L ANEMIA EMOLITICA AUTOIMMUNE IL RUOLO DEL LABORATORIO DI IMMUNOEMATOLOGIA
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1 L ANEMIA EMOLITICA AUTOIMMUNE IL RUOLO DEL LABORATORIO DI IMMUNOEMATOLOGIA Sabrina Genesini Dipartimento Interaziendale di Medicina Trasfusionale Azienda Ospedaliera Universitaria Integrata - Verona
2 Definizione L Anemia Emolitica Autoimmune (AEA) comprende un gruppo eterogeneo di condizioni morbose caratterizzate da una accelerata distruzione dei globuli rossi secondaria alla presenza di autoanticorpi diretti contro antigeni eritrocitari e da un quadro clinico di emolisi variabile. Dal punto di vista clinico è possibile distinguere forme idiopatiche e forme secondarie, con andamento acuto o cronico. Epidemiologia L AEA è relativamente rara, con un incidenza di 1-3 casi per persone/anno. Può insorgere a qualunque età con picco di incidenza tra la 3 a -4 a decade per le forme idiopatiche. Le forme secondarie presentano una distribuzione legata alla malattia sottostante. L incidenza può giungere a casi per /anno dopo l 8 a decade. Prognosi Nella maggior parte dei casi la diagnosi e la terapia sono semplici e la prognosi è favorevole. Esistono tuttavia casi di difficile diagnosi e refrattari alle terapie standard.
3 Classificazione 1. Anemia Emolitica Autoimmune da autoanticorpi caldi (WAIHA) Idiopatica Secondaria: linfoma, leucemia linfatica cronica, hairy cell leukemia, lupus eritematoso sistemico, altri disordini autoimmuni, tumori ovarici, disordini infiammatori cronici, dopo trapianto di cellule staminali, di cuore, di altri organi solidi 2. Anemia Emolitica Autoimmune da autoanticorpi freddi Sindrome da agglutinine fredde (CAS) Idiopatica Secondaria transitoria: mycoplamsma pneumoniae, mononucleosi infettiva, altre infezioni Secondaria cronica: malattie linfoproliferative Emoglobinuria parossistica a frigore (PCH) Idiopatica Secondaria: infezioni virali ed altre infezioni, sifilide 3. Anemia Emolitica Autoimmune di tipo misto (Mixed-Type AIHA) WAIHA= warm autoimmune hemolytic anemia; CAS= cold agglutinin syndrome; PCH= paroxysmal cold hemoglobinuria
4 ASPETTI PATOGENETICI AUTOANTICORPI CALDI Sensibilizzazione; no attivazione complemento Rimozione prevalentemente splenica GR sensibilizzati da IgG: rimossi prevalentemente nella milza (cellule del SRE con recettori Fc) Sensibilizzazione; attivazione del complemento fino a C3 Rimozione splenica ed epatica GR sensibilizzati da IgG e C3b: rimossi prevalentemente nella milza e in parte nel fegato (cellule del SRE con recettori C3) EMOLISI EXTRAVASCOLARE/INTRAVASCOLARE Macrofagi: specifici recettori di membrana per Fc delle IgG di sottoclasse IgG1 e IgG3 Emolisi extravascolare: tipo e quantità di IgG legati ai GR; eventuale presenza di C3b Emolisi intravascolare: se attivazione completa dalla cascata del complemento Entità emolisi variabile: da inapparente fino a 0,25 ml di GR/Kg peso corporeo per ora
5 ASPETTI PATOGENETICI AUTOANTICORPI FREDDI Emolisi extravascolare GR sensibilizzati da C3b: rimossi prevalentemente nel fegato (cellule del SRE con recettori C3) Emolisi intravascolare Attivazione completa cascata complemento: rottura GR (all interno dei vasi sanguigni) EMOLISI INTRAVASCOLARE/EXTRAVASCOLARE IgM: potenziale emolitico legato a titolo e ampiezza termica C (vasi estremità distali): legame IgM a GR, fissazione e attivazione complemento 37 C (temperatura corporea): dissociazione IgM da GR, continua attivazione complemento Emolisi extravascolare: GR sensibilizzati da C3b: rimossi prevalentemente dal fegato Emolisi intravascolare: se attivazione complemento fino a complesso litico Entità emolisi variabile: da inapparente fino a 200 ml di GR/ora
