Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System. Guida reagenti

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1 Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Guida reagenti

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3 Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Guida reagenti

4 Copyright 2006, 2010 Applied Biosystems. All rights reserved. Information in this document is subject to change without notice. Applied Biosystems assumes no responsibility for any errors that may appear in this document. APPLIED BIOSYSTEMS DISCLAIMS ALL WARRANTIES WITH RESPECT TO THIS DOCUMENT, EXPRESSED OR IMPLIED, INCLUDING BUT NOT LIMITED TO THOSE OF MERCHANTABILITY OR FITNESS FOR A PARTICULAR PURPOSE. IN NO EVENT SHALL APPLIED BIOSYSTEMS BE LIABLE, WHETHER IN CONTRACT, TORT, WARRANTY, OR UNDER ANY STATUTE OR ON ANY OTHER BASIS FOR SPECIAL, INCIDENTAL, INDIRECT, PUNITIVE, MULTIPLE OR CONSEQUENTIAL DAMAGES IN CONNECTION WITH OR ARISING FROM THIS DOCUMENT, INCLUDING BUT NOT LIMITED TO THE USE THEREOF. NOTICE TO PURCHASER: Label License The StepOne Real-Time PCR System is covered by US patents and corresponding claims in their non-us counterparts, owned by Applied Biosystems. No right is conveyed expressly, by implication, or by estoppel under any other patent claim, such as claims to apparatus, reagents, kits, or methods such as 5 nuclease methods. Further information on purchasing licenses may be obtained by contacting the Director of Licensing, Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, USA. NOTICE TO PURCHASER: PLEASE REFER TO THE USER'S GUIDE OR PRODUCT INSERT OF THE REAGENTS NAMED HEREIN FOR LIMITED LABEL LICENSE OR DISCLAIMER INFORMATION. TRADEMARKS: Applera, Applied Biosystems, AB (Design), MicroAmp, Primer Express, and VIC are registered trademarks, and FAM, JOE, MultiScribe, NED, ROX, StepOne, TAMRA, and TET are trademarks of Applied Biosystems or its subsidiaries in the U.S. and/or certain other countries. AmpErase, AmpliTaq Gold, and TaqMan are registered trademarks of Roche Molecular Systems, Inc. SYBR is a registered trademark of Molecular Probes, Inc. All other trademarks are the sole property of their respective owners. N. di cat Rev. B 06/2010

5 Indice Front Cover Premessa Come utilizzare questa guida vii Come ottenere ulteriori informazioni ix Come ottenere assistenza xi Capitolo 1 Introduzione Informazioni sul sistema StepOne Preparazione degli esperimenti sul sistema StepOne Selezione del tipo di esperimento Selezione del tipo di reagente Selezione del tipo di saggio Capitolo 2 Descrizione generale dei reagenti Descrizione generale Reagenti TaqMan Reagenti SYBR Green Selezione del tipo di reagente appropriato Riduzione al minimo delle contaminazione da DNA Capitolo 3 Esperimenti di quantificazione Sezione 3.1: Informazioni sugli esperimenti di quantificazione Descrizione generale Selezione di un metodo di quantificazione Selezione della RT-PCR one-step o two-step Selezione PCR singleplex o multiplex Selezione del tipo di reagente Selezione del tipo di saggio Sezione 3.2: Linee guida disegno Saggi inventariati/prodotti su ordine Saggi di espressione genica TaqMan Saggi di espressione genica TaqMan personalizzati Selezione della Master Mix Disegno dell'esperimento CONFIDENTIAL For AB Internal Use Only. Do Not Distribute. iii

6 Saggi personalizzati Disegno dei primer e delle sonde utilizzando il software Primer Express Selezione dei reagenti Utilizzo delle condizioni di ciclo termico raccomandate Ottimizzazione delle concentrazioni primer Ottimizzazione della concentrazione della sonda Per ulteriori informazioni Capitolo 4 Esperimenti di genotipizzazione Sezione 4.1: Informazioni sugli esperimenti di genotipizzazione Descrizione generale Selezione del tipo di saggio Sezione 4.2: Linee guida disegno Saggi pre-disegnati/convalidati Saggi genotipizzazione SNP TaqMan Saggi genotipizzazione del metabolismo di farmaci TaqMan Reagenti per i saggi pre-sviluppati TaqMan per discriminazione allelica Selezione della Master Mix Disegno dell'esperimento Saggi personalizzati Saggi di genotipizzazione SNP TaqMan personalizzati Selezione della Master Mix Disegno dell'esperimento Capitolo 5 Esperimenti di presenza/assenza Sezione 5.1: Informazioni sugli esperimenti di presenza/assenza Descrizione generale Selezione del tipo di saggio Sezione 5.2: Linee guida disegno Saggi inventariati/prodotti su ordine Saggi di espressione genica TaqMan Saggi di espressione genica TaqMan personalizzati Reagenti di controllo positivo interno esogeno TaqMan Selezione della Master Mix Disegno dell'esperimento Saggi personalizzati iv CONFIDENTIAL For AB Internal Use Only. Do Not Distribute.

7 Appendice A Formula Formula per esperimenti con C T comparativo (ΔΔC T ) A-1 Appendice B Limitazione dei primer nella PCR multiplex Appendice C Linee guida disegno saggi Bibliografia Glossario Indice CONFIDENTIAL For AB Internal Use Only. Do Not Distribute. v

8 vi CONFIDENTIAL For AB Internal Use Only. Do Not Distribute.

