Nozioni di base in biologia molecolare. Dott.ssa Daniela Fiocco

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1 Nozioni di base in biologia molecolare Dott.ssa Daniela Fiocco

2 Il DNA contiene l informazione genetica Griffith, 1928 esiste un principio trasformante, in grado di convertire ceppi innocui di Streptococcus pneumoniae in virulenti Avery, MacLeod & McCarty, 1944: il principio trasformante è identificato nella molecola di DNA Hershey & Chase, 50 Il materiale ereditario, trasferito nei batteri infettati per produrre una nuova progenie virale fagica, è l acido nucleico Watson & Crick, 1953 Proposta di un modello strutturale per il DNA coerente con la funzione di molecola depositaria dell informazione genetica.

3 il modello molecolare della doppia elica è coerente con la funzione di deposito dell informazione genetica Estremità 5 Estremità 3 P 4 3 P A T HO 4 3 P L informazione genetica è rappresentata dalla sequenza di basi che è tradotta in sequenza di amminoacidi nelle proteine (codice genetico) La complementarità specifica tra le basi è alla base dei processi di P C G G C P trasmissione (DUPLICAZIONE), trasferimento (TRASCRIZIONE-TRADUZIONE) ed evoluzione (RICOMBINAZIONE) dell informazione genetica P T A P e costituisce il principio di molti esperimenti/tecniche di ingegneria genetica OH P Estremità 3 Estremità 5

4 Negli anni 70, la scoperta degli enzimi di restrizione, della trasformazione batterica e dell elettroforesi su gel di agarosio ha avviato lo sviluppo della biologia molecolare Tecniche di base per l analisi dei geni: restrizione tagli specifici sul DNA e riunione di molecole diverse clonaggio molecolare studio di singoli geni isolati concetto di trasformazione e metodi di trasformazione elettroforesi su gel analisi ad alta risoluzione del DNA blotting ed applicazioni rilevamento di sequenze omologhe purificazione del DNA

5 Anni 70: scoperta degli enzimi di restrizione diventa possibile tagliare il DNA in siti specifici e riunire molecole di DNA di diversa origine

6 Gli enzimi di restrizione sono endonucleasi che riconoscono e tagliano il DNA a livello di una specifica sequenza nucleotidica. Il sito riconosciuto è generalmente formato da una sequenza di 4-8 bp. Enzimi diversi riconoscono sequenze nucleotidiche diverse: ogni enzima ha perciò una sua caratteristica specificità Gli enzimi di restrizione sono isolati dai batteri, dove costituiscono un sistema di difesa naturale che distrugge eventuali molecole di DNA estraneo e quindi protegge da infezioni virali. 1978, premio Nobel a W. Arber, D. Nathan & H. O Smith, per la scoperta degli enzimi di restrizione

7 Esistono 3 classi di enzimi di restrizione; gli enzimi di tipo 2 sono i più usati in ingegneria genetica: riconoscono brevi sequenze palindromiche (es GGTACC; GGTNACC) producendo estremità coesive (sticky) o piatte (blunt) TAGLIO SIMMETRICO ASIMMETRICO FREQUENZA DI TAGLIO: La distanza media tra siti di taglio è : 4 n, dove n= n basi del sito riconosciuto Es: 4-base cutter: 4 4 = 256 bp 6-base cutter: 4 6 = 4096 bp

8 Applicazioni degli enzimi di restrizione 1) Mappe di restrizione 2) Creazione di molecole di DNA ricombinante e clonaggio 3) Analisi di RFLP

9 Mappe di restrizione 1) DNA digerito con più tipi di endonucleasi di restrizione, (digestioni singole e multiple) 2) i frammenti risultanti separati ed analizzati mediante elettroforesi. Dal quadro di frammenti ottenuti si risale a posizione e ordine relativo dei siti di restrizione nella molecola di DNA: mappa di restrizione.

