Lo studio prenatale dei cromosomi fetali:

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1 Laboratorio di Genetica Medica Lo studio prenatale dei cromosomi fetali: esame citogenetico standard vs array Bologna, 06 Giugno 2014 Giorgio Lucci

2 La citogenetica classica Inizio della citogenetica umana moderna Tjio e Levan, nel 1956, stabilirono il numero corretto dei cromosomi umani, 46, principalmente grazie ai miglioramenti tecnici delle procedure di preparazione dei cromosomi metafisici. Ciò permise l identificazione dei cromosomi individuali e l associazione di particolari disordini genetici con specifici cromosomi.

3 La citogenetica classica - Durante il periodo trisomico : attenzione a pazienti con anomalie congenite : si scoprì che pazienti con sindrome di Down possedevano un cromosoma 21 addizionale (Lejeune et al. (1959) Etude des chromosomes somatiques de neuf enfants mongoliens. Compt Rend 248: ). - Vennero scoperte altre trisomie, quali la trisomia 13 (sindrome di Patau), la trisomia 18 (sindrome di Edwards) e descritte inoltre anomalie numeriche coinvolgenti i cromosomi sessuali associati a specifici fenotipi clinici (45,X0 sindrome di Turner; 47XXY sindrome di Klinefelter). - Gli ulteriori avanzamenti portarono all era del bandeggio : il pattern di bande orizzontali, con diversa intensità di colorazione, risultano essere specifiche per ogni cromosoma, permettendone il riconoscimento. Ciò permise di studiare riarrangiamenti strutturali associati a specifiche sindromi genetiche. - Col tempo le tecniche di bandeggio si sono raffinate ed è aumentato il livello di risoluzione al quale possono venire studiati i cromosomi.

4 Il cariotipo standard Vantaggi: Visione d insieme dell intero genoma Individua anomalie strutturali bilanciate Individua anomalie strutturali sbilanciate Svantaggi: Risoluzione di circa 10-5 Mb (da 320 bande a 1000 bande)

5 Variazioni strutturali di dimensioni Le dimensioni delle delezioni/ duplicazioni sono molto varie Possono esserci perdite o guadagno di materiale genetico ( più o meno importante ) di dimensioni inferiori al limite della risoluzione dell analisi del cariotipo standard Al limite inferiore vi è la delezione o la sostituzione di una singola base nucleotidica in uno specifico gene, che può produrre una alterata espressione dello stesso e patologia, evidenziabile con tecniche di biologia molecolare quali sequenziamento o RdB ecc. Un avanzamento diagnostico è venuto dall utilizzo congiunto di tecniche di citogenetica classica con alcune di biologia molecolare

6 La FISH Sonde locus-specifiche Sonde painting Sonde alfoidi

7 La FISH Vantaggi: Risoluzione > rispetto all analisi cromosomica standard (circa Kb) Ha permesso di individuare: sindromi da microdelezione e sindromi da geni contigui e regioni critiche delle sindromi cromosomiche tradizionali Svantaggi: Tecnica lunga, laboriosa, costosa E necessario conoscere il bersaglio: evidenzia solo ciò che il clinico ricerca in base a quanto osservato Non analizza l intero genoma (numero di sonde limitato dal numero di fluorocromi marcatori utilizzabili in una singola analisi)

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9 Comparative Genomic Hybridization (CGH)

10 Comparative Genomic Hybridization (CGH) Vantaggi Visione dell insieme del genoma Non necessario conoscere il bersaglio Risoluzione nell ordine di 2-3 Mb Svantaggi Analisi comparativa e non assoluta (DNA di comparazione è di soggetto sano ) Tecnica lunga e laboriosa, costosa Non individua riarrangiamenti cromosomici, come inversioni o traslocazioni, che siano bilanciati Spesso materiale di partenza non adatto per ottenere buoni preparati metafasici (aborti, tumori solidi..)

11 Array CGH Principio Questa tecnologia è stata inizialmente sviluppata utilizzando il principio della CGH convenzionale 1) Nell arraycgh, un DNA di riferimento e un DNA di un paziente sono differentemente marcati ( il primo solitamente con un colorante rosso ed il secondo in verde) e poi sono coibridati a piccoli frammenti di DNA umano posti in maniera ordinata su un vetrino (Array). 2) La distinzione tra condizione con guadagno, perdita o bilanciamento si basa sul rapporto di fluorescenza verde rispetto a rosso per ciascun frammento di DNA posto ordinatamente sul vetrino 3) Utilizzando strumenti informatici, il rapporto di fluorescenza verde a rosso per ciascun segmento di DNA viene mappato in un punto specifico di un cromosoma, risultando in un profilo dell array.

