Tranquility. Test non invasivo del DNA fetale per trisomie e aneuploidie sessuali. Approfondimento scientifico. a compan of esperit

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1 Tranquility Test non invasivo del DNA fetale per trisomie e aneuploidie sessuali Approfondimento scientifico Swiss Biotechnology a compan of esperit

2 Tranquility Approfondimento scientifico Copyright 2015 Genoma SA Tutti i diritti riservati Supervisione medica: Dr. Frederic Amar Supporto medico e scientifico: Thomas Rio Frio, Ph.D. Vuk Dervnja, MD, MSc. Redazione e grafica: Aurelia Gremaud Aurelie Martin Elena Dalle Carbonare Ignacio Sainz Terrones Joao Mourao Jerome Pouzet Eventuali commenti sono benvenuti all indirizzo genoma@genoma.com Tranquility Approfondimento scientifico Tranquility è l unico test non invasivo del DNA fetale a marchio CE-IVD per le trisomie 21, 18 e 13 in grado di rilevare anche le aneuploidie dei cromosomi sessuali, le microdelezioni e il sesso del nasciuturo. ll DNA libero circolante nel sangue materno viene isolato e sottoposto a sequenziamento massivo in parallelo dell intero genoma, utilizzando un processo di Next Generation Sequencing (NGS). Successivamente, un sofisticato sistema bioinformatico analizza i dati sequenziati. I valori della frazione di DNA fetale sono calcolati e incorporati nel test di validità finale per garantire l affidabilità dei risultati. L elevata precisione di questa analisi produce risultati accurati, disponibili in 5 giorni lavorativi dal ricevimento del campione in laboratorio. Tranquility viene eseguito nel laboratorio ad alta tecnologia di Genoma a Ginevra, il maggiore centro di genetica clinica in Europa, in linea con i più alti standard qualitativi della Svizzera e dell Unione Europea. Indice Screening prenatale 1 Evoluzione dell analisi prenatale Screening sul DNA fetale libero circolante Screening che non analizzano il DNA Diagnostica invasiva Patologie indagate Trisomie fetali comuni Aneuploidie sessuali Sindromi da microdelezione Tranquility Caratteristiche e performance Processi ad alta tecnologia Pubblicazioni scientifiche YM Dennis Lo et al., 1997 Rossa WK Chiu et al., 2011 Glenn E Palomaki et al., 2012 Mary E Norton et al., 2012 Naama Srebnik et al., 2013 Jacob A Canick et al., 2013 Wybo Dondorp et al., 2015 RCOG Scientific Impact Paper,

3 Screening prenatale

4 Evoluzione della medicina prenatale Dai test di screening biochimico all analisi del DNA fetale circolante Prevalenza delle anomalie cromosomiche In una popolazione di di individui Test Prenatali I test prenatali, indirizzati prevalentemente alla diagnosi della trisomia 21 (sindrome di Down), sono iniziati intorno al In principio, venivano utilizzati esclusivamente metodi non invasivi, con bassi livelli di affidabilità; la massima precisione diagnostica è stata raggiunta quando l analisi delle cellule fetali è divenuta possibile grazie alla villocentesi e all amniocentesi. Queste due procedure sono altamente invasive e comportano alcuni rischi per il feto. Inoltre sono fonte di notevole stress per la madre e per l intera famiglia. Dal 2014 è possibile analizzare il DNA fetale libero circolante nel sangue materno grazie a nuovi metodi di sequenziamento genetico pienamente validati, che richiedono soltanto un semplice prelievo di sangue. Un analisi altamente accurata del DNA fetale circolante è possibile a partire dalla decima settimana di gestazione Sindrome di Down 1428/1 milione Sindrome di Jacobs 1000/1 milione Sindrome di Klinefelter 1000/1 milione Sindrome di Turner 400/1 milione Sindrome di Edwards 200/1 milione Cronologia dei test prenatali non invasivi Dal 1970 ai primi anni 80 Percentuale di trisomie 21 rilevate: inferiore al 35% Dai tardi anni 80 ai primi anni 90 Introduzione dello screening sul siero materno durante il secondo trimestre Percentuale di trisomie 21 rilevate: circa 60% Dai tardi anni 90 ai primi anni successivi al 2000 Introduzione di test combinati durante il primo trimestre Percentuale di trisomie 21 rilevate: circa 90% Dal 2014 Introduzione del test sul DNA fetale circolante Percentuale di trisomie 21 rilevate: circa 99% Prevalenza di anomalie cromosomiche La pagina a destra rappresenta un campione di popolazione pari ad 1 milione di neonati. I punti colorati indicano la prevalenza di aneuploidie. La sindrome di Down ha la più alta prevalenza (1/700). L obiettivo dei test prenatali è quello di fornire alle famiglie ed al personale medico informazioni il più possibile complete e precoci sulle eventuali anomalie cromosomiche del feto. Trisomia X 100/1 milione Sindrome di Patau 62.5/1 milione 6 / GENOMA Tranquility Approfondimento Scientifico

