Analisi cromatografiche (HPLC) L impiego di acqua ultrapura con ridotti livelli di TOC appena prodotta migliora le prestazioni cromatografiche
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- Gianfranco Rocchi
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1 Analisi cromatografiche (HPLC) L impiego di acqua ultrapura con ridotti livelli di TOC appena prodotta migliora le prestazioni cromatografiche Nelle analisi di cromatografia liquida ad elevate prestazioni (HPLC), la qualità dei risultati è influenzata dalla purezza dei solventi utilizzati nella fase mobile. Nel presente studio sono state confrontate acqua in bottiglia a grado HPLC reperibile sul mercato senza alcuna specifica per quanto riguarda il carbonio ossidabile totale (TOC) e acqua ultrapura appena prodotta con un tenore di TOC pari o inferiore a 5 ppb. I cromatogrammi HPLC ottenuti dopo preconcentrazione dell acqua suggeriscono che alcune acque in bottiglia a grado HPLC contengono soluti organici in quantità di gran lunga superiore rispetto all acqua ultrapura appena prodotta e che questi contaminanti possono contribuire alla variabilità della linea di base ed alla mediocrità delle prestazioni cromatografiche. Il presente studio illustra anche in che modo la purezza organica dell acqua utilizzata come solvente per l eluizione in gradiente di una miscela di principi attivi farmaceutici incide sulle prestazioni cromatografiche nel tempo. I risultati evidenziano i benefici dell impiego di acqua ultrapura appena prodotta con livelli di TOC pari o inferiori a 5 ppb per la preparazione della fase mobile. Maricar Tarun, Coralie Monferran, Cecilia Devaux, Stéphane Mabic *Autore corrispondente: Stephane Mabic, Merck Millipore, Saint-Quentin-en-Yvelines, FRANCIA stephane.mabic@merckgroup.com Gli anni recenti hanno visto progressi e sviluppi straordinari per le tecniche analitiche. Di conseguenza, gli strumenti sono diventati sempre più sensibili e richiedono, un maggiore livello qualitativo per reagenti e solventi, acqua inclusa. Nell HPLC, l importanza della qualità dell acqua diventa più evidente nelle eluizioni a gradiente su colonne in fase inversa, perché esse richiedono l equilibrazione con diversi volumi colonna dell eluente acquoso. I contaminanti organici del solvente acquoso tendono a venire adsorbiti in testa alla colonna e ad essere eluiti, generando picchi, nelle successive corse in gradiente. Esistono diverse fasi stazionarie per HPLC, ma l HPLC in fase inversa è la modalità di separazione più comunemente utilizzata (1). Essa presenta alcune esigenze che, se non soddisfatte, potrebbero compromettere la qualità dei risultati, come la riduzione dei contaminanti a livelli minimi, se non nulli. La contaminazione può essere dovuta a diversi componenti non eluenti della fase mobile, al campione o alla vetreria utilizzata. Inoltre, possono essere causa di contaminazione l ordinario deterioramento del sistema o persino le sostanze dell ambiente circostante che potrebbero trovare una via di accesso (2, 3, 4, 5, 6, 7). Secondo McMaster, la maggior parte delle difficoltà che si incontrano in HPLC sono dovute a problemi di contaminazione della colonna, la cui causa è spesso l acqua contaminata (8). In seguito a tale contaminazione, la linea di base può essere caratterizzata da picchi spuri, gobbe e avvallamenti (5, 6, 7, 9, 10). Gli esperti di cromatografia solitamente utilizzano solventi a grado HPLC che vengono filtrati e degassati prima dell uso. Spesso, tuttavia, non si prende in considerazione un dettaglio: il fatto che l acqua in bottiglia a grado HPLC può contenere anche diverse migliaia di µg/l (parti per miliardo [ppb]) di carbonio ossidabile totale (TOC). Il TOC è una misura di tutte le specie organiche presenti nell acqua (11). 24 LAB IL MONDO