6 ASPETTI PATOGENETICI EMOLISINA BIFASICA DI DONATH LANDSTEINER Emolisi extravascolare GR sensibilizzati da C3b: rimossi prevalentemente nel fegato (cellule del SRE con recettori C3) Emolisi intravascolare Attivazione completa cascata complemento: rottura GR (All interno dei vasi sanguigni) EMOLISI INTRAVASCOLARE/EXTRAVASCOLARE Autoemolisina di Donath Landsteiner: IgG che reagisce con GR a basse temperature 20 C (vasi estremità distali in ambiente freddo): legame IgG a GR, fissazione complemento 37 C (temperatura corporea): progressione attivazione complemento Emolisi extravascolare: GR sensibilizzati da C3b: rimossi da milza e fegato Emolisi intravascolare: se attivazione complemento fino a complesso litico Emolisina bifasica: in vitro emolisi solo se incubazione a 4 C è seguita da incubazione a37 C
7 CARATTERISTICHE SIEROLOGICHE ANEMIA EMOLITICA AUTOIMMUNE DA AUTOANTICORPI CALDI Epidemiologia Decorso clinico Classe Ig TAD Eluato Siero Specificità 48 70% dei casi. Età: picco anni. Sesso: > donne Anemia cronica lieve, anemia moderata o severa, emolisi fulminante IgG (IgG 3, IgG 1 ); raramente IgA o IgM IgG: 20-66% IgG + C3d: 24-63% C3d: 7-14% Reattivo (nei casi di TAD positivo per IgG) 57%: TAI positivo in provetta 90%: TAI positivo in schedina 90%: agglutinazione a 37 C emazie trattate con enzimi 13%: emolisi in vitro a 37 C emazie trattate con enzimi Apparente panreattività nei test di routine Antigeni ad alta frequenza nell ambito del sistema Rh o RHA Apparente specificità per singoli antigeni Rh (C-c-E-e) o Kell Apparente specificità per antigeni pubblici (Ge, Wr b, U)
8 CARATTERISTICHE SIEROLOGICHE MALATTIA EMOLITICA AUTOIMMUNE DA AGGLUTININE FREDDE Epidemiologia Decorso clinico Classe Ig 16 32%. Età: variabile. Spesso associata a malattie infettive, autoimmuni, neoplastiche Forma acuta: Micoplasma pneumoniae, mononucleosi infettiva. Autolimitante, raramente emolisi Forma cronica: Idiopatica o associata a disordini linfoproliferativi. Anemia cronica mediamente grave. Anemia esacerbata dall esposizione al freddo. Acrocianosi IgM (policlonale o monoclonale). IgG IgA: rarissime eccezioni TAD C3d: 91-98% Eluato Siero Specificità Non reattivo Agglutinazione: 100% a 4 C in soluzione salina, rara a temperatura > 32 C Titolo: > 1.000; raramente titoli inferiori Emolisi in vitro: rara a C con emazie non trattate, più comune con emazie trattate con enzima Spesso : anti I, anti HI Raramente: anti i (in genere associate a mononucleosi) Occasionalmente anti Pr o altre specificità
