Identificazione dei microrganismi mediante tecniche di biologia molecolare Esercitazione n 3. Criteri di identificazione

Transcript

1 Identificazione dei microrganismi mediante tecniche di biologia molecolare Esercitazione n 3 Criteri di identificazione Tradizionale (fenotipo) Tecniche di biologia molecolare Il livello di risoluzione dei metodi di identificazione e classificazione 1

2 Rappresentazione schematica del DNA 1.Estrazione ed analisi del DNA 1.1 Estrazione organica: ottenimento di un DNA puro Prevede due parti: 1) lisi delle cellule e solubilizzazione del DNA a) solubilizzazione dei lipidi della cellula con tamponi contenenti SDS (sodiododecilsolfato tensioattivo) b) lisi della componente proteica mediante fenolo/cloroformio ed alcool isoamilico c) precipitazione del DNA mediante Etanolo 2) uso dei metodi enzimatici (proteinasi K, Rnasi) per rimuovere i contaminanti (proteine, RNA) che alterano la stabilità ed il grado di purezza del DNA 2

3 1.2 Estrazione rapida del DNA 1) Lavaggio delle cellule con tampone PBS 1X 2) rottura delle cellule per bollitura 1.3 Estrazione mediante Kit del commercio Utilizzo di resine a scambio ionico valide sia per l estrazione che per la purificazione del DNA ALLESTIMENTO DELLA PROVA DI ESTRAZIONE RAPIDA DEL DNA 1) porre 200 µl di tampone PBS 1x in una provetta eppendorf 2) prelevare con un ansa le colonie tipiche e stemperarle nel tampone PBS 1X 3) porre le provette nel termostato a 95 C per 15 4) centrifugare a rpm per 2 5) prelevare il surnatante e porlo in una nuova eppendorf 2.QUANTIFICAZIONE DEL DNA 1) mediante lettura spettrofotometrica o lettura fluorimetrica 2) mediante elettroforesi in gel 2.1 LETTURA SPETTROFOTOMETRICA O LETTURA FLUORIMETRICA Il DNA ha un massimo di assorbimento a 260 nm pertanto la concentrazione è determinata misurando l assorbanza a 260 nm del campione in esame contro il bianco. L assorbanza di 1 OD è equivalente a circa 50 µg/ml 3

4 Determinazione della purezza del DNA Per verificare il grado di purezza del DNA la lettura viene fatta anche a: 230 nm, 280 nm, 320 nm. L assorbanza a 230 nm riflette la contaminazione del campione dovuta a sostanze come carboidrati, fenoli, peptidi o composti aromatici. Nel caso di campioni puri il rapporto 260/230 dovrebbe essere circa 2.2 L assorbanza a 280 nm riflette la presenza di residui proteici nel campione in esame, le proteine assorbono a 280 nm. Nel caso di campioni puri il rapporto 260/280 dovrebbe essere maggiore o uguale a 1,8. La torb idità o anche le differenze tra cuvetta e cuvetta possono essere corrette a una lunghezza d onda di 320 nm. Allestimento della prova di lettura su spettrofotometro Utilizzo delle microcuvette da 100 l 1) porre 100 µl di acqua sterile in una microcuvetta (bianco) 2)diluire il campione 1:10 in acqua sterile (campione in esame) prima di porlo in una seconda microcuvetta 3)caricare le microcuvette sullo spettrofotometro e leggere a A 260 nm. 1 O.D. DNA = 50 g /ml g /ml = OD* dil:0,020. 1/ ELETTROFORESI DEL DNA Gli acidi nucleici possiedono normalmente una carica negativa e quindi posti in un campo elettrico migrano verso il polo positivo. Il supporto che normalmente si usa per lo studio degli acidi nucleici è rappresentato da un gel d agarosio nel caso di un elettroforesi orizzontale. Tale supporto viene messo all interno di una camera elettroforetica con un tampone in grado di permettere la conduzione della corrente. L agarosio è un polimero derivato dal galattosio che si presenta in polvere ed ha la capacità, una volta disciolto in acqua di polimerizzare formando un reticolo. 4

5 L elettroforesi in gel d agarosio permette di rilevare frammenti con un intervallo di lunghezza compreso tra le 100bp e 20 Kb. Molecole di dimensioni diverse, ma di uguale carica migrano con velocità diverse, perchè le molecole di dimensioni maggiori incontrano maggior resistenza tra le maglie del gel. E così possibile visualizzare il DNA facendolo migrare all interno di un supporto solido (gel) colorandolo con un colorante (bromuro di etidio) che si intercala tra le basi azotate del DNA ed emette fluorescenza di colore arancione quando colpito da un raggio UV ( 360 nm). L intensità della luminosità delle bande è proporzionale alla quantità di DNA presente. Accanto al campione da valutare si carica, in uno dei pozzetti del gel, un DNA a peso molecolare noto (ladder o marker) che serve da confronto con il DNA esaminato. Allestimento della prova Preparazione del gel d agarosio alla concentrazione dello 1%: pesare 1 g di agarosio, sciogliere l agarosio in 100 ml di tampone (TAE 1X o TBE 1X) e portare a temperatura di ebollizione per alcuni minuti. Aggiungere 5 µl di bromuro di etidio e versare l agarosio in apposita vaschetta per farlo solidificare. Il DNA, mescolato ad un indicatore di corsa (colorante che permette di visualizzare la corsa ed aumenta la densità della soluzione del DNA da inserire nel pozzetto), viene caricato all interno dei pozzetti del gel. La cella elettroforetica viene poi collegata ad un alimentatore che crea la differenza di potenziale. 3.PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) La reazione a catena della polimerasi consente di amplificare uno o più tratti di genoma opportunamente individuati che vanno poi identificati mediante ulteriori indagini quali l analisi elettroforetica vedi paragrafo 2.2. I componenti base di una reazione PCR sono essenzialmente costituiti da: DNA da amplificare, Taq polimerasi enzima che favorisce la polimerizzazione, tampone costituito da Tris ph 8,5 KCl, Mg (fondamentale per il funzionamento della Taq polimerasi), una coppia di oligonucleotidi (primer) che definiscono il frammento genico da amplificare e dai quali ha inizio la fase di polimerizzazione, desossinucleotidi (dntp) utilizzati nella fase di polimerizzazione. 5