9 Premessa Come utilizzare questa guida Scopo della guida A chi si rivolge Ipotesi assunte Convenzioni del testo La guida fornisce le informazioni sui reagenti che è possibile utilizzare sul sistema PCR Real-Time StepOne Applied Biosystems (sistema StepOne ). Informazioni contenute nella guida: Introduzione ai reagenti TaqMan e SYBR Green Descrizioni e linee guida disegno per i seguenti tipi di esperimento: Esperimenti di quantificazione Esperimenti di genotipizzazione Esperimenti di presenza/assenza Questa guida è pubblicata per il personale di laboratorio e per i ricercatori principali che eseguono esperimenti con curva standard con il sistema StepOne. La guida prevede che l'utente: Abbia una conoscenza professionale del processo della reazione a catena della polimerasi (PCR). Conosca le modalità di manipolazione dei campioni DNA e/o RNA e della loro preparazione per la PCR. La guida utilizza le seguenti convenzioni: Il testo in Grassetto indica un azione dell'utente. Ad esempio: Digitare 0, quindi premere Enter (Invio) per ognuno dei campi rimanenti. Il testo in Corsivo indica parole nuove o importanti e viene utilizzato anche per enfatizzare. Ad esempio: Prima di un'analisi, preparare sempre matrice fresca. Un simbolo di freccia a destra ( ) separa i comandi successivi selezionati da un menu a discesa o da un menu a scelta rapida. Ad esempio: Selezionare File Open (Apri). vii

10 Premessa Messaggi di attenzione per l'utente Messaggi di sicurezza Nella documentazione per l'utente Applied Biosystems compaiono due tipi di messaggi di attenzione. Ciascun messaggio presuppone un particolare livello di osservanza o l'esecuzione di una particolare operazione da parte dell'utente, secondo quanto descritto qui di seguito: Nota: Fornisce informazioni che potrebbero essere di interesse o di aiuto ma non di importanza critica per l'uso del prodotto. IMPORTANTE! Fornisce informazioni necessarie per il corretto funzionamento dello strumento, per l'uso accurato del kit reagenti o per l'uso sicuro di un prodotto chimico. Alcuni esempi dei messaggi di attenzione sono indicati qui di seguito: Nota: La funzione Calibrate (Calibra) è anche disponibile nella Control Console (Console di comando). IMPORTANTE! Per verificare la propria connessione client, è necessario un ID utente valido. Nella documentazione per l'utente di Applied Biosystems appaiono quattro diversi messaggi di attenzione in punti del documento dove risulta necessario essere ben consapevoli della possibilità di pericoli rilevanti. Ciascun messaggio IMPORTANTE, ATTENZIONE, AVVERTENZA, PERICOLO presuppone un particolare livello di osservanza o l'esecuzione di una particolare operazione da parte dell'utente, secondo quanto descritto qui di seguito. Definizioni IMPORTANTE! Indica informazioni necessarie per il corretto funzionamento dello strumento, per l'uso accurato del kit reagenti o per l'uso sicuro di un prodotto chimico. Indica una situazione potenzialmente pericolosa che, se non evitata, potrebbe causare lesioni di minore o moderata entità. Può inoltre essere utilizzata per mettere in guardia l'utente nei confronti di pratiche non sicure. Indica una situazione potenzialmente pericolosa che, se non evitata, potrebbe causare lesioni gravi o morte. Indica una situazione di pericolo incombente che, se non evitata, causerà morte o lesioni gravi. Questo messaggio viene utilizzato esclusivamente nelle situazioni di estremo pericolo. Ad eccezione di IMPORTANTE, ogni messaggio di sicurezza in un documento Applied Biosystems appare accanto a un figura di triangolo aperto contenente un simbolo di pericolo. Questi simboli di pericolo sono identici a quelli posizionati sugli strumenti Applied Biosystems. viii

11 Premessa Esempi IMPORTANTE! Creare un foglio elettronico separato di immissione campioni per ogni piastra di reazione a 96-pozzetti. PERICOLO CHIMICO. TaqMan Universal PCR Master Mix può provocare irritazione degli occhi e della pelle. L'esposizione può provocare problemi in caso di ingestione o inalazione. Leggere la scheda di sicurezza dei materiali (MSDS) e attenersi rigorosamente alle istruzioni relative alla manipolazione di questa sostanza. Indossare un'adeguata protezione oculare, indumenti e guanti di protezione. PERICOLO DI INFORTUNIO. Durante il funzionamento dello strumento, il pannello di copertura riscaldato e il blocco campione possono raggiungere temperature che superano anche i 100 C. PERICOLO ELETTRICO. La continuità del circuito di messa a terra è vitale per il funzionamento in sicurezza. Non mettere mai in funzione il sistema con il conduttore di messa a terra scollegato. Come ottenere ulteriori informazioni Documentazione correlata La documentazione seguente è allegata al sistema StepOne: Documento n. di cat. inglese n. di cat. italiano Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Getting Started Guide for Genotyping Experiments Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Getting Started Guide for Presence/Absence Experiments Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Getting Started Guide for Relative Standard Curve and Comparative C T Experiments Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Getting Started Guide for Standard Curve Experiments Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Installation, Maintenance, and Networking Guide Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Installation Quick Reference Card Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Site Preparation Guide Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Software Help ix

12 Premessa La documentazione di supporto seguente è disponibile presso Applied Biosystems: Documento n. di cat. Applied Biosystems High-Capacity cdna Reverse Transcription Kits Protocol Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Installation Performance Verification Protocol Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Installation Qualification-Operation Qualification Protocol Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Planned Maintenance Protocol Custom TaqMan Gene Expression Assays Protocol Custom TaqMan Genomic Assays Protocol: Submission Guidelines Custom TaqMan SNP Genotyping Assays Protocol Power SYBR Green PCR Master Mix and RT-PCR Protocol Pre-Developed TaqMan Assay Reagents Allelic Discrimination Protocol Primer Express Software Version 3.0 Getting Started Guide SYBR Green PCR and RT-PCR Reagents Protocol SYBR Green PCR Master Mix and RT-PCR Reagents Protocol TaqMan Drug Metabolism Genotyping Assays Protocol TaqMan Exogenous Internal Positive Control Reagents Protocol TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2 ) Protocol TaqMan Gene Expression Assays Protocol TaqMan SNP Genotyping Assays Protocol TaqMan Universal PCR Master Mix Protocol User Bulletin #2: Relative Quantitation of Gene Expression Using TaqMan Endogenous Control Assays to Select an Endogenous Control for Experimental Studies Application Note 127AP08 Nota: Per ulteriori documentazioni, consultare Come ottenere assistenza a pagina xi. Informazioni dalla Guida Software (Help) La Guida (Help) software del sistema PCR Real-Time StepOne Applied Biosystems (software StepOne ) descrive la modalità di utilizzo di ogni funzione dell'interfaccia utente. Accedere alla voce Help (Guida) dal software StepOne in uno dei modi seguenti: Premere F1. Fare clic su nella barra degli strumenti. Selezionare Help (Guida) StepOne Help (Guida StepOne). x

