L adattamento dei batteri. Strategie di adattamento

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1 L adattamento dei batteri Strategie di adattamento mutazione trasferimento genico orizzontale regolazione dell espressione genica regolazione della trascrizione regolazione della traduzione regolazione post-traduzionale

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3 RNA polimerasi e inizio della trascrizione regione -35 regione -10 T 82 T 84 G 78 A 65 C 54 A 45 T 80 A 95 T 45 A 60 A 50 T 96

4 RNA polimerasi Complesso proteico di D costituito da 5 subunità: α 2 ββ σ Nucleo enzimatico α 2 ββ Fattore sigma σ Il nucleo enzimatico ha la capacità di sintetizzare RNA su uno stampo di DNA, ma non è in grado di iniziare la trascrizione al sito corretto. Il fattore sigma è responsabile del corretto riconoscimento del promotore. Viene rilasciato appena inizia la trascrizione.

5 Fattori sigma alternativi e regolazione globale dell espressione genica Subunità sigma Geni trascritti Segnale in E. coli s 70 maggior parte dei geni s 32 geni heat-shock temperatura elevata s 55 geni regolati dall azoto carenza di ammonio s 38 geni da stress ossidativi agente ossidante Ogni fattore sigma riconosce una classe di promotori con specifiche sequenze consensus -35 e -10.

6 La sporulazione in Bacillus subtilis e i fattori sigma alternativi La sporulazione rappresenta un drastico cambiamento dello stile di vita del batterio La transizione da una fase all altra si realizza attraverso cambiamenti globali dell espressione genica mediati da fattori sigma alternativi Subunità sigma s 43 s 32 s 29 gp28 gp33-34 Geni trascritti fase vegetativa inizio sporulazione inizio sporulazione (fase II) sporulazione intermedia fasi finali della sporulazione

7 Terminazione Rho-indipendente 5 -A-A-A-G-C-C-G-C-C-G-N-N-N-N-N-C-C-G-G-C-G-G-C-U-U-U-U-U-U-U-3 regione ricca in GC serie di U

8 la polimerasi continua la trascrizione terminatore la polimerasi termina la trascrizione

9 Terminazione Rho-dipendente

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12 L operone lac I P O Z Y A DNA mrna proteine Geni strutturali lacz: β-galattosidasi lacy: β-galattoside permeasi laca: β-galattoside transacetilasi mrna policistronico regolazione coordinata: tutti i geni si esprimono all unisono Il gene regolatore laci codifica per la proteina regolatrice (repressore)

13 Induzione: sintesidienzimiin rispostaallacomparsa di un substrato specifico Cellule di E. coli, in assenza di lattosio, contengono poche molecole di β-galattosidasi (<5) In presenza di lattosio, nel giro di pochi minuti, vengono sintetizzate fino a 5000 molecole di β-galattosidasi (5-10% delle proteine totali) glucosio galattosio La molecola che causa la produzione dell enzima capace di metabolizzarla lattosio è chiamata induttore La capacità di agire da induttore è altamente specifica. Molecole strutturalmente affini al lattosio possono agire da induttori della β- galattosidasi ma non vengono metabolizzate: una molecola con questa caratteristica è chiamata induttore gratuito (IPTG) Se l induttore è rimosso la sintesi degli enzimi si blocca

14 I P O Z Y A repressore RNApolimerasi Il repressore previene la trascrizione legandosi a una sequenza di DNA chiamata operatore. L operone lac è sottoposto a regolazione negativa In presenza della proteina regolatrice è bloccata la trascrizione deigenistrutturali. La proteina regolatrice prende il nome di repressore

15 In che modo l operone lac risponde all induttore? I P O Z Y A induttore Il repressore ha due siti di legame: un sito per il legame all operatore e il secondo per il legame dell induttore Quando il repressore lega l induttore subisce una modificazione conformazionale che porta ad una diminuita affinità per il sito operatore (esempio di controllo allosterico)

16 Mutazioni a carico dell operatore I P O Z Y A repressore Mutazioni nel gene O (O c ) portano all espressione costitutiva dei geni strutturali: vengono trascritti in assenza dell induttore Costitutivi sono gli enzimi il cui livello è costante in tutte le condizioni di crescita

17 Mutazioni a carico del repressore I P O Z Y A repressore Mutazioni nel gene I (I c ), a carico del sito di riconoscimento dell operatore, portano all espressione costitutiva dei geni strutturali

18 Mutazioni a carico del repressore I P O Z Y A repressore induttore Mutazioni nel gene I (I S ), a carico del sito di riconoscimento dell induttore, sono responsabili della super-repressione: i geni strutturali non vengono più indotti in presenza dell induttore

19 Il regulone Il regulone è l insieme di più geni o operoni sotto il controllo della stessa proteina regolatrice. I geni che lo costituiscono sono implicati nello stesso pathway Il regulone del maltosio è sotto controllo positivo gene regolatore activator binding site P gene1 gene2 gene3 attivatore + maltosio maltosio

20 Il regulone per la biosintesi dell arginina Gene o operone arg A arg B-C-E-H arg D arg F arg G localizzazione 60 min 88 min 72.5 min 6 min 68 min Esempio di regulone sottoposto a controllo negativo: tutti i geni per la catena biosintetica dell arginina sono regolati da un repressore

21 MUTAGENESI Gli studi di mutagenesi permettono di identificare le funzioni geniche e capire il funzionamento di geni e proteine codificate. (NB il tasso di mutazione fisiologico-naturale è 1/ nucleotidi) Mutagenesi tradizionale Fino agli anni la mutagenesi si otteneva esponendo l organismo in esame ad agenti chimici e fisici mutageni (es EMS, UV, radiazioni X) mutazioni casuali screening laborioso. Mutagenesi sito-specifica Con l affermazione delle tecniche di biologia molecolare ed in particolare della PCR è diventato possibile mutare i geni in modo diretto e altamente specifico Ingegneria proteica Grazie alle attuali tecniche di mutagenesi è possibile fare ingegneria proteica : modificare/migliorare le proprietà/funzioni di proteine e creare proteine con caratteristiche e funzioni nuove. (Es aumentare la termostabilità di enzimi, la specificità di Ab, l effficienza catalitica di un enzima, la stabilità in ambiente acido, ecc)

22 Mutazioni puntiformi 1. Silenti 2. Missenso 3. Nonsenso