6 Scelta dei primer La PCR necessita almeno di due primer, uno forward (sinistro) e l altro reverse (destro) rispetto alla sequenza stampo. Primer forward ha lo stesso orientamento della catena superiore del DNA 5-3 Primer reverse è complementare e orientato al contrario rispetto alla catena stampo. -I primer devono essere specifici del frammento da amplificare -I primer devono avere una lunghezza di nucleotidi -I primer devono avere una sequenza target di 100 bp fino a 1000 bp -I primer devono avere da 10 fino a 12 G o C e Tm (temperatura di melting) di almeno 60 C Tm= 4X (numero di G+C) +2X(numero di A+T) 6

7 7

8 Locus= 16S ribosomal RNA identifica il genere Campylobacter Primer Forward: MDS16S1 5 ATCTAATGGCTTAACCATTAAAC 3 Primer Reverse: MD16 S2 5 GGACGGTAACTAGTTTAGTATTT 3 Identificano una sequenza di 857 bp per il genere Campylobacter ORIGIN 1 tttttatgga gagtttgatc ctggctcaga gtgaacgctg gcggcgtgcc taatacatgc 61 aagtcgaacg atgaagcttc tagcttgcta gaagtggatt agtggcgcac gggtgagtaa 121 ggtatagtta atctgcccta cacaagagga caacagttgg aaacgactgc taatactcta 181 tactcctgct taacacaagt tgagtaggga aagtttttcg gtgtaggatg agactatata 241 gtatcagcta gttggtaagg taatggctta ccaaggctat gacgcttaac tggtctgaga 301 ggatgatcag tcacactgga actgagacac ggtccagact cctacgggag gcagcagtag 361 ggaatattgc gcaatggggg aaaccctgac gcagcaacgc cgcgtggagg atgacacttt 421 tcggagcgta aactcctttt cttagggaag aattctgacg gtacctaagg aataagcacc 481 ggctaactcc gtgccagcag ccgcggtaat acggagggtg caagcgttac tcggaatcac 541 tgggcgtaaa gggcgcgtag gcggattatc aagtctcttg tgaaatctaa tggcttaacc 601 attaaactgc ttgggaaact gatagtctag agtgagggag aggcagatgg aattggtggt 661 gtaggggtaa aatccgtaga tatcaccaag aatacccatt gcgaaggcga tctgctggaa 721 ctcaactgac gctaaggcgc gaaagcgtgg ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt 781 ccacgcccta aacgatgtac actagttgtt ggggtgctag tcatctcagt aatgcagcta 841 acgcattaag tgtaccgcct ggggagtacg gtcgcaagat taaaactcaa aggaatagac 901 ggggacccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga agatacgcga agaaccttac 961 ctgggcttga tatcctaaga accttttaga gataagaggg tgctagcttg ctagaactta 1021 gagacaggtg ctgcacggct gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc 1081 aacgagcgca acccacgtat ttagttgcta acggttcggc cgagcactct aaatagactg 1141 ccttcgtaag gaggaggaag gtgtggacga cgtcaagtca tcatggccct tatgcccagg 1201 gcgacacacg tgctacaatg gcatatacaa tgagacgcaa taccgcgagg tggagcaaat 1261 ctataaaata tgtcccagtt cggattgttc tctgcaactc gagagcatga agccggaatc 1321 gctagtaatc gtagatcagc catgctacgg tgaatacgtt cccgggtctt gtactcaccg 1381 cccgtcacac catgggagtt gatttcactc gaagccggaa tactaaacta gttaccgtcc 1441 acagtggaat cagcgactgg ggtgaagtcg taacaaggta accgtaggag aacctgcggt 1501 tggatcacct cct Per scaricare le sequenze accedi al sito:

9 ALLESTIMENTO DELLA PROVA Grandezza frammento amplificato in bp: 857 per C. spp 589 per C. jejuni 462 per C. coli N campione provetta Esito Mix amplificazione Buffer 10 x MgCl 2 25 mm dntp 10 mm 16 S1 10µM 16 S2 10µM MDmap A1 10µM MDmap A2 10µM MDCOL2 10µM MDCOL 3 10µM H 2 0 TAQ 5U DNA µl x1 campione , µl totali

10 Ordine di caricamento del gel di agarosio 1,5%