5 Screening sul DNA fetale libero circolante L unico metodo non invasivo basato sull analisi del DNA Flusso Sanguigno Materno Placenta DNA fetale circolante DNA Fetale Nel flusso sanguigno di ogni individuo sono presenti piccoli frammenti di materiale genetico, denominati DNA libero circolante. A partire dalla quinta settimana di gestazione, in una donna in stato di gravidanza è presente, oltre al DNA libero circolante di origine materna, anche DNA fetale, in una percentuale compresa tra il 2 ed il 40% (mediamente attorno al 10%). Il DNA fetale libero ha origine dalle cellule placentari, e viene continuamente rilasciato nel flusso sanguigno della madre. La percentuale di DNA fetale (frazione fetale) nel sangue materno aumenta durante il secondo ed il terzo trimestre e scompare dopo il parto. È attualmente possibile analizzare con grande precisione il DNA fetale libero circolante nel sangue materno, quando presente in una percentuale pari ad almeno il 4%. Questo avviene generalmente dopo la decima settimana di gestazione, e rende possibile l analisi del DNA fetale mediante un semplice prelievo di sangue materno. Massima affidabilità I frammenti di DNA libero circolante vengono sequenziati e confrontati con il genoma umano di riferimento. Quando il numero di un determinato cromosoma non corrisponde all atteso, si è in presenza di una aneuploidia. Gli studi sulle gravidanze ad alto rischio di trisomie hanno dimostrato che mediante un analisi del DNA fetale libero circolante nel sangue materno è possibile identificare il 98,9% dei casi, con una percentuale di falsi positivi pari a 0,1%. La presenza di risultati falsi positivi può comportare il ricorso a una procedura invasiva nel caso di una gravidanza con feto sano. I test basati sul sequenziamento del DNA fetale libero circolante nel sangue materno possono potenzialmente ridurre del 95% l applicazione di procedure invasive e gli aborti ad esse correlati. L analisi del DNA fetale circolante combina bassissime percentuali di falsi positivi e falsi negativi con il vantaggio di essere un analisi non invasiva DNA Materno 8 / GENOMA Tranquility Approfondimento Scientifico

6 Per qualsiasi gravidanza L analisi del DNA fetale circolante è indicata per ogni donna in gravidanza, e può essere eseguita a partire dalla decima settimana di gestazione (per garantire una sufficiente quantità di frazione fetale). I fattori che possono influenzare l affidabilità del test sono mosaicismi confinati alla placenta, la sindrome del vanishing twin (gemello riassorbito), il peso della madre, come evidenziato dal grafico 1, e qualsiasi infezione, neoplasia o altra condizione che richieda trasfusioni di sangue (trattamento con cellule staminali, immunoterapia o trapianto). Frazione fetale (%) Peso della madre (Kg) L American College of Obstetricians and Gynecologists raccomanda che lo screening prenatale delle aneuploidie sia proposto ad ogni donna in stato di gravidanza, indipendentemente dall età A tutte le età Rischio di trisomia 2 Rischio di Sindrome di Down Un caso di trisomia può verificarsi in qualsiasi gravidanza. Il rischio di un feto affetto da trisomia aumenta considerevolmente con l età della madre, come evidenziato dal grafico 2. Proprio per questo elevato fattore di rischio, alle future madri oltre una certa soglia di età viene generalmente prescritta un analisi invasiva. L analisi del DNA fetale riduce notevolmente i rischi legati alle analisi invasive prescritte di routine. I test sul DNA fetale forniscono risultati accurati e necessitano semplicemente di un prelievo di sangue materno. Possono inoltre essere prescritti senza timore di complicazioni a qualsiasi donna in stato di gravidanza. 3.0% 2.5% 2.0% 1.5% 1.0% 0.5% 0.0% Trisomia 18 Trisomia 13 Età della madre alla 12 a settimana (anni) Trisomia 21 Sindrome di Down 100% 10% 1% 0% NT=5.0 mm NT=3.5 mm NT=3.0 mm NT=2.5 mm Età della madre (anni) 10 / GENOMA Tranquility Approfondimento Scientifico

7 Screening non basati sull analisi del DNA Test non invasivi standard FALSI POSITIVI DEL TEST COMBINATO Screening sul siero materno del secondo trimestre (tri-test) Analisi biochimiche Le procedure standard per i test prenatali sono basate sull analisi biochimica: test combinato durante il primo trimestre, e lo screening sul siero materno durante il secondo trimestre (tri-test). Nel caso di esito positivo in uno di questi due test, si raccomanda alla paziente di sottoporsi ad una procedura invasiva per la diagnosi definitiva. A causa delle alte percentuali di risultati falsi negativi, vengono individuati solo il 90% dei casi di trisomia 21. Sono inoltre numerosi i casi in cui, a causa dei numerosi falsi positivi, il test invasivo che ne segue riveli un feto non affetto da anomalie. I test non invasivi standard non individuano più del 10% dei casi di trisomia Tranquility ha una percentuale di falsi negativi inferiore allo 0,1% I risultati positivi del test per la diagnosi della trisomia 21 sono errati in 19 casi su 20, e portano alla prescrizione di un amniocentesi non necessaria (l esame del liquido amniotico non riscontra anomalie nel feto) Il tri-test può identificare una gravidanza con maggior rischio di trisomia 21 o 18. Il test prevede un prelievo sanguigno tra la quattordicesima e la ventesima settimana + 6 giorni di gestazione (il periodo ideale è tra la quindicesima e la diciassettesima settimana). Il test verifica i livelli ematici di tre proteine (AFP, hcg, estriolo non coniugato ed a volte anche inibina A); i risultati vengono poi incrociati con l età della madre. L esito viene espresso in termini di maggior rischio o basso rischio. Test combinato del primo trimestre (bi-test) Il test combinato abbina l età della madre con gli esiti di un analisi del sangue effettuata tra la nona e la tredicesima settimana di gestazione, e con i dati di un ecografia effettuata tra l undicesima e la tredicesima settimana di gestazione. L analisi del sangue misura i livelli di due diverse proteine presenti nel sangue materno, mentre l ecografia valuta la quantità di fluido presente nell epidermide sulla parte posteriore del collo del bambino (translucenza nucale). I test del primo trimestre dipendono da una serie di fattori che possono rendere inaffidabile il risultato finale. Periodo gestazionale: PAPP-A, free β-hcg dopo 9 settimane Peso elevato: PAPP-A, free β-hcg Gravidanza gemellare: due volte maggiore nel caso di due gemelli, tre volte maggiore nel caso di tre gemelli Diabete Mellito Insulino-Dipendente (IDDM): PAPP-A e free β-hcg in diminuzione Alto numero di gravidanze portate a termine (gravidity/parity): PAPP-A, free β-hcg Gravidanze precedenti: fattore di rischio due o tre volte maggiore, se durante le precedenti gravidanze era stato rilevato un rischio elevato. Test combinato β-hcg (prelievo sanguigno) Nome completo: Beta-gonadotropina corionica umana Origine: Trofoblasto T21: ( MoM: 1,8) PAPP-A (prelievo sanguigno) Nome completo: Proteina plasmatica A assiciata alla gravidanza Origine: Trofoblasto e cellule endometriali decidualizzate T21: ( MoM: 0,4) NT (ecografia) Nome completo: Spessore della translucenza nucale T21: ( MoM: 2-2,5) FALSI NEGATIVI DEL TEST COMBINATO 3-4 casi di trisomia 21 (sindrome di Down) su 20 non vengono rilevati dal test combinato Tri-test AFP (prelievo sanguigno) Nome completo: Alfa-fetoproteina Origine: Sacco vitellino/fegato fetale T21: ( MoM: 0,73) hcg (prelievo sanguigno) Nome completo: Gonadotropina corionica umana Origine: Trofoblasto T21: ( MoM: 2) UE3 (prelievo sanguigno) Nome completo: Estriolo non coniugato Origine: Unità fetoplacentare T21: ( MoM: 0,73) 12 / GENOMA Tranquility Approfondimento Scientifico Screening prenatale / 13

