni subunità che a loro volta cambiano le interazioni tra le subunità nell'interfaccia.

53 Il BPG stabilizza la forma deossi e quindi favorisce il rilascio di ossigeno

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55 Transizione T R Legame del BPG alla deossiemoglobina. Il legame del BPG Stabilizza lo stato T (a). La tasca del legame con BPG scompare in seguito ad ossigenazione, in seguito alla transizione T R. In montagna stato di acclimatamento

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58 (% di saturazione) Variazione della curva in presenza dei vari effettori

59 A causa del modo di impaccarsi delle subunità, una subunità non può passare da una conformazione ad un'altra senza far sì che anche l'altra cambi, anche se l'altra subunità non ha nessuna molecola di O 2 legata. Una volta avutosi il cambio di conformazione, l'affinità dei siti liberi per O 2 cresce poichè non ci sono blocchi sterici al legarsi dell'o 2.

60 Bassa affinità Alta affinità Modello MWC (concertato) Modello KNF (sequenziale)

61 Modello sequenziale Modello concertato Nessuno dei due modelli da una corretta interpretazione della curva dell emoglobina.

62 Nei polmoni Esempio dei 4 francobolli già libero per O 2

63 L anemia falciforme: la prima malattia molecolare

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67 Ingram 1956 Elettroforesi a ph 8,6 HbA HbS è più positiva µ= kc/m HbA + HbS Condizione clinica 1- Adulto normale; 2- Portatore del carattere 3- Anemia falciforme Origine

68 - + - Elettroforesi su carta da filtro + Cromatografia

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72 LE MUTAZIONI La sostituzione di un solo amminoacido (Glu Val) ha effetti 1- La sostituzione di un solo amminoacido ( ) ha effetti profondi sulla funzionalità della emoglobina; 2- Questa sostituzione a livello proteico è causata da una mutazione avvenuta a livello del DNA genomico: avvenuta a livello del DNA genomico: GAG GTG; 3- Le sostituzione possono anche migliorare una determinata funzione; 4- Il caso riportato è il risultato di un evento evolutivo naturale; 5- Oggi le mutazioni possono essere introdotte in maniera mirata. - Mutazione missense; - Mutazione nonsenso; - Mutazione della fase di lettura per delezione

73 Distribuzione del gene per Hb S e per il parassita della malaria. 73

74 Sono state ritrovate moltissime varianti di Hb A. Tali varianti riguardano sostituzioni di singoli residui che danno fenotipi normali. 74

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76 Nell emoglobina emoglobina fetale la catena β è sostituita da una catena γ,, che non ha His 143 ma una serina La catena γ ha meno affinità per BPG e quindi l emoglobina fetale ha un affinità maggiore per l ossigeno!!

77 Curve a confronto tra Hb A e Hb F in cui l unica differenza è un istidina! (His 143).

78 Lo spettro di assorbimento può dare indicazioni sulla forma Deossi o Ossi dell emoglobina..

79 Saturazione (θ) (L) Per l ossigeno: θ= [O 2 ] / ([O 2 ] + K d ) = po 2 / (po 2 + po 50 po 50 è la pressione di O 2 quando la meta dei siti è occupata 50 )

80 P + L <-> L K a = [PL] / [P] [L] [PL] / [PL] = K a [L] Il rapporto tra proteina libera e legata è proporzionale alla concentrazione del ligando libero. θ = siti di legame occupati / siti di legame totali = [PL]/([PL] + [P]) [PL PL] [PL] + [P] K a [L] [P] K a [L] K a [L] [P] + [P] [ K a [L] + 1 [L] [L] + 1 / K a θ = [L] [L] + K d Questa è l equazione di un iperbole 1/K a = K d = costante di dissociazione

81 Il diagramma di Hill L'equazione di Hill descrive il legame di n molecole (emoglobina) di O 2 con un'equazione simile a quella precedente Una forma lineare è data da che può essere usata per stabilire la cooperatività del legame. n è il coefficiente di Hill

82 Il coefficiente di Hill è una misura della cooperatività del legame

83 (Per la Mb un simile grafico porta ad una linea retta con n=1,0) Per Hb si non ha una linea retta ma si distinguono invece tre parti: 1) a basse ed alte PO 2 il grafico ha una pendenza di 1. In queste condizioni si ha il legame o della prima molecola di O 2 (stato T) o dell'ultima (stato R). In queste condizioni Hb si comporta come se avesse un solo sito di legame; 2) per valori intermedi di PO 2 la pendenza è maggiore di 1. Questa è il campo della cinetica cooperativa. Il valore della pressione parziale di O 2 necessaria per saturare metà dell'emoglobina, P 50, ci dà il valore di n. Per Hb questo è circa 3,5. Il massimo valore possibile sarebbe 4, equivalente al numero delle subunità, ma il coefficiente di Hill è sempre inferiore al suo valore massimo.

84 Evoluzione Evoluzione molecolare