Effetti biologici e meccanismi d azione indotti da PM10 su sistemi in vitro

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1 Effetti biologici e meccanismi d azione indotti da PM10 su sistemi in vitro R. Bengalli, E. Longhin, E. Molteni, M. Camatini, M. Gualtieri Centro di Ricerca POLARIS - DISAT Università di Milano - BICOCCA rossella.bengalli@unimib.it

2 Introduzione Caratterizzazione del PM10 di Milano (0 10 μm) (chimica e microbiologica) maggiore presenza di elementi crostali nel PM10 estivo maggiore contenuto di endotossine e di batteri Gram nel PM10 estivo (Progetto TOSCA 2010)

3 Scopo Effetti del PM10 Dati epidemiologici hanno mostrato che durante la stagione estiva vi è una maggiore incidenza di malattie respiratorie infiammatorie e croniche (COPD, asma, ALI) (Brunekreef B. et al., 2005) Risultati ottenuti da esperimenti in vivo e in vitro confermano il maggior rilascio di mediatori dell infiammazione (IL 6, IL 8 e IL 1β) da parte di cellule dell epitelio respiratorio (Dick CA et al. 2003; Becker S. et al. 2003) SCOPO DELLA RICERCA: Analizzare gli effetti indotti dall esposizione a PM10 su linee cellulari umane coinvolte nella risposta immunitaria utilizzando sistemi in vitro Indagare i meccanismi d azione della risposta infiammatoria indotta da PM

4 Introduzione Effetti locali IL 1β MACROFAGO IL 1β (concentrazioni plasmatiche <10 9 M) IL 6, TNF α, chemochine (IL 8) Aumento della fagocitosi e induzione di necrosi Incremento dello stato infiammatorio (attivazione linfociti T e B)

5 Introduzione Effetti sistemici IL 1β Ipoglicemia Febbre, sonnolenza Inibizione della replicazione delle cellule staminali IL 1β (concentrazioni plasmatiche >10 7 M) Formazione trombi effetti sul sistema cardiovascolare Aumento del catabolismo proteico Inibizione della contrattilità cardiaca

6 Inflammosoma e rilascio IL 1β Introduzione Inflammosoma= macrocomplesso molecolare che comprende caspasi 1 la cui attivazione provoca la secrezione di IL 1β Èattivato da: ROS Componenti batteriche Metalli e particelle LPS, glicolipidi, lipoproteine ENDOCITOSI Alluminio, asbesto, silice, batteri Demento et al., 2009

7 Introduzione Inflammosoma e rilascio IL 1β: effetti PM10 estivo PM10 Estivo Componenti batteriche Particolato 1. Coinvolgimento dei TLRs nel rilascio di IL 1β ENDOCITOSI 3. Internalizzazione del PM 2. Ruolo della caspasi 1 (inflammosoma) Demento et al., 2009

8 Materiali e metodi Linea cellulare utilizzata: macrofagi Cellule THP 1 (linea monocitica) differenziate in macrofagi Le cellule vengono esposte a PM nel medium di coltura PM10: campionato a Milano, Torre SARCA (Estate ) Dosi di trattamento: 1, 2.5 e 5 μg/cm 2 Tempi di esposizione: 3 e 6h VALUTAZIONE CITOLOGICA PARAMETRI TECNICHE Citotossicità Vitalità cellulare LDH assay Morfologia Interazione particolato cellule Microscopia ottica ed elettronica Risposta infiammatoria Espressione IL 1β ELISA Internalizzazione Espressione EEA1 Western Blot Immunofluorescenza

