Cromatografia liquida ad alta risoluzione HPLC

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1 Cromatografia liquida ad alta risoluzione HPLC

2 LC classica HPLC (fase

3 La moderna cromatografia in fase liquida, confrontata con la tecnica classica, è caratterizzata da: -colonne di diametro Inferiore (da <1 mm a 4,6 mm) -materiale impaccante molto fine (1,8-10 micron) -introduzione di materiali impaccanti sempre più moderni e funzionali - pressioni di ingresso elevate e controllo della velocità di flusso della fase mobile - precisione nell'introduzione del campione in colonna -rivelatori on-line, capaci di lavorare in continuo -maggior sensibilità di rivelazione - analisi rapide - elevata risoluzione -strumentazione automatizzata il flusso della fase mobile viene ottenuto mediante pompa ad alta pressione, che devono garantire una portata perfettamente costante e riproducibile. Rivelatori sensibili permettono di utilizzare questa tecnica in modo molto efficiente sia da un punto di vista quantitativo che qualitativo per un'ampia gamma di applicazioni. All'inizio tale tecnica fu chiamata Cromatografia in fase liquida ad alta pressione o HPLC. Oggi si preferisce chiamare questa tecnica Cromatografia in fase liquida ad elevate prestazioni o Cromatografia liquida ad alta efficienza o Cromatografia liquida ad alta risoluzione

4 LA COLONNA La colonna è l'elemento centrale in HPLC. Il tipo e la natura dei materiali di impaccamento in essa contenuta hanno contribuito al notevole incremento di questa tecnica analitica. La colonna è costituita da un tubo in acciaio che offre un buon equilibrio fra la resistenza alla corrosione, alta pressione, tipologia di impaccamento e costo. In particolari applicazioni, dove è richiesta una elevata inerzia chimica, l interno è rivestito con delle resine (PEEK), o altro materiale inerte, la superficie è perfettamente levigata e con bordi finemente rifiniti. La lunghezza, il diametro interno di una colonna sono il compromesso tra consumo di fase mobile, capacità di carico, velocità della separazione e risoluzione ottenibili. Le classiche dimensioni di una colonna analitica per HPLC sono: 250 mm di lunghezza diametro interno 4,6 mm ed esterno di 6,35 mm. In realtà esistono colonne caratterizzatie da lunghezza, diametri diversi, come riportato in tabella seguente. La scelta della lunghezza e del diametro interno sono dettati da esigenze analitiche tipo: analisi di tracce, metaboliti, analita principale, risparmio di solventi, collegamento con particolari rivelatori, ottenimento di frazioni ecc.

5 Geometrie classiche delle colonne per HPLC Colonna ID (mm) Lunghezza (mm) Grandezza particelle (mm) Preparativa Semipreparativa , 10 Analitica ,150,250 5, 7, 10 Narrow bore ,100,125,150, , 3, 3.5, 5 Microbore ,100,150,250, , 3, 3.5, 5 ID diametro interno

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7 Cromatografia liquida ad alta risoluzione o ad alte prestazioni (HPLC) In un sistema poroso, la velocità di flusso lineare u è data dalla legge di Darcy 1)u = -k DP DP = gradiente di pressione lungo la colonna ή dl dl ή = viscosità della fase mobile k= permeabilità della colonna k=k d 2 p (per la silice k ~10-3 ) La 1) può essere usata trascurando la variazione di viscosità con la pressione e la comprimibilità del liquido (valida fino a 600 atmosfere) u = d 2 p DP DP =ul ή \k d 2 p u=velocità lineare FM ή L 100 atmosfere= 1470 psi= MPa= 1atm=1.013 bar psi=pound\square inch gas liq Coeff. Diffusione= D cm 2 \sec Densità=r g\cm Viscosità= ή = poise=0.1 Pa.sec)

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10 ACN H2O 75:25 Flusso 50 ml\min Riv UV 254 nm N piatti teorici colonna 2*500mm x 1.1 mm; C18 5 mm sferico

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14 Cromatografia di Adsorbimento La fase stazionaria è un solido di granulometria piccola, impaccato in colonna o steso su un supporto (TLC); sulla superficie dei granuli si trovano siti attivi che possono stabilire legami deboli (reversibili!) con le molecole della miscela da separare, quali Van der Waals e legame idrogeno che dipendono dalla natura chimica dell'adsorbente, della fase mobile e degli analiti. La forza di legame di un analita dipende da specifici gruppi funzionali (gruppi OH, aromatici). Cromatografia di adsorbimento può essere gas-solido o liquido-solido a seconda della natura della fase mobile (GC o HPLC). La cromatografia di adsorbimento è utilizzata per separare sostanze neutre polari o non polari, di natura organica, isolubili in H 2 O

15 CROMATOGRAFIA DI ADSORBIMENTO fase mobile (liquido o gas)) siti attivi fase stazionaria (solido) I siti attivi della fase stazionaria solida legano le molecole dei solventi e dei soluti con legami reversibili non polari e polari di forza diversa: 1) forze deboli (tipo Van der Waals) e dipolo istantaneo-dipolo istantaneo per solventi e soluti non polari; 2) dipoli permanenti per solventi e soluti polari; 3) legami H per molecole con H su eteroatomi (N, O, F); 4) interazioni dielettriche per solventi polarizzabili.

16 MICROPARTICELLE SFERICHE DI SILICE POROSA 16

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18 CROMATOGRAFIA DI ADSORBIMENTO (LSC) FF= adsorbente solido FM =liquido o gas GC TLC HPLC Fasi fisse: Allumina (Al 2 O 3 ) Gel di Silice (SiO 2 ) più o meno idratata Carbonato e ossidi di Ca e Mg, Na, K (CaCO 3 e MgCO 3, CaO, MgO.) Attivo (forte ads) Carbone C grafitato Amido, zucchero, cellulosa

19 Proprietà degli adsorbenti 1)diametro delle particelle 2) area superficiale 3) diametro dei pori 4)porosità 5)attività 6) isoterme di adsorbimento 1) diametro delle particelle Sono in polvere per poterli usare è necessaria setacciatura granulometria è misurata in mesh cioè maglia per pollice (inch) Mesh=n maglie\ pollice (~2.5 cm) Se in un pollice ho 100 maglie ho 100 mesh > il n di mesh e < la granulometria (es: grossi setacci mesh, piccoli 300 mesh) vedi fig

20 Diametro mm

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24 STRUTTURA CHIMICA DELLA SILICE legami idrogeno gruppi ossidrilici isolati gruppi silossanici 24

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36 CARATTERISTICHE DELLA FASE MOBILE Deve fornire un adeguato valore k Deve eluire gli analiti come bande strette e gaussiane Non deve interferire con la stabilità degli analiti Non deve interferire con la rivelabilità degli analiti

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