Il biomonitoraggio ambientale attraverso lo studio della regolazione genica della risposta allo stress Silvia Franzellitti

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1 Seminario per il corso misure con biomarcatori A.A Il biomonitoraggio ambientale attraverso lo studio della regolazione genica della risposta allo stress Silvia Franzellitti Perché utilizzare lo studio dell alterazione dell espressione genica nella tossicologia ambientale? Relevance to Ecosystem Health tempo Community Population Individual Cell Organelle Molecular Ecosystem ESITE UNA GERARCHIA DELLA RISPOSTA ALLO STRESS AMBIENTALE STIMOLO promotore RNA polimerasi NUCLEO gene TRASCRIZIONE mrna A Dose/Concentration Le modificazioni a livello molecolare rappresentano il primo stadio, estremamente precoce, della serie di eventi che governano i meccanismi di risposta. trasporto mrna A TRADUZIONE proteina RISPOSTA S. S. Franzellitti - Il Il biomonitoraggio ambientale attraverso lo lo studio della regolazione genica della 1

2 Metodi per lo studio dell espressione genica Basati sull ibridazione degli acidi nucleici Southern/Northern blotting Ibridazione in situ Microarray a DNA/cDNA Basati sulla PCR (Reazione a catena della DNA polimerasi) RT-PCR PCR semi-quantitativa PCR real-time Ibridazione A-T G-C 2

3 TECNOLOGIA DEL MICROARRAY CHIP GENICI Supporti in vetro su cui sono collocati in posizioni definite dei frammenti di DNA. Ogni posizione (spot) rappresenta un singolo gene. Ogni vetrino può contenere svariate migliaia di spot Preparazione dei microarray (spottaggio) Preparazione dei campioni Acquisizione e analisi delle immagini controllo trattato Isolamento dell mrna Retrotrascrizione e marcatura dei cdna Cy3-dCTP Cy5-dCTP ibridazione S. Franzellitti - Il biomonitoraggio ambientale attraverso lo studio della regolazione genica della 3

4 Mytox-chip Un microarray per studiare la in M. galloprovincialis 2 SOTTO-ARRAYS con 50 oligonucleotidi spottati su un supporto in vetro attivato di dimensioni 26 mm x 76 mm I 50 oligonucleotidi rappresentano i 25 geni: 2 spots diversi per ogni gene in esame Hg 2+ (750 nm) NSO (0.5ppm) 4

5 Applicazione del mytox-chip al biomonitoraggio del Visnes fjord (Norvergia) Stabilità delle membrane lisosomiali Rapporto volume lisosoma/citoplasma Accumulo lipidi neutri Accumulo lipofuscine S. S. Franzellitti - Il Il biomonitoraggio ambientale attraverso lo lo studio della regolazione genica della DAI DATI DEL MICROARRAY. Messa a punto di metodiche di PCR quantitativa per studiare la ambientale mediante GENI SENSIBILI ALLE ALTERAZIONI AMBIENTALI 5

6 I METODI BASATI SULLA REAZIONE A CATENA DELLA DNA POLIMERASI (PCR) Estensione Permette l amplificazione selettiva di singoli tratti genici, cioè la produzione in vitro di un elevato numero di copie di una specifica sequenza di DNA. La PCR si basa sulle proprietà dell enzima DNA polimerasi di ripetere in vitro ciò che accade normalmente in vivo durante il processo di duplicazione del DNA, ossia la sintesidinuovifilamenticomplementariad un filamento stampo, e sulla possibilità di mirare tale sintesi ad uno specifico tratto di DNA scegliendo opportunamente gli inneschi o primer. I primers sono oligonucleotidi sintetici lunghi pb, complementari alle regioni fiancheggianti il frammento genico da amplificare. Appaiandosi a tali regioni, i primer costituiscono un piccolo tratto di DNA a doppia catena, dal quale la DNA polimerasi può iniziare la sintesi, ossia formazione di legami fosfodiesterici tra l'estremità 3' del segmento iniziatore e il dntp complementare allo stampo. LA PCR SEMI-QUANTITATIVA la quantità di un determinato target prodotto dalla duplicazione in vitro è esponenzialmente proporzionale alla quantità di cdna inizialmente presente [amplificato] Elettroforesi n cicli di PCR C HSP70 HSC70 18s rrna Analisi d immagine S. S. Franzellitti - Il Il biomonitoraggio ambientale attraverso lo lo studio della regolazione genica della 6

7 Le Hsp70 e la termico Marker Marker Control Heat shocked 3,0 2,5 35 C 1h Hsp 77 Hsp 72 Hsp 69 fold induction 2,0 1,5 HSP70 1,0 HSC70 0, time of recovery (hour) LA RISPOSTA AI METALLI PESANTI fold induction 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 HSC70 HSP70 L espressione dei geni HSP70 è modulata durante l esposizione a Hg 2+ 0, time of exposure (days) I geni MT sono differentemente regolati dall esposizione a Hg 2+ n molecole MT10 MT tempo di esposizione a Hg (giorni) 7

8 ABC transporter rapporto d'induzione Pgp ctr 24h rapporto d'induzione Mrp2 ctr 24h Hg 2+ CH 3 Hg + 8