2 IL MONDO Al fine di studiare l influenza di tale contaminazione organica sulle analisi HPLC, abbiamo condotto due serie di esperimenti. La prima consisteva nella preconcentrazione del solvente acquoso (acqua) su una colonna da preconcentrazione, seguita dall eluizione in gradiente su una colonna analitica. Nella seconda serie di esperimenti, utilizzavamo l eluizione a gradiente per separare i diversi componenti di una miscela di principi attivi farmaceutici. Tale miscela veniva iniettata ripetutamente per volte, al fine di esaminare gli effetti a lungo termine dell impiego come eluente acquoso di acqua in bottiglia a grado HPLC o di acqua ultrapura preparata poco prima dell analisi. Materiali e metodi Materiali e reagenti - Per il confronto delle linee di base, venivano comparati due tipi d acqua con origine diversa: un acqua ultrapura appena purificata da un sistema Milli-Q (Merck Millipore, Billerica, MA, USA) e un acqua in bottiglia a grado HPLC. Nel secondo esperimento, si preparava una miscela contenente 0,200 µg/ml di standard cromatografici di principi attivi farmaceutici. Gli standard erano stati acquistati da Alltech (Deerfield, Il, USA) sotto forma di soluzioni in metanolo alla concentrazione di 1 mg/ml (paracetamolo, acetazolamide, carbamazepina, fenobarbital, fenitoina, nabumetone, secobarbital). Le fasi mobili erano acqua ed acetonitrile preparate fresche ogni giorno. Si utilizzavano due fonti d acqua: acqua a grado HPLC Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, U.S.A.) e acqua ultrapura appena prodotta da un sistema Milli-Q Advantage A10 (Merck Millipore, Billerica, MA, U.S.A.) completo di lampada UV, al mercurio a bassa pressione, emittente a doppia lunghezza d onda (185 nm e 254 nm). Il sistema Milli-Q includeva anche un dispositivo A10 integrato per il monitoraggio in linea del TOC, cartucce Q-Gard T1 per il pretrattamento e Quantum TEX per il trattamento finale, cui faceva seguito un filtro finale da 0,22 μm. La resistività dell acqua appena prodotta era di 18,2 MW.cm (misurata in linea e compensata a 25 C). Al sistema Milli-Q Advantage l acqua d alimentazione veniva fornita da un sistema Elix che operava un primo trattamento dell acqua combinando osmosi inversa ed elettrodeionizzazione. L acetonitrile era di grado HPLC. Prima dell impiego, le fasi mobili venivano sonicate. Sistemi cromatografici - Per il confronto delle linee di base, il sistema HPLC utilizzato era un cromatografo Waters Alliance 2695 con rivelatore a serie di fotodiodi modello Milli-Q Integral System Milli-Q Advantage Il sistema HPLC impiegato per le iniezioni ripetute della miscela di principi attivi farmaceutici era una pompa per HPLC 510 Waters (Waters Corp., Milford, MA, U.S.A.) con autocampionatore 717 plus e rivelatore a serie di fotodiodi 996 impostato a nm. Si utilizzavano colonne RP18 SymmetryShield (4.6 x 150 mm, 3,5 µm) Waters. Procedura - Per il confronto delle linee di base, l acqua veniva prima preconcentrata su una colonna C18 XTERRA (4,6 x 30 mm, 3 µm) per 60 min. a 1 ml/min, scartando l eluato. Dopo la preconcentrazione, alla colonna XTERRA veniva connessa una colonna C18 Atlantis (2,1 x 150 mm, 3 µm) e si utilizzava il seguente gradiente per eluire eventuali Sistema Elix Advantage molecole organiche adsorbite sulla colonna XTerra : acqua da 100% a 0% in 30 min, per 10 min. acqua allo 0%. La velocità del flusso era di 0,25 ml/min. Per lo studio sul lungo termine, si utilizzavano unità filtranti Millex -LCR (Merck Millipore) (0,45 µm, 13 mm) per filtrare la miscela di principi attivi, prima di iniettarne campioni di 25 µl. Per separare i componenti della miscela, si ricorreva al seguente gradiente: acqua da 80% a 30% in 15 min, da 30% a 80% in 1 min, quindi acqua all 80% per 4 min. La velocità del flusso era di 1 ml/min. Per studiare gli effetti dei due tipi d acqua della fase mobile si utilizzavano due diverse colonne, identiche tra loro. LAB 25
