UTILIZZO DEI SISTEMI HPLC

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1 Pag. 1 di 16 UTILIZZO DEI SISTEMI HPLC INDICE: 1. Premessa 2. Scopo e campo di applicazione 3. Documenti di riferimento 4. Definizioni 5. Responsabilità 6. Procedura 7. Allegato 1- Sistemi in dotazione 8. Allegato 2- Sistema Shimadzu 9. Allegato 3- Sistema Merck DISTRIBUITA A: Prof. Franco Dosio Responsabili del laboratorio Studenti frequentanti il laboratorio 0 31 maggio 2001 Prima stesura Lucia Infante REV. DATA DESCRIZIONE PREPARATO DA APPROVATO DA

2 Pag. 2 di PREMESSA Gli specializzandi e gli studenti che frequentano il laboratorio di farmacocinetica si occupano di monitoraggi plasmatici di farmaci antiblastici e della descrizione e del calcolo della farmacocinetica di questi. Vengono quindi continuamente messi a punto ed utilizzati metodi analitici HPLC per dosare i farmaci in questione nel plasma dei pazienti in studio. Gli operatori del laboratorio sono sottoposti ad un continuo turnover: ogni specializzando frequenta il laboratorio per un periodo di tempo che va dai 6 mesi all anno, mentre per gli studenti il periodo corrisponde all anno di tesi. Non essendoci mai state procedure scritte di utilizzo dei sistemi HPLC in dotazione al laboratorio, ma solo trasmissione verbale di conoscenze e competenze, ogni operatore utilizza e gestisce i sistemi in modo soggettivo. 2. SCOPO E CAMPO DI APPLICAZIONE La stesura di questa procedura nasce dalla necessità di assicurare un operatività standard sui sistemi HPLC in dotazione del laboratorio (v. allegato 1) in modo da garantirne sempre una buona qualità di utilizzo. In particolare viene descritta l operatività delle due principali componenti dei sistemi HPLC: unità di pompaggio detector Vengono inoltre descritti: i processi preparativi dei solventi e dei campioni la modalità di iniezione il lavaggio dell iniettore il lavaggio delle pompe

3 Pag. 3 di DOCUMENTI DI RIFERIMENTO Manuale A.F.I n La buona fabbricazione dei medicinali Guidance for Industry-Analytical Procedures and Methods Validation-U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER), Center for Biologics Evaluation and Research (CBER)-August 2000 Farmacopea Ufficiale-X edizione Manuali di istruzione degli strumenti in dotazione (v. allegati) Manuale stesura procedure AUSL Roma/C 5. DEFINIZIONI Procedura: insieme delle regole da seguire nell esecuzione di un attività. Ci permette di fare un analisi dello svolgimento delle singole operazioni evitando l intervento di elementi non noti e di standardizzare un processo in modo da ottenere risultati il più possibile riproducibili. 6. RESPONSABILITA Gli specializzandi hanno la responsabilità di stendere e revisionare le procedure. Inoltre sono responsabili dell applicazione e del controllo dell applicazione delle stesse. Gli studenti hanno la responsabilità di seguire le regole indicate dalle procedure.

4 Pag. 4 di PROCEDURA 5.1 SCHEMA DELLE FASI DI ATTIVITA La procedura operativa è l insieme delle operazioni che consentono il corretto utilizzo dei sistemi HPLC in dotazione (v. allegato 1) PO Preparazione dei solventi Preparazione dei campioni Utilizzo del detector Utilizzo dell unità di pompaggio Iniezione del campione Lavaggio dell iniettore Lavaggio dell unità di pompaggio

