Spettrofotometria e analisi di amminoacidi. Quantizzazione di proteine e di miscele di amminoacidi

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1 Spettrofotometria e analisi di amminoacidi Quantizzazione di proteine e di miscele di amminoacidi

2 Assorbimento della luce ONDE ELETTROMAGNETICHE La radiazione elettromagnetica è, dal punto di vista dell'elettromagnetismo classico, un fenomeno ondulatorio dovuto alla contemporanea propagazione di perturbazioni periodiche di un campo elettrico e di un campo magnetico, oscillanti in piani tra di loro ortogonali. E = h ν = h c/ λ h= costante di Plank E= Energia ν = Frequenza = numero di onde che passano in punto per unità di tempo λ= Lunghezza d onda (A = Angstrom = m = 0,1 nm; nm = 10-9 m; µm = 10-6 m) 1/λ= λ -1 = Numero d onda c = velocità di propagazione (3 x cm /sec 2 )

3 SPETTRO ELETTROMAGNETICO 700 nm 340 nm Bassa energia (.calore) Alta energia (danneggiano le macromolecole

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5 FOTOMETRIA L. incidente L. trasmessa Tra 0 e 100% Da 0 ad infinito

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10 La proprietà di assorbimento della luce UV da parte di Triptofano, Tirosina e Fenilalanina è particolarmente utile per il riconoscimento e la determinazione quantitativa delle proteine mediante l utilizzo dello SPETTROFOTOMETRO

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13 Il massimo dell assorbimento dipende dai gruppi funzionali presenti nelle molecole e da lo SPETTRO DI ASSORBIMENTO

14 ASSORBIMENTO DELLA LUCE ULTRAVIOLETTA DA PARTE DEGLI Aa AROMATICI Il triptofano e la tirosina Assorbono la luce ultravioletta, ciò spiega perché la maggior parte delle proteine hanno un caratteristico assorbimento della luce ad una lunghezza d onda di 280 nm

15 Assorbimento di una proteina Assorbimento di un acido nucleico

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17 Emoglobina

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19 L assorbimento di luce ad una qualunque lunghezza d onda può essere messo in relazione con la concentrazione della sostanza assorbente mediante la RELAZIONE DI LAMBERT E BEER A = ε c l A = assorbimento ad una determinata lunghezza d onda; c = concentrazione della sostanza espressa in moli per litro di soluzione; l = lunghezza del cammino ottico espressa in cm; ε = coefficiente di estinzione molare (assorbimento di una soluzione 1M del composto in esame, quando questa è attraversata per 1 cm dalla luce incidente). (dipende da λ) Da 0 ad infinito

20 Devo sapere epsilon, che è caratteristica per ogni (macro)molecola Se non conosco epson, posso usare per determinare la concentrazione di una proteina la spettrofotometria ma con una proteina di riferimento a quantità nota, da usare come standard

21 Metodo colorimetrico Coloranti che interagiscono con le proteine e danno una risposta immediata

22 Metodo del biureto. Il metodo del biureto si basa sulla capacità degli ioni Cu +2 di interagire con le proteine e formare dei complessi con l azoto del legame peptidico. Tali complessi producono un colore blu che può essere misurato a 550 nm. Il reattivo del biureto consiste di una soluzione alcalina di solfato di rame (CuSO 4 ). La reazione del biureto è data da tutti i composti che contengono almeno due gruppi peptidici (-CO-NH-) legati fra loro o direttamente, o per mezzo di un atomo di carbonio (peptidi, proteine) o per mezzo di un atomo di azoto, come nel caso del biureto (H 2 N-CO-NH-CO-NH 2 ).

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24 Con tale metodo gli ione Rame in ambiente basico che interagiscono con i gruppi NH-dei legami peptidici che vengono successivamente chelanti dal reattivo

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29 Analisi di amminoacidi Composizione in amminoacidi di proteine e/o alimenti

30 Struttura e ph

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32 punto isoelettrico, pi ph al quale gli aa presentano carica netta uguale a zero dipende per ogni amminoacido dalla catena laterale per gli aa acidi tale valore è ~ 3 per gli amminoacidi basici ~9. per gli aa neutri varia tra ~ 5 e ~ 6.