3 Analisi cromatografiche (HPLC) Figura 1: Cromatogrammi a 254 nm (a) e 214 nm (b) di acqua in bottiglia a grado HPLC e di acqua ultrapura appena prodotta, dopo preconcentrazione. La seconda genera linee di base più pulite. Si noti la differenza di scala tra (a) e (b). Risultati e discussione Confronto della linea di base ottenuta con l acqua a grado HPLC e con l acqua ultrapura a ridotto livello di TOC Nella prima serie di esperimenti, si ipotizzava che durante l ora della fase di preconcentrazione, ogni contaminante organico presente nell acqua venisse adsorbito in testa alla colonna, per venire poi eluito fuori dalla colonna nel corso dell eluizione, generando picchi nel cromatogramma. Purification Pack La Figura 1 mostra il maggiore livello di contaminazione organica nell acqua in bottiglia a grado HPLC. Entrambe le Figure 1a (a 254 nm) e 1b (a 214 nm) mostrano che l acqua in bottiglia a grado HPLC generava un maggior numero di picchi, alcuni dei quali fino a 15 volte più intensi di quelli prodotti dalla preconcentrazione dell acqua ultrapura fresca. Filtro LCR Effetti a lungo termine dell acqua in bottiglia a grado HPLC e dell acqua ultrapura a ridotto tenore di TOC nella fase mobile - Per la seconda serie di esperimenti, le Figure 2 (254 nm) e 3 (214 nm) mostrano i cromatogrammi corrispondenti alle iniezioni 50, 290, 530, 770, 1010 e Si può notare una differenza significativa nella deriva della linea di base. Sebbene nell eluizione a gradiente ci si attendesse una deriva della linea di base, specialmente alle basse lunghezze d onda, l ampiezza e la variabilità della deriva osservata utilizzando acqua in bottiglia a grado HPLC (Figura 2a) fa pensare che nel tempo i contaminanti si siano accumulati nella colonna. Per contro, utilizzando acqua pura da poco prodotta (Figura 2b), non si osservava uno scostamento così variabile della linea di base. Un altra differenza tra le due tipologie di acqua è la comparsa di picchi estranei quando si utilizzava acqua in bottiglia a grado HPLC, un ulteriore indicazione di contaminazione organica della fase mobile acquosa. La presenza di picchi estranei in un cromatogramma è grave nel caso si stiano analizzando campioni contenenti sostanze sconosciute. Il(I) picco(i) estraneo(i) potrebbe(ro) essere confuso(i) con un(dei) componente(i) del campione, oppure coeluire con un(degli) analita(i), generando problemi nella quantificazione. 26 LAB IL MONDO
4 IL MONDO Quando si utilizzava acqua a grado HPLC, cominciavano ad apparire picchi estranei sia nei cromatogrammi a 254 nm (a ~5 min. per l iniezione 770) che a 214 nm (a ~15 min. per l iniezione 530), come mostrano le Figure 2a e 3a. L area sottesa dal picco con tempo di ritenzione ~5 min. in Figura 2a è più del triplo rispetto a quella del fenobarbital (picco 3) e più del doppio di quella della fenitoina (picco 5). Prima di ogni iniezione in HPLC a gradiente, la colonna deve essere equilibrata nelle condizioni iniziali. Solitamente ciò richiede da 5 a 10 volumi colonna della fase mobile iniziale (12), che corrispondono ad almeno due ordini di grandezza superiori rispetto al volume di iniezione del campione(9 ). Nell esperimento descritto, il volume di equilibrazione corrisponde a 200 volte il volume del campione iniettato. In seguito ad una equilibrazione così estesa, non è pertanto sorprendente che i contaminanti contenuti in tracce nella fase mobile acquosa possano causare interferenze significative nei cromatogrammi. Se l analisi HPLC è utilizzata per l identificazione