12 Comparative Genomic Hybridization ARRAY (acgh)

13 Array - Cariotipo Molecolare circa 4000 cloni Cloni spottati in triplo e quadruplo (repliche) Controlli positivi e negativi,presenza di barcode 1Mb risoluzione, backbone (BAC) 0,2Mb risoluzione, regioni associate a patologie (Oligo) Esempio di Array

14 Protocollo (2-3 gg) Estrazione e digestione con ECORI DNA test e DNA controllo Controllo digestione e purificazione su colonnina 20 kb 600bp 2 cicli di Marcatura con controllo su gel Cy3 ( test) 532nm Cy5( ctr) 635nm unione dei Dna (+ H.cot1) e precipitazione Lavaggi ibridazione su chip O.N. Scannerizzazione analisi

15 Fase 1: Scannerizzazione - Lettura laser 10 u - Ottenimento di immagini/ file per software analisi Cy3 Cy5

16 Fase 2: Analisi con software -file gal (Genepix Array List) info su spot

17 - Allineamento automatico griglia (file gal) - Normalizzazione - Esclusione dati Fase 2: Analisi con software - Combinazione delle repliche (BAC) Post processing File variazioni quantitative genomiche profili dei cromosomi

18 Profili cromosomi Risultato: log 2 CY3(test) Cy5( ctr)

19 Esempio Ricerca sul database

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23 Tipologie di Array ( in base al tipo di sonda molecolare utilizzata per l ibridazione) I più impiegati in passato sono stati i BAC-array cioè: frammenti di DNA umano della dimensione di Kb incorporati in cloni BAC ( bacterial artificial chromosome). Alternativamente sono stati utilizzati i cosiddetti Oligo-array cioè: le sonde sono piccoli frammenti di Dna di circa basi nucleotidiche (oligonucleotidi).

24 Risoluzione dell Array I segmenti di DNA possono essere campionati in tutto il genoma e la loro frequenza( cioè la distanza media tra due segmenti tra loro prossimi) è uno dei parametri che determina la risoluzione dell Array In pratica più densamente le sonde coprono una regione cromosomica o l intero genoma, più alto è il potere di risoluzione dell array (vi sono poi altri fattori da cui dipende la risoluzione : intensità del segnale, rumore di fondo, tipo di algoritmo..) i BAC-arrayhanno almeno una risoluzione di 1 Mb cioè può identificare guadagni o perdite di Dna di 1 Mb cioè circa di 1/10 di una banda cromosomica (sino ad essere contigui) Gli oligo-arraydisponibili commercialmente comprendenti da a circa oligonucleotidi con una media di distanza tra loro 0,02-0,01 Mb cioè con una risoluzione da 500 a 1000 volte più alta rispetto a quella di un cariotipo standard

25 A : bandeggio G a bassa risoluzione 350 bande B: bandeggio a più alta risoluzione 550 bande C: risoluzione incrementata con l utilizzo di 10 segmenti DNA distribuiti uniformemente in 15q21 D: risoluzione incrementata con l utilizzo di 500 segmenti DNA distribuiti uniformemente in 15q21

26 Tipologie di Array (in base alle parti del genoma analizzate) Genome wide array Le sonde coprono, + o uniformementente, tutto il genoma Vantaggio: identifica piccoli CNVs in tutto il genoma Svantaggio: mette in evidenza anche riarrangiamenti di incerto significato patogenetico (VOUS) Targeted array Sono scelte specifiche regioni cromosomiche da analizzare in base alla riconosciuta associazione con sindromi specifiche (e relativamente frequenti) Vantaggio: analizza solo regioni riconosciute come patogenetiche Svantaggio: molti riarrangiamenti mappano al di fuori delle regioni considerate

27 Specificità della Diagnosi Prenatale (DP) Esistono tempi definiti e brevi per fornire una risposta diagnostica del cariotipo. La corrispondenza tra risultato analitico della DP e effetto fenotipico patologico/ non patologico e le caratteristiche della patologia, in vari casi, è verificabile solo dopo la nascita. Sulla base del risultato analitico e della sua interpretazione in consulenza genetica, viene usualmente deciso dalla coppia se proseguire o meno la gravidanza.