8 Diagnostica invasiva Villocentesi ed amniocentesi Procedura diagnostica Metodi di analisi L amniocentesi e la villocentesi sono interamente basate su metodologie citogenetiche. Sono metodiche affidabili e praticate da moltissimi anni, tuttavia nessuna delle due può rendere superflui gli altri test o garantire un affidabilità assoluta. L età avanzata della madre o un test combinato che indichi rischio elevato possono rendere necessaria una procedura invasiva, quale la villocentesi (CVS) o l amniocentesi. Entrambe le metodiche garantiscono risultati affidabili, dal momento che i campioni vengono prelevati rispettivamente dalla placenta o dal liquido amniotico, che contengono cellule fetali. I campioni sono analizzati con test citogenetici o molecolari. La CVS e l amniocentesi comportano un fattore di rischio di aborto spontaneo, e sono pertanto fonte di ansia e disagio per la madre ed il resto della famiglia. Inoltre, le metodiche invasive non sono raccomandate nel caso di gravidanze preziose, né in molti casi di fecondazione in vitro e ovodonazione. Ibridazione Fluorescente In Situ (FISH) Le regioni cromosomiche di interesse vengono marcate con tracciatori fluorescenti. Il microscopio fluorescente permette di visualizzare i cromosomi 21, 18, 13 ed X,Y come punti colorati. Un conteggio dei punti colorati permette di valutare la presenza di aneuploidie cromosomiche. Villocentesi Settimane La CVS è un prelievo transaddominale o transcervicale di un campione di villi coriali della placenta. Grazie all analisi citogenetica FISH, entro poche ore dal prelievo sono già disponibili dei risultati preliminari sui cromosomi 21, 18, 13, X ed Y. Parallelamente, viene determinato il cariotipo fetale, mentre l eventuale presenza di anomalie cromosomiche viene confermata entro due settimane. Rischi Emorragie/perdite vaginali Perdite di liquido amniotico Infezioni Corioamnionite Aborto: 0,5% Amniocentesi Settimane L amniocentesi è il prelievo transaddominale di un campione di liquido del sacco amniotico che circonda il feto. Le cellule fetali ottenute sono analizzate secondo le stesse metodiche della villocentesi. Rischi Perdite vaginali transitorie: 1-2% Perdite di liquido amniotico: 1-2% Corioamnionite: < 0.1% Perforazione del feto (raro, se viene utilizzato il sistema di guida ecografica) Aborto: 0,5-1% Un analisi invasiva provoca ansia, e non è consigliabile nel casi di gravidanze preziose Tranquility è un test sicuro e non genera ansia. Grazie alla percentuale di falsi positivi inferiore allo 0,1%, permette di evitare un amniocentesi non necessaria Cariotipo Il cariotipo è la classificazione delle 23 coppie dei cromosomi di una cellula secondo la nomenclatura internazionale. Le cellule fetali contenute nel liquido amniotico vengono coltivate in incubatrice per un periodo tra i 7 ed i 10 giorni. Questo test viene effettuato su cellule ottenute dalle colture derivate dal campione. 14 / GENOMA Tranquility Approfondimento Scientifico