dei picchi e/o la quantificazione di analiti presenti in piccole quantità, picchi indesiderati nel rumore di fondo dovuti a una contaminazione della fase mobile possono ridurre l accuratezza, la precisione e/o la sensibilità del metodo, compromettendo l identificazione o la quantificazione dei picchi. Nel peggiore dei casi, i cromatogrammi possono essere assolutamente non interpretabili a causa della rumorosità della linea di base e della presenza di picchi estranei. Il risultato di entrambi gli esperimenti suggerisce che l acqua ultrapura appena prodotta è una fonte eccellente per la preparazione delle fasi mobili per HPLC. In questo tipo d acqua, il livello di contaminazione organica è mantenuto a livelli minimi ( 5 ppb) e monitorato utilizzando un dispositivo per la misura del TOC in linea. Di contro, i livelli di contaminazione organica nell acqua in bottiglia possono variare in modo significativo tra un produttore e l altro, con alcune delle bottiglie testate contenenti livelli di TOC addirittura pari a 777 ppb (1, 12). Questa variabilità può essere spiegata da diversi fattori: le tecnologie utilizzate per preparare l acqua, le condizioni del laboratorio o del sito produttivo durante l imbottigliamento ed il confezionamento, i materiali di fabbricazione scelti per la bottiglia ed il tappo e il tempo di stoccaggio della bottiglia prima dell impiego. Figura 2: Cromatogrammi (254 nm) di una miscela di principi attivi con eluente acquoso costituito da acqua in bottiglia a grado HPLC (a) e acqua ultrapura da poco prodotta (b). L eluente organico era acetonitrile a grado HPLC. Picchi: 1: paracetamolo, 2: acetazolamide, 3: fenobarbital, 4: carbamazepina, 5: fenitoina, 6: secobarbital, 7: nabumetone. Figura 3: Cromatogrammi (214 nm) di una miscela di principi attivi con eluente acquoso costituito da acqua in bottiglia a grado HPLC (a) e acqua ultrapura da poco prodotta (b). L eluente organico era acetonitrile a grado HPLC. Picchi: 1: paracetamolo, 2: acetazolamide, 3: fenobarbital, 4: carbamazepina, 5: fenitoina, 6: secobarbital, 7: nabumetone. LAB 27
5 Analisi cromatografiche (HPLC) Produzione di acqua ultrapura a ridotto tenore di TOC - Nell acqua ultrapura, il tenore costantemente ridotto del TOC deriva dalla combinazione di diverse tecnologie di purificazione tra loro complementari. L osmosi inversa elimina dall 80 al 90% del carico organico in ingresso ed è seguita dall elettrodeionizzazione che rimuove efficientemente le specie cariche, cioè gli ioni organici ed inorganici. L elettrodeionizzazione è complementare all osmosi inversa per la rimozione dei contaminanti organici, perché elimina eventuali acidi ed ammine organiche di piccole dimensioni che potrebbero attraversare i pori delle membrane da RO. L adsorbimento dei contaminanti organici sul carbone attivo è un terzo metodo che contribuisce a ridurre la concentrazione organica dell acqua. Il quarto processo che riduce la concentrazione organica nell acqua è la fotossidazione UV. Questa tecnologia ossida le molecole per mezzo dei radicali ossidrile generati a partire dall acqua e dall ossigeno in seguito all irradiazione con una lampada UV a doppia lunghezza d onda (185/254 nm) (13). La fotossidazione UV è generalmente utilizzata alla fine del processo di purificazione, una volta che il carico organico sia già stato ridotto tramite le altre tecniche sopra menzionate. La combinazione di tali tecniche consente di raggiungere livelli di contaminazione organica costantemente ridotti (TOC 5 ppb) nell acqua erogata dall unità di purificazione. Altre considerazioni per analisi HPLC ben riuscite - Se la qualità dell acqua utilizzata per preparare le fasi mobili per le analisi HPLC è di fondamentale importanza, un impiego