10 Molecole di DNA ricombinante Le estremità coesive generate dagli enzimi di restrizione sono molto utili per le tecniche di manipolazione genetica. DNA di origine diversa sono legati grazie alla complementarità tra le estremità generate dallo stesso enzima di restrizione, generando una molecola di DNA chimerica

11 RFLP= Restriction Fragment Length Polymorphism Il polimorfismo genetico consiste in differenze di sequenza a livello di cromosomi omologhi: differenze nucleotidiche, anche minime, possono generare o eliminare specifici siti di restrizione. La digestione di segmenti corrispondenti di cromosomi omologhi produce differenti quadri di restrizione chiamati RFLP. Wild-type allele AGATCT TCTAGA Restriction site Mutant allele AGAGCT TCTCGA Not a restriction site

12 Gli RFLP sono marcatori utili per - rilevare differenze tra genomi (studi filogenetici e di popolazione) - diagnosi di malattie ereditarie. Un particolare RFLP può essere associato alla forma difettosa di un gene, tanto da caratterizzare gli individui affetti dalla patologia. Attualmente, gli RFLP sono usati nella diagnosi di malattie con base genetica (fibrosi cistica, distrofia muscolare di Duchenne, fenilchetonuria, emofilia, etc.). Allele I Allele II Analisi su gel w x Taglio C C G G G G C C z A C G G T G C C Frammenti più lunghi 1 2 z y Taglio C C G G G G C C y Taglio C C G G DNA prelevato dai cromosomi G G C C Frammenti più corti + x w y y

13 Esempio di esame diagnostico basato su un polimorfismo genetico. 0.2 kb 1.2 kb introne Tipo di emoglobina A S Sequenza amminoacidica e nucleotidica nel gene per la β-globina -Pro- Glu - Glu CCT-GAG-GAG Sito per MstII -Pro- Val - Glu CCT-GTG-GAG Sito non riconosciuto da MstII Mst II Gene per la β-globina (mancante in HbS) 1.4 kb 1.2 kb Elettroforesi dei prodotti di restrizione A S A/S 0.2 kb Il cambiamento di una sola base (A T), nel gene per la β-globina, determina una sostituzione amminoacidica nella proteina codificata (Glu Val), che altera le proprietà strutturali dell emoglobina, generando l anemia falciforme. Il cambiamento nucleotidico, rispetto alla sequenza wild type, comporta la perdita del sito riconosciuto dall enzima MstII. Questo polimorfismo ha un utilità diagnostica e può essere rilevato analizzando il pattern di restrizione ottenuto trattando la regione genomica, precedentemente amplificata per PCR, con l enzima MstII: nel genotipo omozigote wild type, la digestione produrrà due frammenti (A), nel mutato un unico frammento (S), nell eterozigote portatore tre frammenti (A/S).

14 Clonaggio molecolare Il clonaggio molecolare consente l amplificazione e lo studio di uno specifico frammento di DNA. Il segmento di DNA di interesse viene inserito in una molecola di DNA vettore in grado di replicarsi autonomamente. Il risultante vettore chimerico ( DNA ricombinante ) è introdotto in un organismo ospite, in genere un batterio, che viene fatto riprodurre in modo da generare una popolazione numerosa: tutti i membri della popolazione conterranno molte copie del DNA ricombinante, ottenendo così quantità elevate del DNA di interesse, inserito inizialmente.

15 La base del clonaggio Taglio e riunione del DNA con enzimi di restrizione e DNA ligasi:

16 Come si fa ad introdurre DNA estraneo in una cellula ospite? Il DNA è una molecola carica che attraversa difficilmente parete e membrane cellulari metodi di trasformazione affinchè sia mantenuto nell ospite e trasmesso alle successive generazioni, il DNA esogeno deve essere integrato in un unità di replicazione funzionante vettore di clonaggio La trasformazione ha un efficienza <100%: è necessario poter distinguere le cellule trasformate da quelle non trasformate marcatori di selezione.