13 Premessa Per trovare argomenti di interesse nella voce Help (Guida): Esaminare l'indice. Cercare un argomento specifico. Cercare un indice alfabetico. Invio di commenti Applied Biosystems è lieta di ricevere i commenti e i suggerimenti dei clienti allo scopo di migliorare la propria documentazione per l'utente. È possibile inviare commenti tramite a: techpubs@appliedbiosystems.com IMPORTANTE! Utilizzare l'indirizzo sopra indicato esclusivamente per inoltrare commenti e suggerimenti relativi alla documentazione. Per ordinare documenti, scaricare file PDF o per aiuto su questioni tecniche, visitare il sito web all'indirizzo quindi fare clic sul link per il Support (assistenza). (Vedere Come ottenere assistenza qui di seguito). Come ottenere assistenza Per le informazioni relative a servizi e assistenza tecnica più recenti per tutte le sedi, visitare il sito web all'indirizzo quindi fare clic sul link Support. Nella pagina dell'assistenza clienti, è possibile: Ricercare argomenti attraverso le domande frequenti (FAQ) Inviare una domanda direttamente al servizio di assistenza tecnica Ordinare documenti per l'utente Applied Biosystems, MSDS, certificati di analisi e altri documenti correlati Scaricare documenti in PDF Ottenere informazioni sull'addestramento del cliente Scaricare aggiornamenti e patch del software Inoltre, la pagina dell'assistenza clienti fornisce l'accesso ai numeri di telefono e di fax in tutto il mondo per contattare l'assistenza tecnica e i punti vendita Applied Biosystems. IMPORTANTE! Contattare il Servizio clienti Applied Biosystems (Customer Care Center) quando suggerito da questa guida o in caso di necessità per programmare le operazioni di manutenzione (quali, manutenzione pianificata annuale o verifica/calibrazione della temperatura) per il proprio strumento StepOne. Per ottenere un numero di telefono o un indirizzo del servizio clienti, andare su xi

14 Premessa xii

15 Introduzione 1 1 Questo capitolo comprende i paragrafi: Informazioni sul sistema StepOne Preparazione degli esperimenti sul sistema StepOne Selezione del tipo di esperimento Selezione del tipo di reagente Selezione del tipo di saggio

16 Capitolo 1 Introduzione Informazioni sul sistema StepOne Il sistema Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System (sistema StepOne ) utilizza reagenti fluorescenti della reazione a catena della polimerasi (PCR) per fornire: Rilevamento quantitativo delle sequenze target dell'acido nucleico (target) utilizzando l'analisi in tempo reale. Rilevamento qualitativo delle sequenze target dell'acido nucleico (target) utilizzando analisi end-point e con curva di melting. Informazioni sull'acquisizione dei dati Il sistema StepOne acquisisce dati di fluorescenza non elaborati in punti diversi durante una PCR, in dipendenza del tipo di esecuzione: Tipo di esecuzione Punto di acquisizione dati Sessioni di analisi in tempo reale Sessioni di analisi endpoint Curva standard Curva standard relativa C T comparativo (ΔΔC T ) Genotipizzazione Presenza/assenza Lo strumento acquisisce dati dopo ogni fase di estensione della PCR. Lo strumento acquisisce dati prima e dopo la PCR. Lo strumento può inoltre acquisire dati durante la sessione di analisi (in tempo reale); l'acquisizione di dati durante la sessione di analisi è utile per la risoluzione di eventuali problemi. Lo strumento acquisisce dati prima e dopo la PCR. Indipendentemente dal tipo di esecuzione, un punto di acquisizione dati o di lettura consiste in tre fasi: 1. Eccitazione Lo strumento StepOne illumina tutti i pozzetti della piastra di reazione all'interno dello strumento StepOne, eccitando i fluorofori in ogni reazione. 2. Emissione L'ottica dello strumento StepOne focalizza la fluorescenza residua emessa dai pozzetti della piastra di reazione. L'immagine risultante acquisita dal dispositivo consiste unicamente nella luce che corrisponde al range delle lunghezze d'onda di emissione. 3. Acquisizione Lo strumento StepOne assembla una rappresentazione digitale della fluorescenza residua acquisita durante un intervallo dalla durata fissa. Il software StepOne memorizza l'immagine fluorescente non elaborata per l'analisi. 1-2

17 Capitolo 1 Introduzione Dopo una sessione di analisi, il software StepOne utilizza i dati di calibrazione (spaziale, del fluorocromo e di background) per determinare la posizione e l'intensità dei segnali fluorescenti in ogni lettura, il fluorocromo associato a ogni segnale fluorescente e il significato del segnale. Materiali di consumo supportati Il sistema StepOne supporta i materiali di consumo elencati qui di seguito. È possibile utilizzare tali materiali di consumo sia con i reagenti/protocolli standard sia con quelli veloci. Materiale di consumo MicroAmp Fast Optical 48-Well Reaction Plates MicroAmp Optical 48-Well Adhesive Film MicroAmp Fast 8-Tube Strips MicroAmp Optical 8-Cap Strips Numero di catalogo MicroAmp Fast Reaction Tubes with Caps MicroAmp Fast 48-Well Trays MicroAmp 48-Well Base Adaptor MicroAmp Splash Free 96-Well Base G D E F A C B A C B C # Materiale di consumo A B C D E F G MicroAmp Fast Optical 48-Well Reaction Plate MicroAmp Fast 48-Well Tray MicroAmp Splash Free 96-Well Base MicroAmp Optical 8-Cap Strip MicroAmp Fast 8-Tube Strip MicroAmp Fast Reaction Tubes with Caps MicroAmp Optical 48-Well Adhesive Film 1-3