5 Pag. 5 di PREPARAZIONE DEI SOLVENTI PER HPLC I solventi che sono usati nell HPLC devono avere un alto grado di purezza, non devono contenere particelle né microbolle d aria. Questi elementi potrebbero infatti danneggiare la colonna ed alterarne l impaccamento. I solventi, quindi, prima si filtrano, poi si sonicano FILTRAZIONE Si utilizzano filtri a caraffa con pori di diametro 0,45 ìm e resistenti a solventi di media polarità. Dopo l utilizzo il filtro va lasciato capovolto sotto cappa per un periodo necessario a lasciar evaporare eventuali residui di solvente, dopodiché va riposto capovolto nel mobile ad ante dietro la cappa di lavoro. I filtri vanno periodicamente cambiati a seconda della frequenza di utilizzo: 1 volta ogni due mesi se usati 1-2 volte alla settimana 1 volta al mese se usati tutti i giorni Le bocce di vetro utilizzate devono essere pulite e prive di polvere all interno. I solventi utilizzabili sono solo quelli che portano in etichetta la specifica For HPLC. Ci si approvvigiona di acqua nel laboratorio C 69 dall apparecchio Milliq, previo travasamento di una quantità equivalente di acqua distillata nell apposita riserva. Non è necessario rifiltrare l acqua Milliq.

6 Pag. 6 di 16 Posizionare il filtro su una boccia in vetro Attaccare tubo della pompa al filtro Aprire il rubinetto dell acqua Aspettare che si faccia il vuoto nella boccia Versare con cautela il solvente nel filtro finché la boccia non è quasi piena Staccare la pompa dal filtro Chiudere il rubinetto dell acqua

7 PG 001 Pag. 7 di SONICAZIONE Si utilizza il sonicatore, un bagnetto ad ultrasuoni posto nel laboratorio C 68. Bisogna sempre fare attenzione che la vaschetta sia almeno per la metà piena di acqua. Svitare il tappo della boccia e lasciarlo appoggiato sul collo Andare al sonicatore C è acqua nel bagnetto? SI Posizionare la boccia nel sonicatore NO Riempire il bagnetto fino a metà con acqua distillata pulita Azionare il sonicatore (interruttore in basso a destra) Lasciare sonicare per 20 minuti Spegnere il sonicatore e riprendere la boccia

8 Pag. 8 di POCEDURA DI PREPARAZIONE DEI CAMPIONI I campioni, dopo l estrazione, contengono delle impurezze particolate che, se iniettate nel sistema HPLC, possono intasare la colonna e degradarla prematuramente. Per evitare questo, tutti i campioni (tranne gli standard), vengono filtrati attraverso filtri Millex con pori del diametro di 0,45 ìm. Tali filtri sono molto delicati, per cui non bisogna forzare troppo il liquido da filtrare per evitare che l elevata pressione danneggi la membrana. In caso in cui la resistenza opposta alla filtrazione sia troppo elevata, si sostituisce il filtro. I filtri usati vengono gettati nel sacchetto dei rifiuti biologici. Si posiziona il filtro su una beutina Si lava il filtro con 5 ml di MeOH contenuti in una siringa Si asciuga il filtro con aria tramite una siringa vuota finché dall estremità inferiore non esce più nulla Si posiziona il filtro sull eppendorf destinato a contenere il campione Si filtra il campione asciugando con cura il filtro Si ripoggia il filtro sulla beutina, si lava e si asciuga

9 Pag. 9 di PROCEDURA DI UTILIZZO DELL UNITA DI POMPAGGIO Per le procedure specifiche dei singoli sistemi HPLC all all. 1, vedi gli all. 2 e PROCEDURA DI UTILIZZO DEL DETECTOR Per le procedure specifiche dei singoli sistemi HPLC all all. 1, vedi gli all. 2 e PROCEDURA DI INIEZIONE DEL CAMPIONE Lavare la microsiringa per 3 volte con MeOH ed asciugarla bene Aspirare il campione in quantità leggermente superiore al volume del loup Girare la siringa verticalmente con l ago verso l alto Espellere tutta l aria (attenzione alle bolle!) finché una goccia di liquido non compare sulla punta dell ago Inserire l ago nell iniettore posizionato in load Iniettare tutto il campione Girare la manopola dell iniettore su inject