17 TRASFORMAZIONE La trasformazione consiste nel trasferimento di DNA esogeno all interno di una cellula ospite. Sono state sviluppate diverse tecniche che permettono di trasformare cellule sia batteriche che eucariotiche, incluse di mammifero. -a)trattamento con una combinazione di cationi bivalenti e successivo shock termico. -b) Elettroporazione -c) Gene gun -Infezione con virus i cui genomi sono stati modificati in modo da contenere il DNA esogeno (metodo usato per eucarioti e batteri). - Microiniezione (cellule di mammifero).

18 L ospite per il clonaggio varia secondo le esigenze E. coli B. subtilis S. cerevisiae

19 Efficienza di trasformazione: (quantità di trasformanti)/ (quantità di DNA) Escherichia coli, batterio Gram-negativo, è l ospite standard di numerosi esperimenti di clonaggio Si possono raggiungere efficienze di trasformanti/µg DNA Facile ed economico da coltivare Crescita rapida (Tg=20-30 min) Genetica nota I ceppi da laboratorio hanno mutazioni che non consentono la diffusione all esterno Colonia di Escherichia coli

20 Si prepara un terreno di coltura selettivo in cui solo i batteri/microorganismi trasformati sono in grado di crescere Condizioni di sterilità Incubazione delle piastre alla T ottimale per la crescita del microorganismo

21 Come si genera una coltura di cellule animali? Si preleva piccolo frammento di tessuto (2mm 3 ) Digestione con proteasi per degradare matrice extracellulare e separare le cell. Trasferimento in flask con terreno e fattori di crescita (da siero) per stimolare proliferazione

22 Linee cellulari primarie: le cellule ottenute da tessuto non si dividono o lo fanno per poche volte prima di andare incontro a senescenza e morire Linee cellulari secondarie: cellule ottenute da tessuto riescono a dare numerose generazioni (10-20 divisioni), prima di invecchiare e morire Linee cellulari trasformate: in seguito a cambiamenti genetici, spontanei o indotti (ad es mediante infezione virale), le cellule perdono il normale controllo su divisione e crescita cellulare cellule crescono indefinitamente: linee immortalizzate (es cell HeLa: cellule tumorali derivanti da paziente morta di cancro all utero nel 1951)

23 Metodi di transfezione I metodi di trasfezione usati per le cellule animali tendono ad aumentare la permabilità della membrana plasmatica al DNA e a superare l ostacolo all ingresso del DNA costituito dalla matrice extracellulare (soprattutto nei tessuti). METODI CHIMICI TRANSFEZIONE MEDIATA DA PEPTIDI ELETTROPORAZIONE INIEZIONE TRANSFEZIONE MEDIATA DA LIPOSOMI TRANSFEZIONE MEDIATA DA VIRUS

24 TRANSFEZIONE MEDIATA DA LIPOSOMI LIPIDE CATIONICO LIPOSOMA CATIONICO Non si tratta di liposomi classici (:vescicole a doppio strato lipidico che racchiudono una sostanza idrofilica) bensì di lipidi cationici che formano vescicole lungo tutta la lunghezza del DNA (mediante legame elettrostatico) favorendo ingresso attraverso la membrana. LIPOSOMI CATIONICI INTERAGENTI CON DNA Vantaggi i liposomi evitano la degradazione, mediata da endosomi, del DNA entrato Facile esecuzione riproducibile

25 MICROINIEZIONE DI DNA Il DNA è iniettato direttamente nel nucleo delle cellule in coltura; metodo applicabile su cellule di grossa taglia, es ovociti; bassa probabilità di integrazione

26 ELETTROFORESI SU GEL L elettroforesi su gel consente di separare ed analizzare molecole di DNA di dimensioni diverse. Molecole cariche, come acidi nucleici e proteine, possono essere separate mediante elettroforesi: migrazione in un campo elettrico. Essendo cariche negativamente, le molecole di DNA migrano verso il polo positivo.

