Passaggi preliminari di purificazione

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1 Passaggi preliminari di purificazione Estratto iniziale Omogenato contiene materiale insolubile che generalmente viene eliminato per centrifugazione. Talvolta la soluzione mostra torbidità (dovuta alla presenza di organuli, frammenti membrane, etc.) che vengono eliminati per ultracentrifugazione o trattamento con agenti capaci di causarne la precipitazione L estratto oltre alle proteine contiene DNA, RNA, carboidrati e lipidi (e metaboliti a basso peso molecolare). Può essere utile utilizzare DNasi I, RNasi A o agenti capaci di causare la precipitazione selettiva degli acidi nucleici (ad es. protamina solfato) seguita da centrifugazione.

2 densità solubilità Estrazione Centrifugazione Ripartizione Precipitazione Analitica Isopicnica Gradiente peso molecolare Elettroforesi Agarosio Acrilam. Cellulosa Denaturante Non denatur. carica elettrica struttura molecolare Cromatografia Spettroscopia Scambio ionico, Affinità, Gel filtrazione UV/vis Fluorescenza Luminescenza MNR, ESR Cristallografia X Mass spec

3 PRINCIPI DELLA CENTRIFUGAZIONE Una particella sottoposta ad un campo centrifugo tende a sedimentare

4 La velocità di sedimentazione di una particella dipende dal campo centrifugo G applicato radialmente verso l esterno, che è funzione del quadrato della velocità angolare (, in rad s -1 ) e della distanza r dal centro di rotazione (cm) G = 2 r = 2p rpm/60 rpm (rounds per minute_rivoluzioni al minuto) G = 4p 2 (rpm) 2 r/3600

5 G = 4p 2 (rpm) 2 r/3600 campo centrifugo relativo (RCF) RCF = 4p2 (rpm) 2 r 3600 x 980 RCF =1.118 x 10-5 (rpm) 2 r r = 10 cm rpm = esempio RCF ~ g

6 coefficiente di sedimentazione (s) La velocità di sedimentazione di una particella in soluzione dipende da: dimensioni e densità della particella (raggio e massa) densità e viscosità del mezzo forma v = 2r p2 (r p r m ) 2 r v = s 2 r 9 r p = raggio particella r p = densità particella r m = densità mezzo = viscosità mezzo

7 Il coefficiente di sedimentazione (s) esprime la tendenza di una particella a sedimentare. Dipende da dimensione e forma della particella e dalle caratteristiche del mezzo (concentrazione, coeff. frizionale, dalla temperatura,...) e si esprime in secondi. In condizioni standard (H 2 O a 20 C) il coefficiente di sedimentazione standard (s 20,w ) è espresso in S = Svedberg (1 unità=10-13 secondi)

8 Le tecniche centrifugative si possono suddividere in generale in: analitiche e preparative La centrifugazione analitica permette invece di studiare le caratteristiche di sedimentazione del campione e di determinarne il grado di purezza o la massa molecolare. La centrifugazione preparativa permette di separare e purificare cellule intere, organuli subcellulari e macromolecole biologiche, come acidi nucleici o proteine.

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10 Centrifuga Ultracentrifuga Centrifughe da banco

11 CENTRIFUGHE da banco VELOCITA' BASSA MEDIA ALTA ULTRA Velocità (rpm) Gravità (x g) Raffreddamento no alcune tutte tutte Vuoto no no alcune tutte

12 Diversi tipi di provette

13 Bisogna sempre bilanciare le provette, cioè il peso di due campioni in posizione diametralmente opposta devono essere identici. = peso = peso

14 E fondamentale bilanciare le provette!!!

15 G G rotore ad angolo fisso ideale per il pelletting (centrifugazione differenziale) rotore verticale ideale per la centrifugazione isopicnica G ideale per le separazioni isopicniche e zonali rotore oscillante (swing out)

16 Separazione di una sospensione di particelle in un liquido in due distinte fasi: sedimento (pellet) supernatante (sup) la velocità di sedimentazione dipende dalle dimensioni e dalla densità della particella; l efficienza del pelletting è proporzionale alla forza di gravità (RCF) applicata e al tempo di centrifugazione.

17 Centrifugazione differenziale (pelletting) La centrifugazione differenziale si basa sulla diversa velocità di sedimentazione di particelle tra loro diverse per densità e dimensioni; la centrifugazione porterà inizialmente alla sedimentazione delle particelle di maggiori dimensioni. Se le particelle hanno la stessa massa ma densità diversa, quelle con densità maggiore sedimenteranno più rapidamente di quelle meno dense.

18 PELLETTING: Es. proteina di membrana fusa ad un fluoroforo rosso (Cherry)

19 Centrifugazione differenziale

20 Centrifugazione in gradiente di densità_1 ZONALE (a BANDA) Si ultilizza per separare partcelle di densità simile ma di massa diversa. Si fa pre-formare un gradiente di densità (es. con saccarosio) che può essere: discontinuo continuo Si stratifica il campione da centrifugare sopra la miscela e durante la centrifugazione le proteine si muoveranno attraverso il gradiente e si separeranno secondo i loro coefficienti di sedimentazione.

21 formatore di gradienti

22 Centrifugazione in gradiente di densità_2 ISOPICNICA Si utilizza per separare le particelle in base alla loro densità. Il gradiente si forma durante la centrifugazione stessa e le particelle si fermeranno in quella zona del gradiente che corrisponde alla loro densità. E una centrifugazione all equilibrio v = 2r p2 (r p r m ) 2 r 9 Il gradiente viene allestito utilizzando una soluzione la cui densità massima è maggiore di quella di tutte le particelle da separare

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25 Centrifugazione isopicnica: Es. DNA in gradiente CsCl con Etidio bromuro 13 C mix 12 C 12 C-DNA 13 C-DNA 1cm

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27 Applicazioni della centrifugazione: 1_DIALISI La dialisi è un procedimento fisico con cui si separano una o più sostanze disciolte in un liquido, utilizzando una membrana semipermeabile che permette il passaggio di tali sostanze in una sola direzione. Il moto delle sostanze è dovuto essenzialmente alla differenza di concentrazione (gradiente) di tale sostanza tra i soluti nei due comparti diffusione e cessa una volta giunti all'equilibrio.

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29 Il principio della dialisi si può applicare anche mediante centrifugazione tecniche di ultrafiltrazione Camera superiore Setto poroso semipermeabile Serbatoio

30 Applicazioni della centrifugazione: 2_Frazionamento di proteine per SALTING OUT Ogni proteina, in dipendenza dalle sue caratteristiche strutturali, possiede una solubilità dipendente dal solvente utilizzato (acqua, solventi organici), dal ph e dalle condizioni di forza ionica.

31 Principio del salting out : 1. Gli ioni di sale aggiunto competono con gli ioni presenti nella soluzione per le molecole di solvente, facilitando l aggregazione proteica; 2. Proteine diverse precipitano a diverse concentrazioni di sale.

32 [(NH 4 ) 2 SO 4 ] Ammonio solfato è il reagente comunemente usato per il salting out perchè : ha elevata solubilità in acqua, permettendo di ottenere soluzioni ad alta forza ionica; il ph della soluzione può essere variato, portandolo vicino al pi della proteina da purificare.

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34 Applicazioni della centrifugazione: 3_Ripartizione per solubilità in solventi organici