10 Pag. 10 di PROCEDURA DI LAVAGGIO DELL INIETTORE A fine giornata, oppure dopo l analisi di un campione ad alta concentrazione, l iniettore è contaminato. Operare in queste condizioni potrebbe portare ad una bassa riproducibilità o alla comparsa di picchi fantasma. Occorre quindi un accurato lavaggio dell iniettore che può essere operato con acqua distillata in caso di fasi acquose, oppure con metanolo in caso di fasi organiche. Riempire una siringa apposita con il liquido di lavaggio Iniettare nell iniettore in posizione «load» Ripetere questa operazione 10 volte Iniettare nell iniettore in posizione «inject» Ripetere questa operazione 10 volte Chiudere l iniettore con l apposito tappino

11 Pag. 11 di PROCEDURA DI LAVAGGIO DELLE POMPE I pistoni delle pompe sono tra le parti più delicate dei sistemi HPLC e richiedono una pulizia a fine di ogni giornata lavorativa. Questa pulizia può essere fatta anche in contemporanea al lavaggio dell iniettore. Mettere il pescante nella boccia del liquido di lavaggio Eseguire il «purge» (vedi procedure 5.3 all.2 e 3) per 3 volte SCELTA DEL LIQUIDO DI LAVAGGIO La scelta del liquido di lavaggio va operata in base alla fase mobile utilizzata per le analisi. Fase mobile composta da tamponi salini: eseguire il purge per 3 volte con acqua milliq Fase mobile organica: eseguire il purge per 3 volte con metanolo Attenzione: se si prevede di non utilizzare il sistema HPLC per più di un giorno, eseguire un lavaggio supplementare con isopropanolo.

12 Pag. 12 di ALLEGATO 1 Elenco dei sistemi HPLC in dotazione del laboratorio C 63: Sistema SHIMADZU con modulo di pompaggio LC-10ADvp e detector UV-Vis 10AVvp (allegato 2) Sistema MERCK-HITACHI Lichrograf con modulo di pompaggio L-6200 e detector UV-Vis L-4000 (allegato 3)

13 Pag. 13 di ALLEGATO PROCEDURA DI UTILIZZO DEL SISTEMA DI POMPAGGIO SHIMADZU Pigiare il pulsante «power» Pump Purge drain Mettere il pescante nella boccia contenente il solvente Ruotare di 180 in senso antiorario la valvola «drain» enter Pigiare il pulsante «purge» power function Dopo la fine del «purge» ci sono ancora delle bolle d aria nel tubo? NO SI Ripetere il «purge» Chiudere ruotandola di 180 in senso orario la valvola «drain» Impostare il flusso desiderato ( function"-valore- enter ) Azionare la pompa pigiando «pump»

14 Pag. 14 di PROCEDURA DI UTILIZZO DEL DETECTOR SHIMADZU Pigiare il pulsante «power» Attendere che il detector trovi la sua «home position» back Pigiare «func» func Impostare la lunghezza d onda a cui si vuole operare power Pigiare «back» Aspettare che la lampada si scaldi almeno 20 minuti prima di iniziare l analisi

15 Pag. 15 di ALLEGATO PROCEDURA DI UTILIZZO DEL SISTEMA DI POMPAGGIO MERCK-HITACHI Pigiare il pulsante «power» Mettere il pescante nella boccia contenente il solvente power purge numeri Ruotare di 2 giri in senso antiorario la valvola «drain» pump Pigiare il pulsante «pump» Pigiare il pulsante «purge» Dopo la fine del «purge» ci sono ancora delle bolle d aria nel tubo? NO Chiudere la valvola «drain» SI Ripetere il «purge» Impostare il flusso desiderato ( function"-valore- enter ) Azionare la pompa pigiando «pump»

16 Pag. 13 di PROCEDURA DI UTILIZZO DEL DETECTOR MERCK- HITACHI Pigiare il pulsante power power Impostare la lungezza d onda girando la manopola Aspettare che la lampada si scaldi almeno 20 minuti prima di iniziare l analisi Manopola per regolare lunghezza d onda