18 Capitolo 1 Introduzione Per ulteriori informazioni Per ulteriori informazioni sugli argomenti trattati in questa guida, accedere alla voce Help (Guida) nel software del sistema Real-Time PCR StepOne Applied Biosystems premendo F1, facendo clic su nella barra degli strumenti oppure selezionando Help (Guida) StepOne Help (Guida StepOne). Preparazione degli esperimenti sul sistema StepOne Flusso di lavoro generale Informazioni contenute nella guida: Prima dell'esecuzione degli esperimenti sul sistema StepOne, eseguire la preparazione degli esperimenti come segue: 1. Selezionare un tipo di esperimento (pagina 1-5). 2. Selezionare il tipo di reagente (pagina 1-6). 3. Selezionare il tipo di saggio (pagina 1-7). Questo capitolo fonisce informazioni generali sui tipi di esperimento, i tipi di reagente e i tipi di saggio che è possibile utilizzare con il sistema StepOne. I capitoli seguenti forniscono informazioni specifiche: Capitolo Capitolo 2, Descrizione generale dei reagenti Capitolo 3, Esperimenti di quantificazione Capitolo 4, Esperimenti di genotipizzazione Capitolo 5, Esperimenti di presenza/assenza Descrizione Descrive e compara i reagenti TaqMan e SYBR Green. Fornisce informazioni sulla riduzione al minimo della contaminazione di DNA. Spiega la modalità di funzionamento del tipo di esperimento. Fornisce un flusso di lavoro specifico per il tipo di esperimento. Fornisce le linee guida per il disegno per ogni tipo di saggio. 1-4

19 Capitolo 1 Introduzione Selezione del tipo di esperimento È possibile eseguire i seguenti tipi di esperimento sul sistema StepOne: Quantificazione, inclusi: Curva standard Curva standard relativa C T comparativo (ΔΔC T ) Genotipizzazione Presenza/assenza Nota: Sul sistema StepOne è inoltre possible eseguire l'analisi della curva di melting. Esperimenti endpoint rispetto a quelli in tempo reale È possibile categorizzare i tre tipi di esperimento in esperimenti in tempo reale e endpoint, come descritto qui di seguito. Categoria Proprietà Tipo di esperimento Tempo reale Lo strumento monitora gli sviluppi della PCR durante il suo svolgimento. I dati vengono acquisiti durante lo sviluppo della PCR. Le reazioni sono caratterizzate dal punto temporale durante la fase ciclica in cui l'amplificazione di un target viene rilevata la prima volta. End-point I dati vengono acquisiti al termine del processo PCR. Le reazioni sono caratterizzate dalla quantità del target accumulata al termine della PCR. Il datapoint rappresenta l'intensità normalizzata del fluorocromo reporter oppure dell'r n. Nota: È possibile che alcuni esperimenti endpoint includano datapoint pre-pcr. In caso affermativo, il sistema calcola il valore del delta R n (ΔR n ) attraverso la formula seguente: Quantificazione Genotipizzazione Presenza/assenza Kwok and Higuchi, Saiki et al., R n post-pcr R n pre-pcr = ΔR n 1-5

20 Capitolo 1 Introduzione Selezione del tipo di reagente È possibile utilizzare i seguenti tipi di reagenti (chimiche) sul sistema Step One: Reagenti TaqMan Reagenti SYBR Green Altri reagenti fluorescenti Reagenti TaqMan I reagenti TaqMan includono i saggi TaqMan (miscele pre-formulate contenenti i set di sonde e primers) e le Master Mix TaqMan. È possibile utilizzare i reagenti TaqMan per i seguenti tipi di esperimento: Quantificazione, inclusi: Curva standard Curva standard relativa C T comparativo (ΔΔC T ) Genotipizzazione Presenza/assenza IMPORTANTE! Applied Biosystems non consiglia l'uso del fluorocromo TAMRA come reporter o quencher con il sistema StepOne. Reagenti SYBR Green I reagenti SYBR Green includono primer e Master Mix contenenti il fluorocromo SYBR Green. È possibile utilizzare i reagenti SYBR Green per gli esperimenti di quantificazione: Curva standard Curva standard relativa C T comparativo (ΔΔC T ) Nota: Non è possibile eseguire PCR multiplex utilizzando reagenti SYBR Green. Per ulteriori informazioni, vedere Selezione PCR singleplex o multiplex a pagina Altri reagenti È possibile utilizzare altri reagenti fluorescenti sul sistema StepOne, ma: Il software StepOne calcola automaticamente i volumi di reazione per i reagenti TaqMan e SYBR Green, ma non fa altrettanto per gli altri reagenti. È necessario disegnare il proprio esperimento utilizzando il flusso di lavoro dell'impostazione avanzata invece del flusso di lavoro del Design Wizard. 1-6

21 Capitolo 1 Introduzione Selezione del tipo di saggio Nel software StepOne, è possibile selezionare i seguenti tipi di saggi per esperimenti di quantificazione, presenza assenza e di genotipizzazione: Tipo di esperimento Tipo di saggio Vedere... Quantificazione Presenza/assenza Inventariati/Prodotti su ordine Personalizzati qui di seguito Genotipizzazione Pre-disegnati/Convalidati Personalizzati Disegnati dall'utente pagina 1-8 Gli esperimenti di quantificazione includono quelli con curva standard, curva standard relativa e con C T comparativo. Esperimenti di quantificazione e di presenza/ assenza Saggi inventariati/prodotti su ordine Per gli esperimenti di quantificazione o di presenza/assenza, selezionare il tipo di saggio inventariato/prodotto su ordine nel software StepOne utilizzato: Saggi di espressione genica TaqMan, inventariati Sonda TaqMan MGB (minor groove binder) marcata con fluorocromo FAM e set di primers predisegnati venduti pronti all'uso. L'Assay Mix è disponibile in una provetta 205, singola e pre-formulata. Saggi di espressione genica TaqMan, prodotti su ordine Sonda TaqMan MGB marcata con fluorocromo FAM e set di primers prodotti al momento dell'ordine. L'Assay Mix è disponibile in una provetta 205, singola e preformulata. Saggi di espressione genica personalizzati TaqMan Sonda TaqMan marcata con fluorocromo FAM e set di primers disegnati, sintetizzati e formulati dall'assistenza saggi genomici personalizzati TaqMan sulla base delle informazioni di sequenza inoltrate. L'Assay Mix è disponibile in una provetta 20 oppure in una provetta 60 singola e pre-formulata. Nota: Per selezionare il tipo di saggio nel software StepOne, andare alla schermata Reaction Setup (Impostazione reazione) sia nel flusso di lavoro del Design Wizard sia in quello di impostazione avanzata, quindi selezionare Inventoried/Made to Order (Inventariato/Prodotto su ordine) nel menu a discesa Assay Type (Tipo di saggio). 1-7