9 CARATTERISTICHE SIEROLOGICHE EMOGLOBINURIA PAROSSISTICA A FRIGORE Epidemiologia Decorso clinico Classe Ig Descritta in passato in associazione alla sifilide. Si osserva attualmente nei bambini in seguito a infezioni virali Crisi scatenate dall esposizione al freddo: emolisi, brividi, febbre, fenomeni vasomotori, orticaria, dolori al dorso, agli arti inferiori, all addome, cefalea Risoluzione rapida nelle forme post-infettive Risponde alla terapia antiluetica nelle forme secondarie a sifilide. Scarsa risposta ai trattamenti nei casi idiopatici IgG: emolisina bifasica TAD C3d: % Eluato Siero Specificità Non reattivo Raramente agglutinazione a 4 C. No agglutinazione a 37 C Test di Donath Landsteiner: anti P Incubazione di siero ed emazie test a 0-4 C; incubazione di siero ed emazie test a 37 C Assenza di emolisi dopo la prima incubazione; presenza di emolisi dopo la seconda incubazione
10 CARATTERISTICHE SIEROLOGICHE ANEMIA EMOLITICA AUTOIMMUNE DI TIPO MISTO Epidemiologia Decorso clinico Classe Ig TAD Eluato Siero Specificità 7 8%. Prevalente negli anziani Può dare quadri severi WAIHA + CAS: autoanticorpi caldi (IgG) + autoanticorpi freddi (IgM) ad alto titolo Vera forma mista: autoanticorpi caldi (IgG) + autoanticorpi freddi (IgM) a basso titolo (< 64 a 4 C) ed elevata ampiezza termica IgG + IgM IgG + C3d Reattivo se presenza di IgG sulle emazie Agglutinazione a 4 C di emazie in salina Agglutinazione a 20 C di emazie in salina Titolo: < 64 a 4 C; ± simile a C (nella vera forma mista) TAI positivo (utilizzare siero anti IgG) Reattività maggiore con albumina o altri potenzianti Maggior parte dei casi: non determinabile (nella vera forma mista) Talora combinazione di autoanticorpi caldi + freddi
11 CARATTERISTICHE SIEROLOGICHE ANEMIA EMOLITICA AUTOIMMUNE TAD NEGATIVA Epidemiologia Decorso clinico 2 4% dei casi Quadro clinico-laboratoristico compatibile con AEA da autoanticorpi caldi Risposta alla terapia steroidea TAD negativo Autoanticorpo di classe IgA o IgM monomero Se non attivanti il complemento Autoanticorpo a bassa affinità per l antigene Cause negatività TAD Rapida dissociazione dell anticorpo nelle procedure in vitro Basso numero di autoanticorpi adesi alle emazie Numero di molecole anticorpali per globulo rosso < 100 Depressione dell antigene Depressione di antigeni Kell, Rh, LW, Ge, Sc, Lu, ecc. TAD negativo con presenza di anticorpi nel siero
12 ASPETTI CLINICO-LABORATORISTICI AEA calde AEA fredde AEA TAD negative % su totale casi Hb (g/dl) 7.0 ( ) 10.3 ( ) 8 ( ) Reticolociti % 10.6 (0.7-30) 4.5 (1.0-10) 11.9 (1.0-55) LDH (U/L) 770 ( ) 617 ( ) 1316 ( ) Bilirubina ind. (mg/dl) 2.8 ( ) 1.5 ( ) 3.2 ( ) *Barcellini W et al. Anemie emolitiche autoimmuni. Diagnosi e terapia. OCD News N Segnalazioni in letteratura di AEA fatali Nowak-Wegrzyn. J PediatricHematolOncol. 2001; 23: Mianwaring. Br J Haematol. 2000; 109; Friedman. J Pediatric Hematol Oncol. 1998; 20: Keung: Bone Marrow Transplant. 1997; 20: Garatty. Vox Sanguinis 1997; 72: Tertian. Haematol Cell Ther. 1996; 38:
13 APPROCCIO DIAGNOSTICO PARAMETRI CLINICI E LABORATORISTICI Parametri di laboratorio: indici di emolisi Diagnosi attuale e dati anamnestici generali Modalità di esordio della crisi emolitica Recente somministrazione di farmaci Trapianto di cellule staminali emopoietiche Trapianti d organo Recenti trasfusioni di sangue Recente infusione di emoderivati SCHEDA RACCOLTA DATI Cognome Nome Data nascita Reparto Nosografica Data prelievo Diagnosi Hb g/l Htc % GR /µl GB / µl Piastrine / µl Reticolociti /% Bilirubina ind. mg/ml LDH u/l Aptoglobina mg/ml Farmaci assunti Trasfusioni data dell ultima tipo di emocomponente Reazioni trasfusionali Emoderivati Gravidanza Trapianti Altro numero data ultima se gravidanza: settimana gestazione tipo data