9 Patologie indagate

10 Trisomie fetali comuni Cause, sintomi e diagnosi Fondamenti genetici I geni sono la mappa su cui si sviluppa l essere umano e forniscono istruzioni sul funzionamento delle cellule. Sono organizzazati in 22 coppie di autosomi più una coppia di cromosomi sessuali. Le trisomie sono il risultato di un numero eccessivo Sindrome di Down La sindrome di Down deve il suo nome al primo medico che la descrisse sistematicamente, John Langdon Down. La sindrome di Down descrive una serie di sintomi fisici e cognitivi provocati da una copia in eccesso, intera o parziale, del cromosoma 21. Trisomia 21 infatti significa che ogni cellula del corpo presenta tre copie del cromosoma 21 invece delle solite due. I cromosomi portano l informazione genetica che istruisce il corpo sul proprio sviluppo e sullo svolgimento di determinate funzioni. I soggetti affetti da sindrome di Down di copie di un cromosoma e influenzano lo sviluppo e la salute del bambino colpito. Le trisomie più comuni sono la trisomia 21 (Sindrome di Down) e le trisomie 13 (sindrome di Patau) e 18 (sindrome di Edwards). flat facial profile simian crease flat occiput Tranquility rileva la presenza della trisomia 21 (sindrome di Down) con un livello di sensibilità e specificità pari al 99,9% epicanthic fold upward slanting eyes flat nasal bridge protuding tongue gap between 1st and 2nd toes presentano una copia in eccesso, intera o parziale, del cromosoma 21 per un totale di 47 cromosomi. Il cromosoma 21 è il più piccolo cromosoma umano, con circa 48 milioni di coppie di basi, e rappresenta dall 1,5 al 2% del DNA delle cellule. Si tratta di una condizione cromosomica che comporta un ritardo nella capacità cognitiva, particolari caratteristiche del viso e scarsa tonicità muscolare (ipotonia) nell infanzia. Questa condizione è prevalentemente provocata dalla trisomia 21. In casi più rari, la sindrome di Down si manifesta quando una parte del cromosoma 21 resta attaccata (traslocata) a un altro cromosoma durante la formazione delle cellule riproduttive (ovuli e spermatozoi) o nelle prime fasi dello sviluppo fetale. Le persone che ne sono affette hanno, oltre alle due copie del cromosoma 21, anche materiale in eccesso attaccato a un altro cromosoma, con il risultato che il soggetto presenta tre copie di materiale genetico derivante dal cromosoma 21. Chi presenta questa anomalia genetica si dice sia affetto da sindrome di Down da traslocazione. La sindrome di Down non si limita a disturbi dello sviluppo cognitivo, ma può intaccare anche altri organi del corpo: Perdita dell udito (fino al 75% di chi è affetto dalla sindrome ne soffre); Apnea ostruttiva del sonno (tra il 50 e il 75%); Infezioni dell orecchio (tra il 50 e il 70%); Patologie oculari (fino al 60%); Malformazioni cardiache fin dalla nascita (50%); Anomalie dell apparato digerente, come blocco intestinale. II soggetti colpiti da sindrome di Down sono più esposti al rischio di sviluppare gravi condizioni patologiche. Tra queste, il reflusso gastroesofageo e la celiachia. Circa il 15% ha una ridotta funzione della ghiandola tiroidea (ipotiroidismo). Il rischio di patologie oculari e problemi dell udito aumenta. Inoltre, una piccola percentuale di bambini Normale affetti dalla sindrome di Down sviluppa una forma tumorale delle cellule del sangue (leucemia). Tutti questi fattori influiscono sulla vita del bambino e della sua famiglia. La sindrome di Down ha un incidenza di 1 caso su 830 neonati. Sebbene possa capitare a donne di qualsiasi età di avere un figlio colpito da questa condizione patologica, le possibilità aumentano con gli anni. I metodi tradizionali per diagnosticare la sindrome di Down in utero sono un esame ultrasonografico (misurazione della translucenza nucale e dell osso nasale),il test combinato, nonché l amniocentesi e la villocentesi. Anormale 18 / GENOMA Tranquility Approfondimento Scientifico Patologie indagate / 19

