Colorazioni istologiche Immunoistochimica Immunofluorescenza Immunogold GFP
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1 MFN0366-A1 (I. Perroteau) - Tecniche morfologiche Colorazioni istologiche Immunoistochimica Immunofluorescenza Immunogold GFP Tecniche che richiedono la fissazione del preparato (cellule o sezioni di tessuto) = materiale morto Tecniche che non richiedono compatibili con cellule o tessuti vivi Solo per uso didattico, vietata la riproduzione, la diffusione o la vendita
2 MFN0366-A1 (I. Perroteau) - GFP Green Fluorescent Protein GFP Solo per uso didattico, vietata la riproduzione, la diffusione o la vendita
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14 DNA trascrizione Modifiche posttrascizionali mrna (c)traduzione (d) modifiche posttraduzionali
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16 MFN0366-A1 (I. Perroteau) - GFP Time-lapse: video microscopia di cellule in coltura al microscopio rovesciato a fluorescenza Esempio: Time lapse della proteina di fusione GFP-caderina in cellule epiteliali in coltura. Notare la localizzazione diffusa della fluorescenza nella cellula isolata: la proteina di fusione è localizzata sulla membrana plasmatica. Osservare la ridistribuzione della proteina di fusione e la sua concentrazione dei punti di interazione tra le cellule. A Vedi filmato Solo per uso didattico, vietata la riproduzione, la diffusione o la vendita
17 MFN0366-A1 (I. Perroteau) - Tecniche morfologiche Tecniche immunologiche: Interazioni anticorpo-antigene Altre interazioni? anticorpi Risultato: localizzazione di proteine
18 MFN0366-A1 (I. Perroteau) - Tecniche morfologiche: Ibridazione in situ Tecniche immunologiche: Interazioni anticorpo-antigene Tecniche ibridazione in situ Interazioni ac nucleici-ac. nucleici anticorpi sonda di DNA singolo filamento Risultato: localizzazione di proteine Risultato: localizzazione di RNAm oppure di sequenze di DNA
19 MFN0366-A1 (I. Perroteau) - Tecniche morfologiche: ibridazione in situ - immunoistochimica Immunohistochemistry Hybridazione in situ Antibody (protein) RNA probe (nucleic acid) Antigen (protein) mrna (nucleic acid) Solo per uso didattico, vietata la riproduzione, la diffusione o la vendita
20 MFN0366-A1 (I. Perroteau) - Tecniche morfologiche: ibridazione in situ - immunoistochimica Ibridazione in situ Ibridazione in situ per RNA del virus Epstein- Barr (EBER) in un linfoma plasmablastic di un paziente positivo al. Marcatura marrone dei nuclei delle cellule infette EBER. Ibridazione in situ per mrna di SP-A su sezione di adenoma pulmonre Immunoistochimica Sezioni di carcinoma mammario marcate con anticorpo AKT2 Solo per uso didattico, vietata la riproduzione, la diffusione o la vendita
21 MFN0366-A1 (I. Perroteau) - Tecniche morfologiche: fluorescence ibridazione in situ FISH (fluorescence in situ hybridization): tecnica utilizzata in citogenetica Ibridazione della sonda su 2 cromosomi metafasici omologhi Solo per uso didattico, vietata la riproduzione, la diffusione o la vendita
22 MFN0366-A1 (I. Perroteau) - Tecniche biochimiche-molecolari Esempio di tecniche biochimiche- molecolari comunemente utilizzate da chi studia la biologia delle cellule e dei tessuti Specificità di riconoscimento Extrazione Specificità di riconoscimento Western blotting proteine proteine Antigene-anticorpo Northern blotting mrna mrna Ibridazione di acidi nucleici Southern blotting DNA DNA Ibridazione di acidi nucleici Solo per uso didattico, vietata la riproduzione, la diffusione o la vendita
23 MFN0366-A1 (I. Perroteau) - Tecniche biochimiche-molecolari: Western blot 1. Estrazione delle proteine 2. Separazione delle proteine mediante corsa elettroforetica su gel Le proteine dell estratto, tutte caricate negativamente durante l estrazione, sono depositate nel pozzetto. Dopo applicazione della corrente elettrica migrano dunque verso il polo positivo. La separazione avviene in funzione del peso molecolare di ciascuna proteina. Quelle più piccole, di più basso peso molecolare, migrano più rapidamente all interno delle maglie del gel verso il polo positivo. Solo per uso didattico, vietata la riproduzione, la diffusione o la vendita
24 MFN0366-A1 (I. Perroteau) - Tecniche biochimiche-molecolari: Western blot 3. Trasferimento delle proteine dal gel di elettroforesi al filtro: Blot Al termine dell elettroforesi, si procede con il blotting, cioè il trasferimento dal gel di elettroforesi ad un supporto più managgevole ed idoneo all incubazioni con gli anticorpi: il filtro (assomiglia ad un foglio di carta della dimensione del gel) + Solo per uso didattico, vietata la riproduzione, la diffusione o la vendita
25 MFN0366-A1 (I. Perroteau) - Tecniche biochimiche-molecolari: Western blot 4. Incubazione del filtro con anticorpi e rivelazione Il filtro è poi incubato in presenza dell anticorpo primario, lavato, incubato in presenza di anticorpo secondario coniugato ad un enzima che permette una reazione luminescente. La rivelazione avviene ponendo una lastra fotografica sul filtro, la luminescenza impressiona la lastra. Dopo sviluppo fotografico della lastra, le macchie nere corrispondono alla presenza della proteina d interesse (antigene). 5. Risultato finale: lastra fotografica impressionata Solo per uso didattico, vietata la riproduzione, la diffusione o la vendita
26 MFN0366-A1 (I. Perroteau) - Tecniche biochimiche-molecolari: Western blot Solo per uso didattico, vietata la riproduzione, la diffusione o la vendita
27 MFN0366-A1 (I. Perroteau) - Tecniche biochimiche-molecolari: Western blot Solo per uso didattico, vietata la riproduzione, la diffusione o la vendita
28 MFN0366-A1 (I. Perroteau) - Tecniche biochimiche-molecolari: Western blot Gel di elettroforesi - Trasferimento (blotting) + Membrana per western blot Solo per uso didattico, vietata la riproduzione, la diffusione o la vendita
29 MFN0366-A1 (I. Perroteau) - Tecniche biochimiche-molecolari: Western blot Solo per uso didattico, vietata la riproduzione, la diffusione o la vendita
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MFN0366-A1 (I. Perroteau) - microscopia confocale Microscopia confocale 1 MFN0366-A1 (I. Perroteau) - microscopia confocale Esempio di analisi con focale: vedi il filmato corrispondente Vedi filmato 2
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