Ibridazione degli acidi nucleici

Transcript

1 Ibridazione degli acidi nucleici L ibridazione consiste nel porre a contatto acidi nucleici a singolo filamento provenienti da fonti diverse: Sonda di solito una popolazione omogenea di molecole note. Bersaglio di solito una miscela complessa ed eterogenea di acidi nucleici. Se sonda e bersaglio sono molecole a doppio filamento è necessario provvedere alla loro denaturazione mediante trattamento termico o alcalino. I parametri che determinano la temperatura di fusione (Melting) della doppia elica, cioè il passaggio da una struttura a doppia elica a quella a singolo filamento sono: Lunghezza del filamento. Composizione di basi (%GC). Ambiente chimico cationi ionici monovalenti (Na + ) stabilizzano la doppia elica mentre denaturanti chimici (formammide, urea) la destabilizzano. Il DNA genomico di mammifero (GC circa 40%) si denatura a T m 87 C.

2

3 Come favorire la formazione di heteroduplex sonda-bersaglio La cinetica di riassociazione descrive la velocità con cui una sequenza a singolo filamento è capace di trovare il filamento complementare. Concentrazione di partenza della specifica sequenza (C o ). Durata della reazione in secondi (T). C o T è un unità che utilmente descrive la reazione d ibridazione I parametri che entrano i gioco sono: Temperatura (in genere T m della sonda 20 C) Forza ionica del mezzo (concentrazione salina) Presenza di agenti chimici denaturanti Variando opportunamente i diversi parametri è possibile modificare la stringenza delle condizioni d ibridazione. Normalmente l acido nucleico bersaglio è presente in largo eccesso rispetto alla sonda.

4

5 Saggi d ibridazione degli acidi nucleici Standard assays Labeled probe in solution Unlabeled target bound to solid support Dot-blot (Figure 5.11) Southern blot (Figures 5.12, 5.16) Northern blot (Figure 5.13) Chromosome in situ hybridization (Section 5.3.4; Figure 10.5) Tissue in situ hybridization (Figure 5.17) Colony blot (Figure 5.18) Plaque lift (Section 5.4.1) Gridded clone hybridization assay (Figure 5.19) Any labeled DNA or RNA but often an oligonucleotide Any Any Usually a labeled genomic clone Usually a labeled antisense riboprobe or oligonucleotide Any Any Any Complex DNA or RNA population; not size-fractionated, but spotted directly onto membrane Often complex genomic DNA (but may be individual DNA clones); digested with restriction nuclease and size fractionated, then transferred to membrane Complex RNA population (e.g. total cellular RNA or poly A+ RNA) which has been size-fractionated, then transferred to membrane DNA within chromosomes (often metaphase) of lysed cells on a microscope slide RNA within cells of fixed tissue sections on a microscope slide Cell colonies separated after plating out on agar then transferred to membrane Phage-infected bacterial colonies separated after plating out on agar and transferred to membrane Clones robotically spotted onto membrane in geometric arrays Reverse assays Labeled target in solution Unlabeled probes bound to solid support Reverse dot-blot Complex DNA Oligonucleotides spotted onto membrane DNA microarray (Figures 5.20A and 20.6A) Complex DNA DNA clones robotically spotted onto microscope slide Oligonucleotide microarray (Figures 5.20B and 20.6B) Complex DNA Oligonucleotides synthesized on glass

6 Dot Blot con sonde ASO (Allele Specific Oligonucleotide)

7 Southern Blot

8

9 Southern blot per identificare mutazioni che modificano un sito per un enzima di restrizione

10 ZOO Blot

11 Northern Blot

12 Ibridazione in situ dei cromosomi (FISH) Una sonda opportunamente marcata, in genere con un fluoroforo, può essere utilizzata per ibridare direttamente i cromosomi. Si utilizzano linee cellulari linfoblastoidi ottenute da sangue periferico o altri tipi cellulari (amniociti in diagnosi prenatale). Le cellule sono bloccate in metafase mediante trattamento con colchicina. Il trattamento con RNasi e proteinchinasi K consente di ottenere DNA cromosomico parzialmente purificato, denaturato poi con formammide. Il vetrino è poi ibridato con la sonda specifica, lavato nelle opportune condizioni di stringenza e analizzato al microscopio.

13

14 Parziale trisomia del Chr 2 A. Cariotipo con tecnica classica B. M-FISH C. Rx-FISH

15 Ibridazione in situ dei tessuti Una sonda opportunamente marcata, in genere una sonda a RNA (ribosonda), può essere utilizzata per ibridare direttamente sezioni di tessuti od organi al fine di valutare l espressione di un determinato gene. La sonda deve essere complementare all mrna, si utilizza quindi una sonda antisenso. In genere la sonda senso viene comunque utilizzata come controllo negativo (non dà segnale d ibridazione). Le sezioni di tessuto sono opportunamente trattate per stabilizzare l mrna e denaturarlo. Il vetrino è poi ibridato con la sonda specifica, lavato nelle opportune condizioni di stringenza e analizzato al microscopio.