9 Citotossicità e risposta infiammatoria Rilascio di LDH (test di citotossicità) Risultati U/ml 0,034 0,033 0,032 0,031 0,03 0,029 0,028 CTRL CB 5μg/cm2 PM10 Est 1μg/ cm2 PM10 Est 2.5μg/cm2 PM10 Est 5μg/cm2 PM10 Inv 5μg/ cm2 Rilascio di IL 1β (test ELISA) PM10 estivo non è citotossico alle dosi e a 6h pg/ml pg/ml CTRL CB PM10s 1µg/cm2 PM10s 2.5µg/cm2 PM10s 5µg/cm2 PM10w 5µg/cm2 0 CTRL 2h 4h 6h Dose dipendente Tempo dipendente (concentrazione 2,5 μg/cm 2 ) =differenza statisticamente significativa rispetto al controllo (ANOVA, p<0,05)

10 Risultati Meccanismi d azione coinvolti nel rilascio di IL 1β PM10 Estivo Particolato Componenti batteriche 1. Coinvolgimento dei TLRs nel rilascio di IL 1β ENDOCITOSI 2. Ruolo della caspasi 1 (inflammosoma) 3. Internalizzazione del PM Demento et al., 2009

11 Rilascio di IL 1β Ruolo dei TLRs Risultati pg/ml # # CTRL PM10s 2.5μg/cm2 TLR2 Inhib + TLR4 Inhib PM10s + Inhib TLR2 PM10s + TLR4 Inhib PM10s + TLR2 + TLR4 Inhib L inibizione dei TLRs, in particolare TLR 2, determina un decremento significativo del rilascio della proteina =differenza statisticamente significativa rispetto al controllo (ANOVA, p<0,05) #= differenza statisticamente significativa rispetto al trattamento con PM10 estivo (ANOVA, p<0,05)

12 Risultati Meccanismi d azione coinvolti nel rilascio di IL 1β PM10 Estivo Componenti batteriche Particolato 1. Coinvolgimento dei TLRs nel rilascio di IL 1β ENDOCITOSI 2. Ruolo della caspasi 1 (inflammosoma) 3. Internalizzazione del PM Demento et al., 2009

13 Rilascio di IL 1β Ruolo di caspasi 1 Risultati pg/ml # 0 CTRL Caspase Inhibitor 10μM PM10s 2.5 μg/cm2 PM10s + Caspase Inhibitor Inibendo l enzima caspasi 1 si osserva un significativo decremento del rilascio della proteina =differenza statisticamente significativa rispetto al controllo (ANOVA, p<0,05) #= differenza statisticamente significativa rispetto al trattamento con PM10 estivo (ANOVA, p<0,05)

14 PM10 Estivo Componenti batteriche Risultati Meccanismi d azione coinvolti nel rilascio di IL 1β Particolato 1. Coinvolgimento dei TLRs nel rilascio di IL 1β ENDOCITOSI 2. Ruolo della caspasi 1 (inflammosoma) 3. Internalizzazione del PM Demento et al., 2009

15 Risultati MO Interazione PM10 Estivo cellule controllo PM10est 4h PM10est 6h TEM N PM10est mp N = nucleo; mp= membrana plasmatica

16 ODu/mm2/CTRL 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 Internalizzazione PM10 ed endocitosi Espressione EEA1 (marker di endosomi precoci) CTRL 30min 1h 2h 4h 6h Risultati EEA1 è espresso a 30min e 1h con 2,5 μg/cm 2 EEA1 controllo EEA1 PM10est 30min =differenza statisticamente significativa rispetto al controllo (ANOVA, p<0,05)

17 Conclusioni Conclusioni PM10 estivo è in grado di indurre il rilascio di IL 1β tramite l attivazione dell inflammosoma Il meccanismo cellulare dimostrato nella linea studiata potrebbe essere fondamentale per comprendere l incremento di patologie respiratorie infiammatorie durante la stagione estiva A sostegno di questa ipotesi dati in vivo mostrano la presenza di IL 1β nel BAL di topi instillati con PM10 estivo (Progetto TOSCA 2010) Questa ricerca è stata finanziata dalla Fondazione CARIPLO

18 Grazie per l attenzione! l