22 Capitolo 1 Introduzione Saggi personalizzati Per gli esperimenti di quantificazione e di presenza/assenza, selezionare il tipo personalizzato nel software StepOne nel caso sia in atto il disegno dei propri saggi (primer e sonde) con il software Primer Express e i reagenti TaqMan o SYBR Green. Nel disegno dei propri saggi, seguire le linee guida per il disegno dei saggi Applied Biosystems per l'ottimizzazione dei risultati. IMPORTANTE! Applied Biosystems non consiglia l'uso del fluorocromo TAMRA come reporter o quencher con il sistema StepOne. Nota: Per selezionare il tipo di saggio nel software StepOne, andare alla schermata Reaction Setup (Impostazione reazione) sia nel flusso di lavoro del Design Wizard sia in quello di impostazione avanzata, quindi selezionare Custom (Personalizzato) nel menu a discesa Assay Type (Tipo di saggio). Esperimenti di genotipizzazione Saggi pre-disegnati/convalidati Per gli esperimenti di genotipizzazione, il tipo di saggio pre-disegnato/convalidato include: Saggi di genotipizzazione SNP TaqMan Sonde TaqMan MGB (minor groove binder) marcate con fluorocromi FAM e VIC e set di primers predisegnati etichettati con fluorocromo FAM e VIC disponibili in due categorie: Saggi di genotipizzazione TaqMan convalidati e codificati SNP, acquistabili standardizzati (inventariati). L'Assay Mix è disponibile in una provetta 20, singola e pre-formulata. Saggi di genotipizzazione SNP TaqMan pre-disegnati, prodotti al momento dell'ordine (Prodotti su ordine). L'Assay Mix è disponibile in una provetta 20, singola e pre-formulata. Saggi di genotipizzazione TaqMan per il metabolismo di farmaci Sonde TaqMan MGB marcate in FAM e in VIC e primers pre-disegnati etichettati con fluorocromo FAM e VIC acquistabili standardizzati (inventariati). L'Assay Mix è disponibile in una provetta 20, singola e pre-formulata. Saggi TaqMan pre-sviluppati per discriminazione allelica (PDAR TaqMan per AD) Sonde TaqMan MGB marcate in FAM e in VIC e primers pre-disegnati etichettati con fluorocromo FAM e VIC acquistabili standardizzati (inventariati). L'Assay Mix è disponibile in una provetta 10, singola e preformulata. Nota: Per selezionare un saggio SNP nel software StepOne, andare alla schermata SNP Assays (Saggi SNP) nel flusso di lavoro del Design Wizard oppure alla schermata Plate Setup (Imposta piastra) nel flusso di lavoro avanzato. Nella schermata SNP Assays (Saggi SNP) o nella schermata Plate Setup (Imposta piastra), è possibile selezionare un saggio dalla libreria oppure creare un nuovo saggio. 1-8

23 Capitolo 1 Introduzione Saggi personalizzati Per gli esperimenti di genotipizzazione, il tipo di saggio personalizzato include i saggi di genotipizzazione SNP TaqMan personalizzati. I saggi di genotipizzazione SNP TaqMan personalizzati sono costituiti da set di sonde TaqMan MGB e primer marcati in FAM e in VIC disegnati, sintetizzati e formulati dall'assistenza saggi genomici personalizzati TaqMan sulla base delle informazioni di sequenza inoltrate. L'Assay Mix è disponibile in una provetta 40 oppure in una provetta 80 singola e pre-formulata. Nota: Per selezionare un saggio SNP nel software StepOne, andare alla schermata SNP Assays (Saggi SNP) nel flusso di lavoro del Design Wizard oppure alla schermata Plate Setup (Imposta piastra) nel flusso di lavoro avanzato. Nella schermata SNP Assays (Saggi SNP) o nella schermata Plate Setup (Imposta piastra), è possibile selezionare un saggio dalla libreria oppure creare un nuovo saggio. Saggi disegnati dall'utente Per disegnare le proprie sonde e e i primer per saggi SNP, fare riferimento alla guida Primer Express Software Version 3.0 Getting Started Guide. IMPORTANTE! Applied Biosystems non consiglia l'uso del fluorocromo TAMRA come reporter o quencher con il sistema StepOne. 1-9

24 Capitolo 1 Introduzione 1-10

25 Descrizione generale dei reagenti 2 2 Questo capitolo comprende i paragrafi: Descrizione generale Reagenti TaqMan Reagenti SYBR Green Selezione del tipo di reagente appropriato Riduzione al minimo delle contaminazione da DNA

26 Capitolo 2 Descrizione generale dei reagenti Descrizione generale Applied Biosystems ha sviluppato due tipi di reagenti (chimiche) che è possibile utilizzare per la rilevazione dei prodotti della PCR sul sistema PCR Real-Time StepOne Applied Biosystems: Reagenti TaqMan (qui di seguito) Reagenti SYBR Green (pagina 2-4) Reagenti TaqMan Tipi di esperimento Sviluppo dei reagenti TaqMan Come agiscono i reagenti TaqMan I reagenti TaqMan includono i saggi TaqMan (miscele pre-formulate contenenti set di sonde e primer) e le Master Mix TaqMan. I saggi sono specifici per il target di interesse. Le Master Mix contengono i componenti rimanenti necessari per la reazione PCR. È possibile utilizzare i reagenti TaqMan per i seguenti tipi di esperimento: Quantificazione, inclusi: Curva standard Curva standard relativa C T comparativo (ΔΔC T ) Genotipizzazione Presenza/assenza IMPORTANTE! Applied Biosystems non consiglia l'uso del fluorocromo TAMRA come reporter o quencher con il sistema StepOne. Inizialmente, venivano utilizzati i fluorocromi intercalanti per misurare i prodotti della PCR in tempo reale. Lo svantaggio principale di questo metodo di rilevamento consiste nel fatto che esso rileva l'accumulo sia dei prodotti specifici sia dei prodotti non specifici della PCR. I sistemi per PCR in tempo reale sono stati migliorati con l'introduzione di sonde fluorogeniche-marcate che utilizzano l'attività 5 nucleasica della Taq DNA polimerasi. La disponibilità di tali sonde fluorogeniche ha reso possibile lo sviluppo di un metodo in tempo reale per il rilevamento dei soli prodotti specifici di amplificazione. I reagenti TaqMan utilizzano una sonda fluorogenica per il rilevamento di uno specifico prodotto della PCR accumulatosi durante la PCR. Questo è il modo in cui essa agisce: 1. Viene costruita una sonda oligonucleotidica con un fluorocromo reporter fluorescente legato all'estremità 5 e un quencher sulla estremità 3. Quando la sonda è intatta, la vicinanza del quencher riduce fortemente la fluorescenza emessa dal fluorocromo reporter mediante il trasferimento spaziale dell'energia di risonanza di fluorescenza (FRET; Förster resonance, Förster, V. T. 1948). 2-2