11 Sindrome di Edwards La trisomia 18, nota anche come Sindrome di Edwards, è una condizione cromosomica che comporta anomalie in diverse parti del corpo. La maggior parte dei casi di trisomia 18 sono imputabili alla presenza di tre copie del cromosoma 18 nelle cellule del corpo invece delle solite due. Il materiale genetico in eccesso ostacola il corso normale dello sviluppo provocando le caratteristiche tipiche di questa condizione. Circa il 5 percento di chi è affetto da trisomia 18 ha una copia in eccesso del cromosoma 18 solo in alcune cellule del corpo. In questo caso, si parla di trisomia 18 a mosaico. La gravità di questa condizione dipende dal tipo e dal numero di cellule che presentano un cromosoma in eccesso. Lo sviluppo dei soggetti affetti da questa forma di trisomia 18 va quindi da normale a gravemente colpito. In rarissimi casi, una parte del braccio lungo (q) del cromosoma 18 resta attaccato (traslocato) a un altro cromosoma durante la formazione delle cellule riproduttive (ovuli e spermatozoi) o nelle prime fasi dello sviluppo dell embrione. I soggetti colpiti hanno, oltre alle due copie del cromosoma 18, anche materiale in eccesso attaccato a un altro cromosoma. Chi presenta questa anomalia genetica si dice affetto da trisomia 18 parziale. Se solo una parte del braccio q è in tre copie, i segni fisici possono essere meno gravi di quelli che si riscontrano generalmente nella trisomia 18. Se invece tutto il braccio q è in tre copie, i soggetti potrebbero essere altrettanto gravemente colpiti di chi ha tre copie dell intero cromosoma 18. La trisomia 18 spesso comporta una crescita rallentata prima della nascita (ritardo della crescita intrauterina) e peso ridotto al parto. I soggetti colpiti possono soffrire di difetti cardiaci e anomalie di altri organi prima della nascita. Tra le altre caratteristiche della trisomia 18, ricordiamo: testa piccola e di forma anomala, mascella e bocca piccole, pugno chiuso con indice sovrapposto al medio. A causa della presenza di diversi problemi medici potenzialmente letali, molti dei soggetti colpiti muoiono prima della nascita o entro il primo mese di vita. Dal 5 al 10% dei bambini colpiti sopravvivono al primo anno, ma spesso presentano gravi ritardi cognitivi. Nella maggior parte dei casi la trisomia 18 non è ereditaria, ma si manifesta come evento casuale durante la formazione di ovuli e spermatozoi. Un errore che si verifica nella divisione cellulare, noto come non-disgiunzione, comporta lo sviluppo di cellule riproduttive con un numero anomalo di cromosomi. La trisomia 18 ha un incidenza di circa 1 neonato su 5000; è più frequente durante la gravidanza, ma molti feti non sopravvivono al parto. Sebbene possa capitare a donne di qualsiasi età di avere un figlio colpito da questa condizione patologica, le possibilità aumentano con gli anni. I metodi tradizionali per diagnosticare la sindrome di Edwards sono esami ultrasonografici, l amniocentesi e la villocentesi. Sindrome di Patau La trisomia 13, nota anche come sindrome di Patau, è una condizione cromosomica che comporta grave ritardo cognitivo e anomalie fisiche in molte parti del corpo. La maggior parte dei casi di trisomia 13 sono imputabili alla presenza di tre copie del cromosoma 13 nelle cellule invece delle solite due. Il materiale genetico in eccesso ostacola il corso normale dello sviluppo provocando le caratteristiche tipiche di questa condizione. La trisomia 13 si può manifestare anche quando una parte del cromosoma 13 resta attaccato (traslocato) a un altro cromosoma durante la formazione delle cellule riproduttive (ovuli e spermatozoi) o nelle prime fasi dello sviluppo dell embrione. I soggetti colpiti hanno, oltre alle due copie normali del cromosoma 13, anche una copia in eccesso attaccata a un altro cromosoma. Capita raramente che solo una parte del cromosoma 13 sia presente in triplice copia. In questi casi, i segni fisici e i sintomi sono molto diversi da quelli che si riscontrano nei soggetti pienamente colpiti. Solo una piccola percentuale di persone affette da trisomia 13 ha una copia del cromosoma 13 in eccesso soltanto in alcune cellule. In questo caso, si parla di trisomia 13 a mosaico. La gravità di questa condizione dipende dal tipo e dal numero di cellule che presentano un cromosoma in eccesso. Le caratteriste fisiche di questi soggetti spesso sono meno accentuate di quelle di chi presenta una trisomia piena. Nella maggior parte dei casi la trisomia 13 non è ereditaria, ma si manifesta come evento casuale durante la formazione di ovuli e spermatozoi in genitori sani. Un errore che si verifica nella divisione cellulare, noto come non-disgiunzione, comporta lo sviluppo di cellule riproduttive con un numero anomalo di cromosomi. La maggior parte dei feti colpiti da sindrome di Patau (il 64% dal secondo trimestre in poi) vengono abortiti spontaneamente. I bambini tendono a essere piccoli per l età gestazionale. Le anomalie della linea mediana (per es. difetti del cuoio capelluto, seno dermico) sono tipiche. L oloprosencefalia (dovuta alla separazione incompleta del prosencefalo) è piuttosto comune. Tra le anomalie facciali vi sono il labbro leporino e il palato leporino. Comuni sono anche la microftalmia, il coloboma (fessure) dell iride e la displasia retinica. Le arcate sopraccigliari sono poco profonde e le fessure palpebrali risultano oblique. Le orecchie hanno polydactyly una forma anomala e abbassata, la sordità è piuttosto diffusa. Sul retro del collo sono spesso presenti pieghe di pelle flaccida. Altrettanto diffusi sono i casi di piega palmare trasversale unica (o piega scimmiesca nella mano), polidattilia e unghie iperconvesse. Circa l 80% dei soggetti sono affetti da gravi anomalie congenite cardiovascolari; la destrocardia è molto frequente. Anche i genitali risultano spesso anomali in entrambi i sessi; per i maschi si registrano criptorchidismo e anomalie dello scroto mentre per le femmine, casi di utero bicorne. Nella prima infanzia sono frequenti gli episodi di apnea. Il deficit intellettivo è grave. Proprio per la presenza di diverse patologie letali, molti nascituri affetti hypotelorism broad flat nose cleft lip and palate low set ears da trisomia 13 muoiono dopo i primi giorni o settimane di vita. Solo l 8-10% dei pazienti sopravvive oltre l anno, ma in genere con gravi ritardi dell apprendimento. La sopravvivenza a lungo termine interessa soprattutto i casi di mosaicismo. La trisomia 13 ha un incidenza di circa 1 neonato su Sebbene possa capitare a donne di qualsiasi età di avere un figlio colpito da questa condizione patologica, le possibilità aumentano con gli anni. I metodi tradizionali per diagnosticare la sindrome di Patau sono esami ultrasonografici, l amniocentesi e la villocentesi. 20 / GENOMA Tranquility Approfondimento Scientifico Patologie indagate / 21