27 Fasi di preparazione di un gel per elettroforesi

28 Dopo la corsa, il gel è posto su una lampada di luce UV per visualizzare il pattern di migrazione del DNA

29 In un gel di elettroforesi, il DNA si può visualizzare con coloranti fluorescenti, come il bromuro di etidio, un potente agente intercalante del DNA. Il bromuro di etidio emette una luce rosa-arancio quando è intercalato nel DNA e sottoposto a radiazione UV

30 La matrice del gel è un polimero che forma un reticolo di maglie che le molecole devono attraversare. Dalla concentrazione di matrice nel gel dipende il range di dimensione dei frammenti separabili con buona risoluzione concentrazione maglie lasse separazione di molecole grandi; concentrazioni maglie strette separazione di molecole con basso PM. Poliacrilammide (PAGE) pori sottili (conc. 3-30%) Matrice polimerica per gel elettroforesi agarosio pori grossolani e disordinati (conc %)

31 All interno del gel la velocità di migrazione del DNA è influenzata dalla dimensione e dallo stato strutturale

32 Schwartz & Cantor, 1984 La gel-elettroforesi in campo pulsato (PFGE) permette di separare molecole di DNA molto lunghe, fino a 10000Kb (10Mb) Consente analisi di cromosomi interi

33 Le cellule sono incluse direttamanete in blocchi d agarosio per ottenere DNA integro

34 Sequenziamento del DNA I didesossiribonucleotidi interferiscono con la normale sintesi del DNA e bloccano l estensione. Nel gel si separano frammenti diversi per lunghezza anche di una sola base. Nei sequenziatori moderni: ddntp marcati per fluorescenza Elettroforesi su gel-capillare Il sequenziamento del DNA è applicato ai geni, ma anche a genomi completi: progetto genoma umano (Dulbecco)

35 Southern, 1975 Il Southern Blotting permette di individuare frammenti di DNA con sequenza specifica all interno di una popolazione eterogenea di frammenti Il metodo si basa su:1) la produzione di una replica del gel su membrana; 2) la complementarità tra DNA sonda e DNA fissato su membrana

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37 Sonda radioattiva (DNA) DNA a filamento singolo La sonda è un segmento di DNAss marcato Durante la fase di ibridazione riconosce e lega il DNA bersaglio presente sulla membrana Mediante l appaiamento delle basi azotate si individua il gene prescelto Analoghi al southern blotting, in quanto basati sul trasferimento di molecole da gel di elettroforesi a membrana sono: -Northern blotting trasferim. di RNA; rilevamento per ibridazione con sonde di DNA -Western blotting trasferim. di proteine separate mediante PAGE; rilevamento con anticorpi marcati -South-Western blotting trasferim. di proteine; rilevamento con sonde di DNA ds; consente l identificazione di proteine in grado di legare DNA

38 Il western blotting differisce dal southern per due aspetti principali: 1. Il trasferimento di proteine avviene per passaggio di corrente elettrica (e non per capillarità) 2. Il rilevamento si basa sul legame di anticorpi

39 Applicazioni del Southern blotting Medicina legale: DNA fingerprint Gli RFLP di particolari marcatori sono evidenziati e confrontati mediante southern blotting Sangue dell imputato Sangue rinvenuto sui vestiti dell imputato Sangue della vittima

40 Purificazione del DNA Purificazione del DNA genomico Step principali: 1. Lisi cellulare con metodi vari secondo il tipo cellulare 2. Rimozione dei frammenti cellulari mediante centrifugazione 3. La parte solubile è trattata con solventi organici (fenolo e cloroformio) per denaturare e allontanare le proteine 4. Precipitazione e concentrazione degli acidi nucleici rimasti nella fase acquosa (etanolo o PEG) 5. Rimozione dell RNA: trattamento con enzima RNAsi 6. (Centrifugazione in gradiente di densità per separare diversi tipi di DNA) Resa di DNA genomico µg per mg di tessuto, 5-15 µg da 300 µl di sangue intero.