28 Array VS Cariotipo standard in Diagnostica prenatale - Cosa l Array dà in più, cosa in meno, quale è il grado delle differenze e in che modo utilizzare le metodiche? Su tali basi si sceglie se gli Array siano attualmente da utilizzare come primo step cioè per tutte le Dp indipendentemente dal grado alto o relativamente basso di rischio fetale di patologia sostituendo di fatto il cariotipo standard oppure solo in caso ci sia dimostrato un rischio elevato cioè secondo step. (Tecniche eseguite in parallelo per verificare pro/contro per alcuni anni in vari centri) Posizioni attuali (ciascuna porta dati a supporto della propria tesi) : conservatrice avanzata intermedia

29 SIGU Position paper per microarray (CGH-array e SNP-array) in diagnosi prenatale. (Ultrasound Obstet Gynecol Jan 20. doi: /uog ) Svantaggi - Dati in letteratura ancora limitati - Presenza di VOUS>o<in base alla piattaforma impiegata: (Targheted 0,4% ; Whole-genome SNP-array 9-12%) -Non evidenzia riarrangiamenti bilanciati e mosaicismi di basso grado -CMA come test di 2 livello dopo il cariotipo standard in gruppi selezionati con: -1 o+ anomalie ecografiche fetali (con cariotipo normale, l incidenza dei CNVs patogeni è di circa 6.4%) - riarrangiamenti cromosomici de novo (anche apparentemente bilanciati) -Presenza di marker sovrannumerario

30 Indicazioni cliniche per l analisi array- CGH in diagnosi prenatale (E.C.A.) Due o più anomalie ecografiche compresa IUGR Genitori portatori di riarrangiamento cromosomico Precedente figlio affetto da anomalia cromosomica Caratterizzazione molecolare di un riarrangiamento struttarale in epoca prenatale

31 Critiche al position paper SIGU: - Non ha considerato importanti pubblicazioni (dati su 1000 esami anziché 9000) - Non vi è aumento di VOUS rispetto citogenetica classica (un caso su 3000 Targeted-array, elevata risoluzione regioni di patologie note e bassa per backbone) - Da Studio è emerso che: in 17 gravidanze su 2880 a basso rischio (0.6%) ed in 7 su 120 gravidanze ad alto rischio (5.8%), l array ha permesso di riscontrare anomalie cromosomiche submicroscopiche che sarebbero sfuggite se si fosse effettuato solo il cariotipo convenzionale. ESAME DI 1 LIVELLO - Maggiore risoluzione - Tempi molto ridotti (minore ansia e possibilità interruzione anticipata)

32 Critiche al position paper SIGU: - Riguardo traslocazioni bilanciate è rischio per il feto solo se de novo (rarissime e con piccole perdite evidenziabili con CMA, suggerito proprio come approfondimento da SIGU) - Molto remoto anche rischio di patologia associata a effetto posizione - Sottolineato limiti del cariotipo tradizionale in DP: Limiti di risoluzione Coltura in vitro può fallire (ripetizione prelievo invasivo) Coltura tende a eliminare progressivamente mosaici a bassa % ESAME DI 1 LIVELLO

33 ACOG (American College of Obstetricians and Gynecologists) December 2013 SMFM (Society for Maternal-Fetal Medicine) 1) Nei casi di gravidanze con anomalie fetali riscontrate all ecografia ( alto rischio), è raccomandato l uso il cariotipo molecolare come test di primo livello (cioè è raccomandato il suo impiego diretto), in sostituzione del cariotipo tradizionale; 2) Il cariotipo molecolare può essere utilizzato anche nei casi in cui non vengano riscontrate anomalie fetali all ecografia, e cioè anche in gravidanze a basso rischio 3) L uso del cariotipo molecolare non deve essere limitato alle gravidanze con indicazione di età materna avanzata ( 35 anni), bensì può essere proposto a tutti i pazienti che si sottopongono a diagnosi prenatale invasiva, poiché le anomalie cromosomiche riscontrabili con questo esame non sono necessariamente associate all aumento dell età della paziente. Sottolinea: che c è un ampia evidenza scientifica che dimostra un maggiore detection rate del cariotipo molecolare in diagnosi prenatale (benefici soprattutto con anomalie ecografiche) e come vi sia la necessità, ormai imprescindibile, di proporre test prenatali la cui risoluzione sia maggiore della citogenetica classica. l importanza della consulenza pre e post test

34 Mercoledì 28 Maggio 2014

35 CONCLUSIONE Discussione aperta (Incremento conoscenze su CNVs) (Incremento utilizzo Array in DP)

36 Lo studio prenatale dei cromosomi fetali: esame citogenetico standard vs array FINE