33 Determinazione della composizione amminoacidica - Sistemi con derivatizzazione post-colonna Cromatografia a scambio ionico e colorazione con ninidrina - Sistemi con derivatizzazione pre-colonna - Sistemi con derivatizzazione pre-colonna Cromatografia a fase inversa ad alta pressione (RP- HPLC) - 1 fluoro-2,4 dinitrobenzene - dansil cloruro - Isotiocianato - ortoftalaldeide

34 Cromatografia a scambio ionico in generale Sfrutta la forza d attrazione tra molecole di carica opposta. Le colonne sono impaccate con una matrice su cui si blocca una fase stazionaria carica (-o +). Variando il ph dell eluente eluente o la forza ionica si altera l equilibrio ottenuto e si può provocare il distacco degli analiti. In questa tecnica sono importanti quindi il ph, la forza ionica e la carica del campione. Le migliori separazioni si ottengono con eluizioni a gradiente si forza ionica o con step di ph.

35 Il principio della cromatografia a scambio ionico degli amminoacidi - Resina: Polistirene/divinil benzene - Gruppo carico presente sulla resina: gruppo solfonico: -SO 3 -

36 Il principio della cromatografia a scambio ionico L aggiunta si fa a ph acido, 2,2. TUTTI gli amminoacidi hanno carica positiva e si legano. -Aumento di forza ionica; -Aumento di ph; -Aumento di temperatura. Gli amminoacidi vengono eluiti; Colorati con ninidrina; -Lettura dell assorbimento a 570/420 nm; Integrazione dei picchi; Registrazione; Cromatogramma.

37 La resina + In H 2 SO 4

38 Analizzatore di amminoacidi Separa gli amminoacidi in base alla carica (scambio cationico) e presenta in successione rivelazione post-colonna con ninidrina nello spettro del visibile

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40 Analizzatore di amminoacidi Schema a blocchi Sistema tamponi Ninidrina Colonna a scambio ionico Reattore (a 100/130 C) Registratore Sistema di integrazione Fotometro

41 Ninidrina Gli amminoacidi si colorano in violetto (570 nm); Gli imminoacidi si colorano in giallo (412 nm Composto di Reuman

42 Determinazione della composizione di aa Separazione dell idrolizzato tramite cromotagrafia a scambio cationico su resina di polivinilbenzene solfonato Rivelazione post-colonna con ninidrina [colore violetto a 570 nm, colore giallo a 440 nm per gli imminoacidi (es. prolina)] La quantità degli amminoacidi è proporzionata all assorbimentoassorbimento Comparazione dell idrolizzato con una miscela di aa standard Si rivelano microgrammi di amminoacidi

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44 -Variazione di forza ionica - Variazione di ph - Variazione di temperatura

45 Dansil cloruro 2,4-dinitro-fluorobenzene (reagente di Sanger) Reagenti per il gruppo N-terminale Fenilisotiocianato ortoftalaldeide

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47 Fenilisotiocianato

48 Determinazione della composizione di aa proteici Estrazione da matrice delle proteine Idrolisi acida in 6M HCl a 110 C C per 24 o per 72 ore (idrolisi del legame peptidico) Separazione dell idrolizzato tramite cromotagrafia Rivelazione post-colonna con ninidrina Comparazione dell idrolizzato con una miscela di aa standard La quantità degli amminoacidi è proporzionata all assorbimentoassorbimento

49 Considerazioni Vari protocolli di estrazione Vari procedimenti per preservare amminoacidi che nelle condizioni di idrolisi vanno incontro a degradazione (Ser, Thr, Met ecc) Asparagina e Glutammina si trasformano in ambiente acido negli aa acidi corrispondenti Degradazione del Triptofano

50 Tali analisi possono dare informazioni su: 1. Struttura e caratterizzazione di proteine (composizione in aa); 2. Informazioni sulle caratteristiche di determinati alimenti o tessuti; 3. Qualità proteica per stabilire il valore nutrizionale degli alimenti; 4. Informazioni su cosa succede a prodotti alimentari sottoposti a procedimenti termici (furosina.); 5. ecc