41 Purificazione di DNA plasmidico Da cellule di E. coli: metodo della lisi alcalina Il metodo si basa sul fatto che dopo trattamento alcalino il DNA circolare plasmidico ma non quello lineare, rinatura più facilmente in seguito a neutralizzazione Trattamento con detergente SDS e NaOH (ph 12) Neutralizzazione (ph 5.2) Eliminazione del precipitato (proteine e lipidi di membrana associati a DNA genomico) mediante centrifugazione Purificazione del DNA in soluzione grazie a cromatografie a scambio ionico o di gelfiltrazione Resa standard: 1-3 µg per ml di coltura batterica iniziale

42 Vettori I vettori assicurano la propagazione e replicazione del DNA esogeno nell ospite. I vettori sono molecole di DNA costruite combinando e modificando sequenze naturali. 1)Vettori di clonaggio amplificazione del DNA inserito 2) Vettori di espressione traduzione in proteina del DNA inserito

43 Esistono vari vettori di origine diversa; la scelta del vettore dipende dall applicazione e dalla dimensione del frammento da clonare VETTORE OSPITE TIPO DI CLONAGGIO, applicazioni Dimensione MAX dell inserto Plasmide batteri, lieviti genomico, cdna Manipolazione generale kb Batteriofago λ batteri genomico, cdna 20 kb e M13 Librerie, mutagenesi e sequenziamento Cosmidi batteri Genomico librerie 45 kb BAC batteri genomico librerie kb YAC Lieviti genomico librerie kb

44 I plasmidi sono molecole di DNA circolari extra-cromosomali. Naturalmente diffusi in procarioti e alcuni eucarioti (lievito). Dimensione standard 1-20kb TEM 2000

45 Esempio di vettore plasmidico regione di inserimento del DNA di interesse Gene marker per selezionare trasformanti: resistenza ad antibiotico (ampicillina) origine di replicazione

46 Vettore plasmidico che permette la selezione immediata dei ricombinanti. Il marker codifica per un fenotipo facilmente rilevabile: con l inserimento del DNA esogeno la colonia risulta bianca!

47 La PCR (Polymerase Chain Reaction) ha rivoluzionato la biologia molecolare; ideata e messa a punto da Kary Mullis nel 1983 (Nobel per la chimica nel 1993). È un metodo attraverso cui una sequenza di DNA può essere amplificata esponenzialmente in vitro in modo specifico. Molecola iniziale di DNA Numero di molecole di DNA

48 Ingredienti e condizioni di PCR - oligonucleotidi innesco (~20 bp) complementari alle regioni fiancheggianti la zona da amplificare: primer per la polimerasi -Enzima DNA-polimerasi (termostabile) -dntp -DNA stampo. sia puro che sottoforma di campioni biologici (fettine istologiche, capelli, colonie batteriche, ecc). La quantità iniziale di DNA richiesta per la PCR è minima, in teoria, anche una singola molecola è sufficiente - Condizioni saline (MgCl 2 ) e di ph adeguate

49 -Alternanza di fasi a diversa temperatura 1) denaturazione del DNA stampo 2) appaiamento dei primer 3) estensione dei primer da parte della polimerasi = 1 ciclo di PCR ad ogni ciclo il DNA bersaglio raddoppia cicli di amplificazione Accumulo esponenziale dei frammenti di amplificazione Legge esponenziale x(2 n ) x= n molecole DNA stampo iniziale; n= n di cicli

50 Enzyme primers Template DNA dntp Buffer Il profilo termico è impostato in un thermal cycler Pcr.exe Il prodotto di reazione è controllato per elettroforesi

51 Enzimi usati in PCR La PCR è stata rivoluzionata dall uso di DNA polimerasi termostabili derivate da batteri termofili Vantaggi resistenza passaggi di denaturazione specificità sintesi 1) Taq polimerasi estratta da Thermus aquaticus Attività polimerasi (ed esonucleasi) 5 3 Freq di errore 1/10 4-1/10 5 bp Attività adenosin trasferasi 2) Pfu polimerasi (da Pyrococcus furiosus) Polimerasi-esonucleasi 5 3 Esonucleasi 3 5 : correzione bozze freq. errore inferiore 3) Enzimi ricombinanti (con caratteristiche modificate/migliorate) Partenze hot start : un ingrediente essenziale è attivato/aggiunto solo dopo che mix ha raggiunto 95 C resa e specificità PCR (es polimerasi bloccata da anticorpo) Dimensione max amplicone ~2-10 kb