12 Aneuploidie sessuali Cause, sintomi e diagnosi Sindrome di Turner La sindrome di Turner è una condizione cromosomica che interessa lo sviluppo dei soggetti femminili. short stature primary hypofunction Fondamenti genetici Per aneuploidia dei cromosomi sessuali si intende un anomalia numerica relativa al cromosoma X o Y, che comporta l aggiunta o la perdita di un intero cromosoma X o Y. Tra i cariotipi a mosaico più frequenti ricordiamo: 45,X/46XX; 46XX/47,XXX; e 46,XY/47,XXY. La variazione del numero Trisomia XXX La sindrome della tripla X, anche nota come trisomia X o 47,XXX, è caratterizzata dalla presenza di un cromosoma X in eccesso in tutte le cellule della donna. La sindrome della tripla X è provocata dalla presenza di una copia in eccesso del cromosoma X in tutte le cellule della donna. Proprio per questo, le cellule hanno in totale 47 cromosomi (47,XXX) invece dei soliti 46 (46,XX). Nella maggior parte dei casi, la trisomia X è conseguenza della nondisgiunzione in fase di meiosi, anche se la non-disgiunzione postzigotica si verifica circa nel 20% dei casi. Una correlazione con l età avanzata dei cromosomi sessuali è una condizione genetica relativamente diffusa che interessa fino a 1 soggetto su 400. Le aneuploidie sessuali sono associate a fenotipi cognitivi e comportamentali caratteristici, anche se il livello di gravità può coprire un ampio spettro. della madre (che è notoriamente associata alla maggiore probabilità di episodi di non-disgiunzione) si riscontra in circa il 30% dei casi di trisomia X. Il mosaicismo (46,XX/47,XXX,47,XXX/48,XXXX o in combinazioni che comprendono le linee cellulari della sindrome di Turner 45,X) si verifica circa nel 10% dei casi. Si ritiene che il fenotipo della trisomia X sia associato alla sovraespressione dei geni presenti nel cromosoma X che evita la sua disattivazione, ma non sono ancora state stabilite specifiche relazioni genotipo fenotipo. Anche se i soggetti femminili affetti da sindrome della tripla X possono essere più alti della media, questa anomalia cromosomica di solito non comporta caratteristiche fisiche insolite. La Tranquility è l unico test CE-IVD per le trisomie 21, 18 e 13 che rileva anche le aneuploidie sessuali maggior parte delle donne colpite hanno uno sviluppo sessuale normale e sono in grado di concepire figli. La sindrome della tripla X comporta maggiori rischi di ritardo dell apprendimento e dell acquisizione delle competenze della parola e del linguaggio. È possibile riscontrare anche ritardi dello sviluppo delle capacità motorie (come stare seduto e camminare), scarso tono muscolare (ipotonia) nonché difficoltà emotive e comportamentali, ma queste caratteristiche variano molto. Nel 10% delle donne interessate si rilevano anche crisi epilettiche e anomalie renali. Questa condizione registra un incidenza di 1 neonato di sesso femminile su Circa la metà dei soggetti affetti da sindrome di Turner presenta monosomia del cromosoma X, il che significa che tutte le cellule del corpo hanno una sola copia di questo cromosoma sessuale invece delle solite due. La sindrome di Turner si manifesta non solo in totale assenza di uno dei cromosomi sessuali, ma anche se questo è solo parzialmente mancante o alterato. Alcune donne affette da sindrome di Turner presentano un anomalia cromosomica solo in alcune cellule (mosaicismo). La caratteristica più diffusa di questa condizione è la bassa statura, che diventa evidente verso l età di 5 anni. Molto frequente è anche la perdita precoce della funzione ovarica (ipofunzione ovarica o insufficienza ovarica prematura). Inizialmente, le ovaie si sviluppano normalmente, ma le cellule ovariche in genere muoiono prematuramente e la maggior parte del tessuto ovarico si deteriora prima della nascita. Molte ragazze affette dalla sindrome non entrano in pubertà a meno di essere sottoposte a terapia ormonale e la maggior parte non è in grado di procreare. Circa il 30% presenta pieghe di pelle sul collo (collo palmato), attaccatura dei capelli bassa sulla nuca, rigonfiamento e gonfiore (linfedema) delle mani e dei piedi, anomalie webbed neck shield shaped chest widely spaced nipples elbow deformity underdeveloped ovaries without follicles nevi low hairline coarctation of aorta poor breast development amenorrhea kidney issues shortened fourth metacarpal small fingernails 22 / GENOMA Tranquility Approfondimento Scientifico Patologie indagate / 23