27 Capitolo 2 Descrizione generale dei reagenti 2. Qualora sia presente il target, la sonda esegue un annealing nella zona tra i primer e viene spaccata dall'attività 5 nucleasica della Taq DNA polimerasi durante l'estensione. 3. Tale scissione della sonda: Separa il fluorocromo reporter dal quencher, aumentando il segnale del fluorocromo reporter. Rimuove la sonda dall'elica del target, consentendo all'estensione del primer di continuare fino al termine dell'elica del templato. Perciò, l'inclusione della sonda non inibisce il processo della PCR nel complesso. 4. Altre molecole di fluorocromo reporter vengono separate dalle rispettive sonde in ogni ciclo, con un aumento dell'intensità della fluorescenza proporzionale alla quantità di amplicone prodotto. Tanto più alto il numero di copie iniziali di DNA target, tanto prima si osserverà un aumento significativo della fluorescenza. Figura 2-1 illustra il processo. POLIMERIZZAZIONE RIMOZIONE ELICA SCISSIONE POLIMERIZZAZIONE COMPLETATA FORWARD PRIME 5' 3' R SONDA R = REPORTER Q Q = QUENCHER 3' 5' 5' 3' R Q 3' 5' 5' 3' R Q 3' 5' 5' 3' R Q 3' 5' 5' REVERSE PRIMER 3' 5' 5' 3' 5' 5' 3' 5' 5' 3' 5' Fase 1: Un reporter (R) e un quencher (Q) vengono legati alle estremità 5 e 3 di una sonda TaqMan. Fase 2: Quando entrambe le etichette sono legate alla sonda, l'emissione del fluorocromo reporter viene attenuata. Fase 3: Durante ogni ciclo di estensione, la Taq DNA polimerasi separa il fluorocromo reporter dalla sonda. Fase 4: Una volta separato dal quencher, il fluorocromo reporter emette la caratteristica fluorescenza. Figura 2-1 Come agiscono i reagenti TaqMan Sonde TaqMan MGB Applied Biosystems raccomanda l'utilizzo generale delle sonde TaqMan MGB, specialmente quando le sonde convenzionali TaqMan superano i 30 nucleotidi. Le sonde TaqMan MGB contengono: Un fluorocromo reporter alla estremità 5 Genera un segnale quando viene separato dall'attività 5 nucleasica della DNA polimerasi. Un quencher non fluorescente (NFQ) alla estremità 3 Consente ai sistemi PCR in tempo reale di eseguire la misurazione degli apporti del fluorocromo reporter più precisamente grazie alla non fluorescenza del quencher. Un minor groove binder (MGB) alla estremità 3 Aumenta la temperatura di melting (Tm) delle sonde senza aumentare la lunghezza della sonda (Afonina et al., 1997; Kutyavin et al., 1997), consentendo in tal modo il disegno di sonde più corte. Di conseguenza, le sonde MGB TaqMan presentano una maggiore differenza nei valori della Tm tra le sonde abbinate e non abbinate; differenze maggiori nei valori della Tm forniscono una genotipizzazione accurata. 2-3

28 Capitolo 2 Descrizione generale dei reagenti Applied Biosystems offre le seguenti sonde TaqMan MGB pre-disegnate con NFQ per l'utilizzo con il sistema StepOne : Etichetta fluorocromo 5' Etichetta fluorocromo 3' Altre caratteristiche Saggi TaqMan (sonda MGB TaqMan ) Saggi personalizzati TaqMan (sonda MGB TaqMan ) Sonde personalizzate Espressione genica Fluorocromo FAM NFQ MGB Genotipizzazione SNP Fluorocromi FAM e VIC NFQ MGB Espressione genica Fluorocromo FAM NFQ MGB Genotipizzazione SNP Fluorocromi FAM e VIC NFQ MGB Sonda MGB Fluorocromo FAM, TET, NFQ MGB personalizzata TaqMan NED o VIC IMPORTANTE! Applied Biosystems non consiglia l'uso del fluorocromo TAMRA come reporter o quencher con il sistema StepOne. Reagenti SYBR Green Tipi di esperimento Sviluppo dei reagenti SYBR Green I reagenti SYBR Green includono primer e Master Mix contenenti il fluorocromo SYBR Green. È possibile utilizzare i reagenti SYBR Green per gli esperimenti di quantificazione: Curva standard Curva standard relativa C T comparativo (ΔΔC T ) Nota: Non è possibile eseguire PCR multiplex utilizzando reagenti SYBR Green. Per ulteriori informazioni, vedere Selezione PCR singleplex o multiplex a pagina È possibile dividere le piccole molecole che si legano al DNA a doppia elica in due classi: quelle che si intercalano nel DNA e quelle che si legano al minor groove del DNA. Higuchi (Higuchi et al., 1992) ha utilizzato l'intercalante bromuro di etidio per il rilevamento in tempo reale della PCR. L'Hoechst rappresenta un esempio di fluorocromo che si lega al minor groove la cui fluorescenza aumenta quando esso si lega al DNA a doppia elica (Higuchi et al., 1993). Senza tener conto del metodo di binding, è necessario che il fluorocromo che si lega al DNA per il rilevamento in tempo reale dei prodotti della PCR presenti almeno le seguenti due caratteristiche: Aumento della fluorescenza quando esso si lega al DNA a doppia elica Assenza di inibizione della PCR Applied Biosystems ha sviluppato le condizioni che consentono l'utilizzo del fluorocromo SYBR Green I nella PCR in assenza di inibizione della PCR e con una sensibilità di rilevamento aumentata in confronto al bromuro di etidio. 2-4