appropriato ed un adeguata manutenzione del sistema e della colonna utilizzati, oltre all attuazione di idonee procedure per la preparazione dei campioni, sono altrettanto importanti per assicurarsi la buona riuscita degli esperimenti HPLC. È stato dimostrato che i contaminanti presenti in tracce nella fase mobile organica (acetonitrile, metanolo) ed i modificatori (come acido trifluoroacetico [TFA]) contribuiscono ai picchi del rumore di fondo (9). Se non si presta cura nella preparazione delle soluzioni che costituiscono la fase mobile (impiego di contenitori o tappi in plastica, pellicola in paraffina, guanti), si rischia di introdurvi ftalati ed altre specie che assorbono gli UV. Pertanto, non solo è importante disporre di una fonte affidabile di solventi ad elevata purezza, ma anche ricorrere a buone pratiche di laboratorio. Conclusione Questo studio ha dimostrato che l acqua ultrapura con ridotti livelli di TOC da poco prodotta è affidabile per la preparazione di fasi mobili per HPLC. Preconcentrando su una colonna C18 acqua in bottiglia a grado HPLC ed eluendola, quindi, in gradiente, si ottenevano diversi picchi. Tali picchi non erano presenti utilizzando acqua ultrapura da poco prodotta, il che conferma che la prima dei due tipi di acqua contiene contaminanti organici a livelli di gran lunga superiori rispetto alla seconda. Nell HPLC a fase inversa, una tipica eluizione in gradiente richiede l equilibrazione della colonna nelle condizioni iniziali con diversi volumi colonna del solvente debole (acquoso). I contaminanti organici del solvente acquoso vengono adsorbiti in testa alla colonna e causano interferenze nei successivi cromatogrammi, come deriva della linea di base e presenza di picchi estranei. Inoltre, quando si utilizzava acqua in bottiglia a grado HPLC come eluente acquoso per la separazione di una miscela di principi attivi, nel tempo si osservava un ampia deriva della linea di base e la presenza di picchi estranei. Tali fenomeni possono essere attribuiti alla presenza di contaminanti nell acqua. Utilizzando acqua ultrapura da poco prodotta, essi non si manifestavano. Per concludere, questo studio ha dimostrato che l acqua ultrapura con livelli di TOC costantemente ridotti appena prodotta genera linee di base più costanti e minimizza il rischio della presenza di picchi estranei. Riferimenti bibliografici 1. R.E. Majors, LCGC Europe 25, 31 (2012). 2. A.-M. Hesse, et al., J Chrom A (2008), doi: /j.chrom A G.R. Strasser, I Váradi, J Chrom A 869, 85 (2000). 4. Y. Egi, A. Ueyanagi, LCGC Int. 11, 142 (1998). 5. J.W. Dolan, LCGC Int. 11, 642 (1998). 6. M.D. Nelson, J.W. Dolan, LCGC Int. 11, (1998). 7. M. Oehme, et al., Trends Anal Chem 21, (2002). 8. M.C. McMaster, LC/MS: A Practical User s Guide. (John Wiley & Sons, New Jersey, 2005). 9. M.C. Ringo, J.R. Allen, D.M. Mattocks, LCGC North America 21, 168 (2003). 10. A. Mihailova, A. Lundanes, T. Greibrokk, J Sep Science 29, 576 (2006). 11. B.M. Stewart and B.L. Williamson, Am Biotechnol Lab, 19, 16 (2001). 12. Lloyd R. Snyder, Joseph J. Kirkland, Joseph L. Glajch. Practical HPLC Method Development, 2nd Ed (E-Book) C. Regnault, I Kano, D. Darbouret, S. Mabic. J Chrom. A, 1030, 289 (2004). Per maggiori informazioni, si prega di visitare il nostro sito web alla pagina Millex, Milli-Q, A10, Q-Gard, Quantum ed Elix sono marchi registrati e Merck Millipore e il logo M sono marchi di fabbrica di Merck KGaA, Darmstadt, Germania. Waters Alliance, xterra e Atlantis sono marchi registrati e SymmetryShield è un marchio di fabbrica di Waters Corporation. Copyright 2014 EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, U.S.A. Tutti i diritti sono riservati. 28 LAB IL MONDO
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