14 APPROCCIO DIAGNOSTICO CAMPIONI DI SANGUE RICHIESTI AL REPARTO 2 provette da 6 ml di sangue in EDTA 2 provette da 6 ml di sangue senza anticoagulante Eseguire i prelievi strettamente a caldo (salvo differenti accordi) Mantenere i prelievi in termostato a 37 C fino al momento di invio al SIT L esame deve essere prenotato telefonando al S. Trasfusionale (salvo situazioni urgenti) I campioni devono essere inviati al S. Trasfusionale entro le ore 8,30 del giorno stabilito TRATTAMENTO DEI CAMPIONI PRESSO IL SIT SOSPETTA AEA DA AUTOANTICORPI CALDI Non sono previsti trattamento specifici SOSPETTA AEA DA AUTOANTICORPI FREDDI Mantenere i campioni in termostato a 37 C Procedere a separazione di siero e plasma a 37 C Esecuzione TAI: preriscaldare siero paziente (37 C) ed emazie test (37 C)
15 INDAGINI IMMUNOEMATOLOGICHE TEST ANTIGLOBULINA DIRETTO IgG ± C3d anticorpi adesi alle emazie in vivo Lavaggio delle emazie con soluzione salina Sospensione delle emazie in soluzione salina Aggiunta del siero antiglobulina anti IgG-C3d Formazione di ponti tra i globuli rossi ti Igg + C3d Centrifugazione, lettura macroscopica, microscopica Se positivo: ripetizione con sieri monospecifici anti IgG e anti C3d
16 INDAGINI IMMUNOEMATOLOGICHE TEST ANTIGLOBULINA DIRETTO POLISPECIFICO POSITIVO NEGATIVO TAD monospefici Anti IgG e C3d Causa di emolisi identificata? POSITIVO IgG ± C3d POSITIVO solo C3d SI NO ELUATO STOP STOP TAD 2 LIVELLO
17 INDAGINI IMMUNOEMATOLOGICHE TEST ANTIGLOBULINA DIRETTO TAD FALSO NEGATIVO TAD FALSO POSITIVO Autoanticorpo di classe IgA o IgM monomero Ricorso a sieri monospecifici anti IgA o IgM Autoanticorpo a bassa affinità per l antigene Lavaggio delle emazie con soluzione salina a 2-4 C Lavaggio delle emazie con soluzione a bassa forza ionica a 2-4 C Basso numero di autoanticorpi adesi alle emazie Esecuzione del TAD con metodi più sensibili Eluizione e ricerca dell anticorpo nell eluato con mezzi potenzianti Reazione emolitica trasfusionale Anticorpi acquisiti passivamente Trasfusioni di plasma, infusione di plasmaderivati, IVIG Adsorbimento aspecifico proteine circolanti Ipergammagloblulinemia, alterazioni della membrana eritrocitaria Attivazione del complemento Infezioni batteriche, alloanticorpi Anticorpi farmaco-indotti Anticorpi prodotti da linfociti passenger Trapianto di cellule emopoietiche, trapianto d organo
18 INDAGINI IMMUNOEMATOLOGICHE RICERCA ANTICORPI NEL SIERO TEST ANTIGLOBULINA INDIRETTO Evidenzia la presenza di anticorpi incompleti liberi nel siero Siero in esame + emazie test; incubazione a 37 C per min Centrifugazione, lettura macroscopica, microscopica Lavaggio delle emazie con soluzione salina Sospensione delle emazie in soluzione salina Aggiunta del siero antiglobulina anti IgG-C3d Formazione di ponti tra i globuli rossi Centrifugazione, lettura macroscopica, microscopica Se positivo: identificazione specificità anticorpale TEST IN SALINA IN PROVETTA Evidenzia la presenza di anticorpi completi liberi nel siero Siero in esame + emazie test; incubazione a 4 C, 20 C, 37 C Centrifugazione, lettura macroscopica, microscopica Se positivo: identificazione specificità anticorpale, titolazione anticorpale, valutazione ampiezza termica