16 Embrione di topo (13d) Sonda b-miosina Forte espressione nei ventricoli cardiaci

17 Screening di librerie e Colony Lift Assay

18 DNA microarray I DNA microarray (DNA chip) rappresentano l ultima innovazione nell ambito delle tecniche d ibridazione. Microarray di cloni di DNA, in cui cloni di DNA noti sono micropipettati sulla superficie del vetrino. Microarray di oligonucleotidi, in cui specifiche sequenze oligonucleotidiche vengono fissate o sintetizzate (Affimetrix) sulla superficie del vetrino In questo caso si tratta di tecniche d ibridazione inversa in cui la sonda, non marcata, è legata al supporto ed è la mistura complessa di molecole di DNA ad essere marcata ed ibridata al supporto. I campi applicativi sono molteplici ed aumentano in funzione della sempre maggiore miniaturizzazione (Chip di 1.28X1.28 cm possono contenere fino a oligonucleotidi). Analisi d espressione Analisi genomica (array-cgh) SNPs genotyping

19

20

21

22 Array-based Comparative Genomic Hybridization (array- CGH) Delezioni e duplicazioni submicroscopiche (~100 Kb -10 Mb) costituiscono più del 15% delle mutazioni osservate per malattie monogeniche. L array-cgh consente di analizzare efficientemente questo tipo di alterazioni cromosomiche. Rispetto al CGH convenzionale su cromosomi metafasici, i principali vantaggi sono: Più alta risoluzione (~100 Kb) La possibilità di ricondurre immediatamente l alterazione osservata ad una precisa regione/sequenza del cromosoma.

23

24

25

26 Polymerase chain reaction (PCR) La reazione a catena della polimerasi (PCR) ha di fatto rivoluzionato la genetica molecolare, con la possibilità di analizzare e clonare velocemente il DNA. E un metodo in vitro molto versatile per amplificare determinate sequenze bersaglio presenti in campioni di DNA. Sono necessarie informazioni sulla sequenza del DNA bersaglio, almeno per consentire il disegno della coppia di primers specifica da utilizzare nella reazione di amplificazione. Kary B. Mullis (USA) Nobel Prize in 1993 for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) method

27

28 Cosa ha reso la PCR così facilmente accessibile? La disponibilità di DNA polimerasi termostabili. Taq DNA polimerasi (estratta da Thermus aquaticus). L ingegnerizzazione di termociclatori capaci gestire velocemente e con elevata precisione i cambi di temperatura che caratterizzano il processo di amplificazione.

29 Scelta dei primers Il disegno della coppia di primers è molto importante per la buona riuscita della PCR. Sono disponibili supporti bioinformatici che aiutano nella selezione. On-line PRIMER3: cgi

30 Specificità della reazione di PCR Nested PCR - l utilizzo di primers interni a quelli utilizzati in una precedente amplificazione può garantire la specificità del prodotto Hot-Start PCR si creano le condizioni per una partenza a caldo della reazione limitando la formazione di prodotti aspecifici Touch-down PCR il termociclatore gestisce la temperatura di annealing, decrementandola ad ogni ciclo in un range definito. E possibile così selezionare il prodotto specifico. Gradient PCR il termociclatore può gestire contemporaneamente diverse temperature di annealing, consentendo una precisa ottimizzazione delle condizioni di amplificazione.

31 Vantaggi e Svantaggi della PCR Velocità e semplicità. Sensibilità Duttilità Necessità di informazioni sulla sequenza bersaglio Dimensioni ridotte del prodotto di PCR Imprecisione della replicazione del DNA

32

33 Genotyping mediante PCR (1)

34 Genotyping mediante PCR (2)

35 STR polimorfici

36 Analisi di Linkage

37 Test genetico d identità personale

38 Esempio di referto RISULTATO (in grassetto si evidenziano i marcatori paterni condivisi dal figlio) Marcatore - cromosoma Padre Figlio Madre D8S1179 crom. 8(q24.13) 13/13 13/14 14/15 D21S11 crom 21( q21.1) 29.2/ / /32 D7S820- crom 7(q21.11) 8/10 8/11 11/11 CSF1PO crom. 5(q32) 11/12 11/12 10/12 D3S1358 crom. 3(p21.31) 15/17 15/ /16.2 TH01- crom 11(p15.5) 5.3/ / /9.3 D16S539 crom. 16(q24.1) 8/10 10/10 10/11 D2S1338 crom. 2(q35) 17/17 17/23 17/23 D19S433 crom. 19 (q12) 12/ / /13.2 vwa- crom. 12(p13.31) 15.2/ /16 16/17 TPOX- crom. 2(p25.3) 9/11 7/11 7/9 D5S818- crom. 5(q23.2) 7/11 7/13 13/13 FGA crom. 4(q31.3) 20.2/ / /25.2 CONCLUSIONI:. Dall analisi del DNA emerge una ATTRIBUZIONE della paternità di con una probabilità di paternità maggiore del 99,99%. Questo indica una paternità praticamente provata.