13 scheletriche o problemi renali. Da un terzo alla metà dei soggetti affetti da sindrome di Turner nasce con difetti cardiaci, come il restringimento della grande arteria che esce dal cuore (coartazione aortica) o anomalie della valvola che collega l aorta al cuore (valvola aortica). Le complicanze derivanti da queste cardiopatie possono rivelarsi letali. La maggior parte dei soggetti femminili affetti da sindrome di Turner ha un intelligenza nella norma. È possibile rilevare ritardi dello sviluppo e dell apprendimento non verbale nonché problemi comportamentali, sebbene tali caratteristiche varino a seconda dei soggetti. Nella maggior parte dei casi, la sindrome di Turner non è ereditaria. Quando è imputabile alla monosomia del cromosoma X in quanto questa alterazione cromosomica si manifesta come evento casuale durante la formazione delle cellule riproduttive (ovuli e spermatozoi) nel genitore della persona colpita. Un errore che si verifica nella divisione cellulare, noto come non-disgiunzione, comporta lo sviluppo di cellule riproduttive con un numero anomalo di cromosomi. Di rado la sindrome di Turner provocata dalla parziale delezione del cromosoma X può essere trasmessa da una generazione all altra. Questa condizione ha un incidenza di 1 neonato di sesso femminile su 2500 in tutto il mondo, ma è molto più frequente nelle gravidanze che non giungono a termine (aborti spontanei e morti endouterine fetali). Sindrome di Jacobs La sindrome di Jacobs (47,XYY) è caratterizzata dalla presenza di una copia in eccesso del cromosoma Y nelle cellule dell uomo. La sindrome di Jacobs (47,XYY) è caratterizzata dalla presenza di una copia in eccesso del cromosoma Y nelle cellule dell uomo. Vista la presenza di un cromosoma Y supplementare, le cellule hanno in totale 47 cromosomi invece dei soliti 46. Non è ancora stato chiarito perché questa copia in eccesso del cromosoma Y comporti una maggiore altezza, problemi dell apprendimento e altre caratteristiche per l uomo. Alcuni soggetti affetti hanno il cromosoma Y in eccesso solo in alcune cellule (mosaicismo). La maggior parte degli uomini affetti ha uno sviluppo sessuale nella norma ed è in grado di procreare. La sindrome 47,XYY comporta un maggior rischio di ritardo dell apprendimento e dell acquisizione delle competenze della parola e del linguaggio. È possibile riscontrare anche ritardi dello sviluppo delle capacità motorie (come stare seduto e camminare), scarso tono muscolare (ipotonia), tremolio delle mani ed altri movimenti involontari (tic motori) nonché difficoltà emotive e comportamentali. Nella maggior parte dei casi, la sindrome 47,XYY non è ereditaria. Questa condizione ha un incidenza di 1 neonato di sesso maschile su Sindrome di Klinefelter La sindrome di Klinefelter (47,XXY) è una condizione cromosomica che interessa lo sviluppo cognitivo e fisico dei soggetti maschili. Nella maggior parte dei casi, la sindrome di Klinefelter è imputabile alla presenza di una copia in eccesso nelle cellule del cromosoma X. Le copie supplementari di geni del cromosoma X interferiscono con lo sviluppo sessuale dell uomo, spesso impedendo ai testicoli di funzionare normalmente e riducendo i livelli di testosterone. La sindrome di Klinefelter e le sue varianti non vengono ereditate; queste alterazioni genetiche in genere si manifestano come eventi casuali durante la formazione delle cellule riproduttive (ovuli e spermatozoi) nel genitore. La maggior parte dei soggetti colpiti presenta le caratteristiche di seguito riportate, anche se alcuni non hanno o hanno pochi sintomi o tratti significativi. In genere, questi soggetti hanno testicoli piccoli che non producono valori di testosterone nella norma. La carenza di testosterone può ritardare o impedire il completamento della pubertà e può provocare sviluppo delle mammelle (ginecomastia), riduzione dei peli su volto e corpo e incapacità di avere figli biologici (infertilità). Alcuni soggetti possono anche avere anomalie genitali, ivi compresa la mancata discesa dei testicoli (criptorchidismo), l apertura dell uretra sulla parte inferiore del pene (ipospadia) o un pene insolitamente piccolo (micropenia). Gli uomini affetti da sindrome di Klinefelter tendono a essere più alti della media. Rispetto agli altri soggetti, gli adulti che presentano questa condizione corrono un maggior rischio di sviluppare tumori della mammella e una patologia infiammatoria cronica nota come lupus erimatoso sistemico. La probabilità che sviluppino queste malattie è simile a quella delle donne nella popolazione generale. I bambini possono presentare ritardi dell apprendimento e dello sviluppo del linguaggio e della parola. Tendono a essere tranquilli, sensibili, mansueti, ma le caratteristiche della personalità variano molto a seconda dei soggetti. Alcuni soggetti che presentano caratteristiche tipiche della sindrome di Klinefelter hanno più di un cromosoma sessuale in eccesso nelle cellule (per esempio 48,XXXY o 49,XXXXY). Tali condizioni, spesso note come varianti della sindrome di Klinefelter, tendono a caratterizzare maggiormente i soggetti e a provocare sintomi più gravi della condizione classica. Oltre a influenzare lo sviluppo sessuale dell uomo, le varianti della sindrome di Klinefelter comportano ritardo cognitivo, caratteristiche facciali distintive, anomalie scheletriche, scarsa coordinazione motoria, gravi disturbi della parola. Più è alto il numero dei cromosomi sessuali in eccesso, più cresce il rischio di problemi di salute. Questa condizione ha un incidenza di 1 neonato di sesso maschile su Ma la maggior parte delle varianti della sindrome di Klinefelter è molto più rara: 1 neonato su o anche meno. tall stature poor beard growth tendency to lose chest hairs wide hips female-type pubic hair pattern micopenis frontal baldness absent narrow shoulders breast development osteoporosis testicular atrophy 24 / GENOMA Tranquility Approfondimento Scientifico Patologie indagate / 25