51 Amminoacidi essenziali Treonina (Thr) Lisina (Lys) Valina (Val) Fenilalanina (Phe) Triptofano (Trp) Metionina (Met) Leucina (Leu) Isoleucina (Ile) Istidina * (His)

52 Determinazione della composizione di aa liberi Estrazione dalla matrice degli amminoacidi liberi Separazione dell idrolizzato tramite cromotagrafia Rivelazione post-colonna con ninidrina Comparazione dell idrolizzato con una miscela di aa standard La quantità degli amminoacidi è proporzionata all assorbimentoassorbimento

53 Profilo cromatografico di una separazione di aa fisiologici utilizzando Litio Citrato

54 Considerazioni Estrazione Non vi è l idrolisi per liberare gli amminoacidi proteici Asparagina e Glutammina e molti amminoacidi rari o non presenti in proteine sono rilevabili Utilizzo di un analizzatore di amminoacidi per separazione di amminoacidi fisiologici (usa Litio Citrato..)

55 Fenilchetonuria Gli alimenti presentano la maggior parte degli amminoacidi, tra cui è presente la fenilalanina. Tale amminoacido viene in parte utilizzato metabolicamente dopo che l organismo la trasforma in tirosina Nei pazienti con tale patologia non vi è questa via metabolica e si ha accumulo di Phe. Vanno eliminate dalla dieta pietanze ricche in Phe

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57 Tali analisi possono dare informazioni su: 1.Presenza di amminoacidi modificati 2.Problemi di metabolismo alimentare o di vie metaboliche (disfunzioni..) 3.Qualità alimentare 4.Studi di sistematica molecolare 5.ecc

58 Un altro aspetto importante da considerare per la corretta interpretazione delle analisi amminoacidiche è lo standard interno. Standard interno: sostanza (nor-leucina) con caratteristiche chimico-fisiche simili agli analiti (aa) da separare. Viene aggiunto all inizio del processo di estrazione e subisce gli stessi trattamenti degli amminoacidi. Mediante lo Standard interno, in aggiunta alle informazioni qualitative dei campioni si possono fare analisi quantitative corrette, ottenendo informazioni sulla resa del processo di estrazione, idrolisi ecc nor Leucine

59 Valore nutrizionale delle proteine: La qualità proteica Composizione ideale in aa essenziali di una proteina alimenare secondo vari autori (mg/g di proteina) Amminoacido MIT* Millward** FAO/WHO/UNU*** FNB/IOM**** Istidina Isoleucina Leucina Lisina Metionina cisteina Fenilalanina+ tirosina Treonina Triptofano Valina * Young e Pellet, 1990 ** Millward et al., 1990 *** FAO/WHO/UNU, 1995 **** Food and Nutrition Board, 2002 Analizzando l amminoacido limitante in riferimento ai valori in Tabella si ritrova il Punteggio chimico, si ha cento per una proteina ideale contenente la quantità di aa in Tabella

60 Le proteine del grano hanno una qualità piuttosto bassa, sia come profilo aminoacidico che come assimilazione. Questo perché il profilo amminoacidico delle proteine del grano è abbastanza diverso da quello delle proteine umane, in particolare è carente dilisina, l'amminoacido limitante delle proteine di tutti i cereali, frumento incluso. Questo, si badi bene, non significa che le proteine del grano non vengono assimilate, ma semplicemente che su 100 g di proteine, ne vengono utilizzate a scopo plastico solo una parte (circa la metà). Le proteine dei cereali possono essere complementate conquelle dei legumi,in proporzione 1:1, ottenendo una proteina di qualità comparabile a quella della carne. Infatti l'aminoacido limitante delle proteine dei legumi è la metionina, di cui al contrario i cereali sono ricchi; e viceversa i legumi sono ricchi di lisina, che come abbiamo visto è carente nei cereali. Per ottenere un pasto 100% vegetale ma ricco di proteine di elevata qualità, basta associare una quantità di legumi e prodotti a base di grano tale per cui il contenuto di proteine dell'uno e dell'altro alimento siano equivalenti.