29 Capitolo 2 Descrizione generale dei reagenti Come agiscono i reagenti SYBR Green I reagenti SYBR Green utilizzano il fluorocromo SYBR Green I per il rilevamento dei prodotti della PCR attraverso il legame al DNA a doppia elica durante la PCR. Questo è il modo in cui essa agisce: 1. Quando la Master Mix PCR SYBR Green viene aggiunta a un campione, il fluorocromo SYBR Green I si lega immediatamente a tutti i DNA a doppia elica. 2. Durante la PCR, la DNA polimerasi AmpliTaq Gold amplifica il target, creando il prodotto della PCR, o amplicone. 3. Il fluorocromo SYBR Green I quindi si lega ad ogni nuova copia di DNA a doppia elica. 4. Con il progredire della PCR, viene creata una maggiore quantità di amplicone. Poichè il fluorocromo SYBR Green I si lega a tutto il DNA a doppia elica, si ottiene un aumento di intensità della fluorescenza proporzionale alla quantità di prodotto della PCR a doppia elica che viene prodotto. Figure 2-2 qui di seguito si illustra il processo. Fase 1: Impostazione reazione Il colorante SYBR Green 1 dà luogo a fluorescenza quando si lega al DNA a doppia elica. Fase 2: Denaturazione Quando il DNA viene denaturato, il fluorocromo SYBR Green 1 viene rilasciato e la fluorescenza drasticamente ridotta. FORWARD PRIMER REVERSE PRIMER Fase 3: Polimerizzazione Durante l'estensione, i primer si legano al DNA e viene generato il prodotto della PCR. Fase 4: Polimerizzazione completata Il colorante SYBR Green 1 si lega al prodotto a doppia elica, con un netto aumento della fluorescenza rilevata dallo strumento. Figura 2-2 Come agiscono i reagenti SYBR Green 2-5

30 Capitolo 2 Descrizione generale dei reagenti Selezione del tipo di reagente appropriato È possibile utilizzare i reagenti TaqMan e SYBR Green per i tipi di esperimento elencati qui di seguito. Tipo di esperimento Tipo di reagente Quantificazione (Capitolo 3) Genotipizzazione (Capitolo 4) Presenza/ Assenza (Capitolo 5) Reagenti SYBR Green Sì Non raccomandato Non raccomandato Reagenti TaqMan Sì Sì Sì Include gli esperimenti con curva standard, con curva standard relativa e con C T comparativo. 2-6

31 Capitolo 2 Descrizione generale dei reagenti Considerazioni per gli esperimenti di quantificazione È possibile eseguire gli esperimenti di quantificazione sia con reagenti TaqMan sia con reagenti SYBR Green Nella scelta tra due tipi di reagenti considerare che: Tipo di reagente Reagenti o kit TaqMan Processo PCR e rilevamento di cdna a. Componenti del saggio Descrizione MGB Reverse primer Sonda I reagenti TaqMan utilizzano una sonda fluorogenica per l'abilitazione al rilevamento di uno specifico prodotto della PCR accumulatosi durante i cicli PCR. Vantaggi F Forward primer 3' Q 5' Templato di cdna cdna 3' 5' LEGENDA b. Templato denaturato e annealing dei componenti del saggio Con una sonda aumenta la specificità. L'ibridazione specifica tra la sonda e il target genera il segnale di fluorescenza. Rende possibili le multiplex. Sono disponibili saggi pre-formulati, ottimizzati per l'utilizzo sotto condizioni universali di ciclo termico. È possibile utlilizzarli sia nella RT-PCR in 1 fase sia nella RT-PCR in 2 fasi. 3' 5' Reverse primer RP MGB Sonda F Random Primer F Colorante FAM Q Quencher Q Forward primer 3' 5' MGB Minor Groove Binder AmpliTaq Gold DNA Polymerase c. Generazione del segnale 3' 5' Sonda Reverse primer Primer F Forward primer MGB 5' Limitazioni Q 3' 3' 5' Templato Primer esteso Richiede la sintesi di una sonda unica Reagenti SYBR Green Fase 1: Impostazione reazione Il colorante SYBR Green 1 dà luogo a fluorescenza quando si lega al DNA a doppia elica. Descrizione I reagenti SYBR Green utilizzano il fluorocromo SYBR Green I, un fluorocromo legante il DNA a doppia elica, per il rilevamento dei prodotti della PCR accumulatisi durante i cicli PCR. Fase 2: Denaturazione Quando il DNA viene denaturato, il fluorocromo SYBR Green 1 viene rilasciato e la fluorescenza drasticamente ridotta. Vantaggi Economico (non è necessaria alcuna sonda). Consente la misurazione della Tm di tutti i prodotti della PCR per l'analisi della curva di melting. È possibile utlilizzarlo sia nella RT-PCR in 1 fase sia nella RT-PCR in 2 fasi. Limitazioni Si fissa non specificamente alle sequenze di DNA a doppia elica. Per prevenire falsi segnali positivi, verificare la formazione di un prodotto non specifico utilizzando la curva di melting oppure l'analisi del gel. FORWARD PRIMER Fase 3: Polimerizzazione Durante l'estensione, i primer si legano al DNA e viene generato il prodotto della PCR. REVERSE PRIMER Fase 4: Polimerizzazione completata Il colorante SYBR Green 1 si lega al prodotto a doppia elica, con un netto aumento della fluorescenza rilevata dallo strumento. IMPORTANTE! Applied Biosystems non consiglia l'uso del fluorocromo TAMRA come reporter o quencher con il sistema StepOne. 2-7