52 Primer per PCR Oligonucleotidi bp Complementari all elica senso ed antisenso (polarità opposte) GC ~ 50% Evitare sequenze ripetute e complementari tra i due primer T annealing ~45-60 C Programmi specifici per design di primer 5 -gagtggaccatcgaagataac-3 3 -ggcgatgactggggcaggacta- 5 Uso di primer mismatch volutamente non perfettamente complementari al DNA bersaglio per: Introdurre siti di restrizione per clonaggio Mutagenesi Ricerca di sequenze omologhe e famiglie geniche (uso di primer degenerati)

53 Applicazioni della PCR Le applicazioni sono molteplici in campi diversi: genetica molecolare, medicina, archeologia, medicina forense, analisi di popolazioni, etc. Diagnosi di malattie genetiche (mutazioni per delezioni/inserzioni o puntiformi) Analisi di medicina forense (es DNA finger-print) Clonaggio dei prodotti di PCR Rilevare infezioni batteriche o virali Analisi dell espressione genica (RT-PCR) Studi di evoluzione molecolare (filogenesi)

54 Sequenziamento del DNA Alla fine degli anni 70 sono stati elaborati due metodi alternativi per il sequenziamento manuale del DNA Maxam e Gilbert, 1977: metodo chimico Il DNA è tagliato chimicamente in corrispondenza di basi specifiche: i prodotti di taglio sono analizzati su gel elettroforesi Sanger, 1977: metodo terminazione di sintesi enzimatica Il Dna da sequenziare è replicato a partire da un primer innesco con una polimerasi; il filamento neosintetizzato è radiomarcato e la reazione è interrotta per incorporazione di dideosii -nucleotidi (ciascuno aggiunto alle 4 diverse mix di reazione) analisi di elettroforesi autoradiografia (1980: Nobel per la chimica a Gilbert e Sanger)

55 Metodo di Sanger La mix di reazione è divisa in 4 provette, ciascuna contenente un diverso ddntp. I ddntp o terminatori (nucleotidi che al 3 non posseggono il gruppo ossidrile) interferiscono con la normale sintesi del DNA e bloccano l estensione. Separazione dei frammenti generati mediante elettroforesi in gel di poliacrilammide. Ha più vantaggi pratici rispetto a metodo chimico (condizioni meno drastiche, anche DNA ds, + fedele, etc.) Enzimi usati: T7 sequenase, ma anche e sempre più enzimi termostabili tipo PCR

56 Sequenziamento automatico Il metodo di Sanger è rimasto alla base dei protocolli di sequenziamento automatico Enzima DNA stampo dntp ddntp marcati con 4 diversi fluorofori reazione Separazione dei frammenti su singolo capillare di gel abbinato ad un rilevatore di fluorescenza Analisi computerizzata dell elettroferogramma Con un primer si sequenzia regione di bp Processo automatizzato

57 Il sequenziamento automatico è usato per sequenziare interi genomi 1) Frammentazione del genoma e clonaggio in vettori 2) Sequenziamento mediante uno dei seguenti approcci: a) chromosome walking: identificazione di nuovi cloni sovrapposti per ibridazione di cloni già sequenziati b) Shot-gun totale: genoma ricostruito assemblando sequenze sovrapposte di piccoli frammenti casuali c) Shot-gun gerarchico: il genoma è tagliato in grossi frammenti sovrapposti, che vengono ulteriormente tagliati e sequenziati (+ adatto a genomi di grossa taglia)

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59 Oltre a quello umano, sono stati sequenziati o in via di sequenziamneto anche genomi di altre specie, soprattutto procarioti. Ogni singolo genoma è interessante di per sé, ma è utile in particolare ai fini dell analisi comparativa con il genoma umano.

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