19 AEA DA AUTOANTICORPI CALDI VALUTAZIONE INIZIALE TAD IgG + C3d IgG C3d PBS: controllo Schedina Provetta SIERO Emazie test I II III Auto Schedina TAI C Provetta 20 C C ± ± ± ± 37 C + TAI C + Enzima NB: registrare: A= agglutinazione, E= emolisi Gruppo sanguigno ABO RhD Fenotipo Rh Kell Schedina???? Provetta O POS CcDee NEG
20 AEA DA AUTOANTICORPI CALDI PROBLEMI SIEROLOGICI NELLA AEA DA AUTOANTICORPI CALDI ABO-Rh-K: agglutinazione spontanea delle emazie autologhe Elevati livelli di IgG sulle emazie; controllo autologo positivo Test in provetta con antisieri monoclonali a basso contenuto proteico Rimozione delle IgG mediante eluizione (es.ega Kit) Rarissimi casi con agglutinine IgM reattive a caldo: impiego di reagenti TIPIZZAZIONE ERITRICITARIA sulfidrilici (es. DTT o 2-ME) Fenotipo esteso: reattività aspecifica nei test con sieri antiglobulina Bassi livelli di IgG sulle emazie; controllo autologo positivo in TAI Rimozione delle IgG mediante eluizione (es.ega Kit) Tipizzazione con metodiche in biologia molecolare ABO prova indiretta: agglutinazione con emazie test di gruppo O Esecuzione prova indiretta su siero autoadsorbito
21 AEA DA AUTOANTICORPI CALDI PROBLEMI SIEROLOGICI NELLA AEA DA AUTOANTICORPI CALDI Esclusione di eventuali alloanticorpi mascherati Ricerca anticorpi dopo adsorbimento autologo o allogenico Adsorbimento siero/plasma con emazie autologhe ANTICORPI NEL SIERO/PLASMA Applicabile in assenza di trasfusioni negli ultimi 3 mesi Rimozione delle IgG mediante eluizione (es.ega Kit), autoadsorbimento Eventuale impiego di enzimi proteolitici, ZZAP, agenti sulfidrilici Adsorbimento siero/plasma con emazie allogeniche Applicabile in caso di trasfusioni negli ultimi 3 mesi Adsorbimento con emazie allogeniche a fenotipo noto
22 AEA DA AUTOANTICORPI CALDI VALUTAZIONE FINALE Gruppo sanguigno (definitivo) ABO RhD Fenotipo Rh Kell Provetta O POS CcDee NEG Fenotipo esteso Kidd Duffy Ss altro Provetta a-b+ a-b+ S+s+ Eluato Pannello di identificazione Provetta Specificità Siero Autoanticorpi panreattivi Pannello di identificazione Provetta su siero Su siero adsorbito Specificità autoab/alloab Antoanticorpi panreattivi. Alloanticorpi: non dimostrabili
23 AGGLUTININE FREDDE VALUTAZIONE INIZIALE TAD IgG + C3d IgG C3d PBS: controllo Schedina Provetta SIERO I II III Auto Schedina TAI C Provetta 20 C C C + TAI C + Enzima Agglutinazione; Emolisi Gruppo sanguigno ABO RhD Fenotipo Rh Kell Schedina???? Provetta A POS CCDee NEG
24 AGGLUTININE FREDDE PROBLEMI SIEROLOGICI NELLA AEA DA AUTOANTICORPI FREDDI ABO-Rh-K: agglutinazione spontanea delle emazie autologhe Esecuzione test strettamente a caldo TIPIZZAZIONE ERITRICITARIA Eventuale preriscaldamento campioni in EDTA Eventuale trattamento emazie con agenti sulfidrilici (es. DTT o 2-ME) ABO prova indiretta: agglutinazione con emazie test di gruppo O Esecuzione prova indiretta su siero preriscaldato con incubazione a 37 C Alternativamente esecuzione prova indiretta su siero autoadsorbito Caratterizzazione delle agglutinine fredde Identificazione della specificità anticorpale (anti-i, anti-i, anti-pr) ANTICORPI NEL SIERO/PLASMA Determinazione del titolo (generalmente superiore a 64) Determinazione ampiezza termica (valutazioni a 4 C, 20 C, 37 C) Esclusione di eventuali alloanticorpi mascherati Eventuale ricerca anticorpi dopo adsorbimento autologo o allogenico