32 Capitolo 2 Descrizione generale dei reagenti Riduzione al minimo delle contaminazione da DNA La capacità di amplificazione del DNA del processo PCR rende necessarie prassi speciali di laboratorio quando vengono eseguiti esperimenti utilizzando reagenti TaqMan o SYBR Green. La contaminazione potenziale può essere introdotta per mezzo di campioni con alte concentrazioni di DNA, sia da controlli del templato DNA sia dal carryover PCR. Inoltre, a causa della natura non specifica del fluorocromo SYBR Green I, verrà rilevato eventuale DNA a doppia elica. Nell'utilizzo dei reagenti SYBR Green, verificare la formazione di prodotto non specifico utilizzando la curva di melting o l'analisi del gel. Prevenire la contaminazione con DNA target. I saggi di espressione genica che rilevano le giunzioni esone-esone riducono al minimo l'effetto delle contaminazioni da gdna (DNA genomico). Utilizzo dell'ung per la riduzione al minimo della riamplificazione dei prodotti da carryover L'AmpErase uracil-n-glycosylase (UNG) è un enzima ricombinante di 26-kDa codificato dal gene dell'uracil-n-glycosylase di Escherichia coli. Questo gene è stato inserito in un host E. coli per dirigere l'espressione della forma nativa dell'enzima (Kwok and Higuchi, 1989). L'UNG agisce su DNA a singola o a doppia elica contenente du.. Esso agisce idrolizzando i legami uracil-glycosidic in aree di DNA contenenti du. L'enzima provoca il rilascio di uracile, creando in tal modo una area apyrimidic alcalinosensibile nel DNA. L'enzima non presenta attività su RNA o DNA contenente dt (Longo et al., 1990). Saggi TaqMan Per i saggi TaqMan, il trattamento con AmpErase UNG può prevenire la riamplificazione di prodotti PCR da carryover provenienti da precedenti reazioni. Quando dutp sostituisce dttp nell'amplificazione PCR, il trattamento con AmpErase UNG può rimuovere fino a copie di amplicone per 50-μl di reazione. Nota: La TaqMan 2 Universal PCR Master Mix è disponibile con o senza AmpErase UNG. Nel caso si utilizzi la TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2 ), No AmpErase UNG, è necessario acquistare l'amperase UNG separatamente. Saggi con fluorocromo SYBR Green I Per i saggi con fluorocromo SYBR Green I, il trattamento con AmpErase UNG può prevenire la riamplificazione di prodotti PCR da carryover provenienti da precedenti reazioni PCR. Anche se la Master Mix Power SYBR Green PCR e la Master Mix SYBR Green PCR non contengono AmpErase UNG, esse contengono dutp e sono perciò compatibili con AmpErase UNG. Nel caso si sospetti una contaminazione da carryover PCR, utilizzare AmpErase UNG per risolvere il problema. Nota: È possibile acquistare AmpErase UNG individualmente o come parte del kit SYBR Green PCR Core Reagents kit. 2-8

33 Capitolo 2 Descrizione generale dei reagenti Prassi generali PCR Utilizzare le seguenti precauzioni per ridurre al minimo la contaminazione del campione e il carryover dei prodotti della PCR. Nella preparazione dei campioni per l'amplificazione PCR indossare un camice da laboratorio pulito (non utilizzato precedentemente nella manipolazione di prodotti della PCR amplificati oppure durante la preparazione del campione). Sostituire i guanti nel caso se ne sospetti la contaminazione. Mantenere aree separate, attrezzatura dedicata e forniture per: Preparazione dei campioni. Impostazione PCR. Non portare mai i prodotti della PCR amplificati nell'area impostazione PCR. Amplificazione PCR. Analisi dei prodotti della PCR. Aprire e chiudere tutte le provette dei campioni con cautela. Evitare di spruzzare o di schizzare i campioni PCR. Utilizzare pipettatori positive-displacement o air-displacement con puntali confiltro. Sostituire i puntali dopo ogni utilizzo. Mantenere le reazioni e i componenti tappati il più possibile. Pulire i banchi da laboratorio e le attrezzature periodicamente con una soluzione di candeggina al 10% o di etanolo al 70%. 2-9

34 Capitolo 2 Descrizione generale dei reagenti 2-10

35 Esperimenti di quantificazione 3 3 Questo capitolo comprende i paragrafi: Sezione 3.1 Informazioni sugli esperimenti di quantificazione Sezione 3.2 Linee guida disegno

36 Capitolo 3 Esperimenti di quantificazione 3-2

37 Capitolo 3 Esperimenti di quantificazione Sezione 3.1 Informazioni sugli esperimenti di quantificazione Questa sezione comprende i paragrafi: Descrizione generale Selezione di un metodo di quantificazione Selezione della RT-PCR one-step o two-step Selezione PCR singleplex o multiplex Selezione del tipo di reagente Selezione del tipo di saggio

38 Capitolo 3 Esperimenti di quantificazione Descrizione generale Che cos'è un esperimento di quantificazione? Come si svolgono gli esperimenti di quantificazione Flusso di lavoro Un esperimento di quantificazione consiste in un esperimento in tempo reale che misura la quantità di una sequenza di acido nucleico target (target) durante ogni ciclo di amplificazione della reazione a catena della polimerasi (PCR). Il target può essere DNA, cdna o RNA. In questa guida vengono discussi tre tipi di esperimenti di quantificazione: Curva standard (pagina 3-5) Curva standard relativa (pagina 3-5) C T comparativo (ΔΔC T ) (pagina 3-6) Negli esperimenti di quantificazione in tempo reale, le reazioni sono caratterizzate dal punto temporale durante la fase ciclica in cui l'amplificazione di un prodotto PCR raggiunge un livello fisso di fluorescenza, piuttosto che dalla quantità finale di prodotto della PCR accumulato dopo un numero fisso di cicli. Un plot di amplificazione visualizza graficamente la fluorescenza rilevata nel numero di cicli eseguiti. Nei cicli iniziali della PCR, non si verifica alcuna modifica significativa nel segnale di fluorescenza. Tale range pre-definito di cicli PCR è chiamato linea di base. Innanzitutto, il software genera un plot di amplificazione sottratto della linea di base attraverso il calcolo della tendenza matematica del segnale del reporter fluorescente normalizzato (valori Rn corrispondenti ai cicli della linea di base). Successivamente, un algoritmo ricerca il punto nel plot di amplificazione nel quale il segnale del reporter fluorescente normalizzato corretto con la linea di base (valore delta Rn [ΔRn]) interseca la soglia. Il ciclo frazionario nel quale il valore ΔRn interseca la soglia viene definito C T. Prima dell'esecuzione degli esperimenti di quantificazione sul sistema PCR Real- Time StepOne Applied Biosystems, prepararsi per l'esperimento come segue: 1. Selezionare un metodo di quantificazione (pagina 3-5). 2. Selezionare la RT-PCR in 1 fase o in 2 fasi (pagina 3-8). 3. Selezionare reazioni PCR singleplex o multiplex (pagina 3-10). 4. Selezionare il tipo di reagente (pagina 3-13). 5. Selezionare il tipo di saggio (pagina 3-13). 6. Rivedere le linee guida per il tipo di saggio selezionato (Sezione 3.2 a pagina 3-17). 3-4