25 AGGLUTININE FREDDE VALUTAZIONE FINALE Gruppo sanguigno (definitivo) ABO RhD Fenotipo Rh Kell Provetta A POS CCDee NEG Fenotipo esteso Kidd Duffy Ss altro Provetta a+b+ a-b+ S+s+ Siero Titolo a 4 C Titolo a 20 C Titolo a 37 C O Pool O Funicolo Emazie test O pool + Brom Autologhe ABO identiche Specificità autoab Agglutinine fredde anti I Siero adsorbito Specificità alloab Alloanticorpi: non dimostrabili
26 PROBLEMATICHE TRASFUSIONALI RISCHI LEGATI ALLA TRASFUSIONE Incremento emolisi per distruzione delle emazie trasfuse, innesco della DIC (raro) Reazione emolitica da alloanticorpi mascherati, induzione formazione di alloanticorpi Incremento potenza degli autoanticorpi, depressione dell eritropoiesi compensatoria AEA DA AUTOANTICORPI CALDI INDICAZIONI ALLA TRASFUSIONE L immediato trattamento con glucocorticoidi comporta, nella maggior parte dei casi, un significativo miglioramento, con riduzione di emolisi, stabilizzazione e successivo aumento dell ematocrito La trasfusione deve essere riservata ai pazienti ad alto rischio (anemia severa, anemia ingravescente non responsiva, presenza di gravi patologie cardiovascolari o polmonari) e deve essere effettuata con particolari precauzioni (infusione lenta, attento monitoraggio del paziente, eventuale utilizzo di diuretici) AEA DA AGGLUTININE FREDDE Spesso l anemia è lieve e nelle forme infettive è autolimitante. Può essere richiesto solo un trattamento di supporto. Importante evitare l esposizione alle basse temperature La trasfusione va riservata ai pazienti ad alto rischio. Va utilizzato sangue preriscaldato a 37 C.
27 PROBLEMATICHE TRASFUSIONALI SELEZIONE DELLE UNITA DI EMAZIE DA TRASFONDERE SELEZIONE DELL UNITA MENO INCOMPATIBILE Premessa Transfusion 1999; 3: 6-10 Titolo alloanticorpo > titolo autoanticorpo E vero che la trasfusione in un paziente con AEA può essere urgente Tuttavia una procedura di autoadsorbimentoappare appropriata ed il beneficio della trasfusione di sangue compatibile con eventuali alloanticorpi supera probabilmente il rischio di ritardare la trasfusione per il tempo richiesto per l esecuzione della procedura TECNICA DELLA DILUIZIONE DEL SIERO Premessa Transfusion 1999; 3: 6-10 Titolo alloanticorpo > titolo autoanticorpo E vero che la trasfusione in un paziente con AEA può essere urgente Tuttavia una procedura di autoadsorbimentoappare appropriata ed il beneficio della trasfusione di sangue compatibile con eventuali alloanticorpi supera probabilmente il rischio di ritardare la trasfusione per il tempo richiesto per l esecuzione della procedura
28 PROBLEMATICHE TRASFUSIONALI SELEZIONE DI UNITA CON FENOTIPO ESTESO COMPATIBILE Specificità % specificità anticorpale in AEA con alloanticorpi Fenotipo esteso Anti E 22% Anti Kell 10.8% Anti C 8.7% Anti Fy a 7.8% Anti Jk a 5.0% Anti c 4.8% Anti Jk b 4.6% Anti S 4.0% Anti D 3.4% Il rispetto del fenotipo esteso evita il rischio di incorrere in alloanticorpi mascherati nell 85% dei casi Transfusion 2002; 42: Anti e 2.4% Anti M 2.2% Anti s 1.0% SOLUZIONE OTTIMALE (talora difficoltosa con tempi di esecuzione lunghi) Utilizzo di emazie ABO, Rh, fenotipo Rh, K identiche o compatibili Utilizzo di emazie con fenotipo esteso identico o compatibile Esecuzione del cross-match con il siero sottoposto ad adsorbimento degli autoanticorpi
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