14 Sindromi da microdelezione Cause, sintomi e diagnosi in quanto i medici e i ricercatori sospettano che sia sottostimata da un punto di vista diagnostico a causa della variabilità delle sue caratteristiche. È possibile che non venga rilevata in soggetti che presentano sintomi e tratti meno evidenti o che si confonda con altri disturbi dalle caratteristiche simili. Fondamenti genetici Per sindromi da microdelezione si intende un gruppo di patologie clinicamente riconoscibili caratterizzate dalla piccola delezione di un segmento cromosomico che comprende più geni, per cui ognuno potenzialmente contribuisce al fenotipo in modo indipendente. Le Sindrome di DiGeorge La sindrome di DiGeorge, anche nota come sindrome da delezione 22q11.2, è una patologia provocata da un difetto del cromosoma 22. La delezione si verifica verso la metà del cromosoma in una posizione nota come q11.2. Questo comporta lo scarso sviluppo di diversi sistemi del corpo. Tra i sintomi e i tratti distintivi ricordiamo le anomalie cardiache spesso presenti dalla nascita, l apertura sul palato (palato leporino) e le caratteristiche facciali riconoscibili. I soggetti affetti da sindrome da delezione 22q11.2 sono microdelezioni si distinguono per posizione genomica e dimensione. Nella maggior parte dei casi non hanno conseguenze cliniche, ma alcune sono caratterizzate da un fenotipo clinico e comportamentale complesso. spesso colpiti da ricorrenti infezioni provocate da disturbi del sistema immunitario. Alcuni sviluppano malattie autoimmuni come l artrite reumatoide e il morbo di Graves in cui il sistema immunitario attacca i tessuti e gli organi del corpo stesso. I soggetti interessati potrebbero sviluppare anche insufficienza respiratoria, anomalie renali, bassi livelli di calcio nel sangue (che può indurre crisi epilettiche), diminuzione delle piastrine (trombocitopenia), significativi disturbi dell alimentazione, problemi gastrointestinali e perdita dell udito. È possibile riscontrare anche tratti distintivi a livello scheletrico, tra cui la statura mediobassa e, con meno frequenza, anomalie delle ossa della colonna vertebrale. Tranquility è in grado di rilevare le più frequenti microdelezioni che causano sindromi riconoscibili Molti bambini caratterizzati da questa condizione presentano ritardi dello sviluppo, ivi compreso ritardo della crescita e della parola nonché deficit di apprendimento. Una volta cresciuti, questi soggetti corrono maggiori rischi di sviluppare malattie mentali come schizofrenia, depressione, ansia e disturbo bipolare. Inoltre, chi soffre di sindrome da delezione 22q11.2 ha anche maggiori possibilità di essere affetto da sindrome da deficit di attenzione e iperattività (ADHD) nonché da condizioni dello sviluppo come disturbi dello spettro autistico che influenzano la comunicazione e l interazione sociale. Si stima che la sindrome da delezione 22q11.2 interessi 1 soggetto su Questa condizione potrebbe comunque essere anche più frequente L ereditarietà della sindrome da delezione 22q11.2 è considerata autosomica dominante perché la delezione in una copia del cromosoma 22 di tutte le cellule è sufficiente per provocare questa condizione. Tuttavia, nella maggior parte dei casi, la sindrome non viene ereditata. La delezione si manifesta nella maggior parte dei casi come un evento casuale durante la formazione delle cellule riproduttive (ovuli e spermatozoi) o nelle prime fasi dello sviluppo fetale. In genere, le persone colpite non riscontrano questa condizione nell anamnesi familiare, tuttavia la possono passare ai propri figli. Circa nel 10% dei casi, chi ne è colpito ha ereditato la delezione nel cromosoma 22 da un genitore. Nei casi dove la patologia è ereditata, anche altri familiari potrebbero essere colpiti. Sindrome Cri-du-Chat La sindrome Cri-du-Chat (del grido di gatto), anche nota come 5p- (5p meno), è una condizione cromosomica che si verifica in mancanza di una parte del cromosoma 5. I bambini colpiti hanno spesso un pianto stridulo che ricorda il verso del gatto. Questa patologia è contraddistinta da deficit intellettivo e ritardo dello sviluppo, testa di piccole dimensioni (microcefalia), peso limitato alla nascita e scarso tono muscolare (ipotonia) nell infanzia. I soggetti affetti da sindrome Cri-du- Chat presentano anche caratteristiche epicanthal folds flat nasal bridge railroad track ears small palpebral lesions upturned nose smooth philtrum thin upper lip facciali ben riconoscibili che comprendono occhi molto distanziati (ipertelorismo), orecchie basse, mascella piccola e faccia rotonda. Alcuni bambini nascono con un difetto cardiaco. La sindrome Cri-du-Chat è provocata dalla delezione della fine del braccio corto (p) del cromosoma / GENOMA Tranquility Approfondimento Scientifico Patologie indagate / 27

15 Le dimensioni della delezione variano a seconda dei soggetti colpiti; dagli studi emerge che le delezioni più ampie tendono a provocare deficit intellettivi più gravi e maggiore ritardo dello sviluppo rispetto alle delezioni più limitate. I sintomi e i tratti distintivi della sindrome Cri-du-Chat sono probabilmente connessi alla perdita di più geni sul bracco corto del cromosoma 5. I ricercatori ritengono che in particolare la perdita di un gene specifico, CTNND2, comporti il grave deficit intellettivo di alcuni soggetti colpiti. I ricercatori stanno ancora lavorando per stabilire come la perdita di altri geni in questa regione possa contribuire alle caratteristiche tipiche della sindrome. Nella maggior parte dei casi, la sindrome Cri-du-Chat non è ereditaria. La delezione si verifica molto spesso come un evento casuale durante la formazione delle cellule riproduttive (ovuli e spermatozoi) o nelle prime fasi dello sviluppo fetale. Di solito nei soggetti colpiti non si riscontra un anamnesi familiare e solo il 10% circa di chi è affetto da sindrome Cri-du-Chat eredita l anomalia cromosomica da un genitore sano. In questi casi, il genitore è portatore di un riarrangiamento cromosomico noto come traslocazione bilanciata che non comporta acquisizione o perdita di materiale genetico. Di solito le traslocazioni bilanciate non provocano problemi di salute; possono tuttavia sbilanciarsi quando vengono trasmesse alla generazione successiva. I bambini che ereditano una traslocazione non bilanciata possono presentare un riarrangiamento cromosomico con aggiunta o sottrazione di materiale genetico. Ai soggetti affetti da sindrome Cri-du- Chat che ereditano una traslocazione non bilanciata manca il materiale genetico del braccio corto del cromosoma 5, fatto che comporta il deficit intellettivo e i problemi di salute tipici di questa condizione. Si stima che la sindrome Cri-du-Chat si riscontri in 1 bambino su Sindrome di Prader-Willi La sindrome di Prader-Willi è una condizione genetica complessa provocata dalla perdita di funzione dei geni di una particolare regione del cromosoma 15 che interessa diverse parti del corpo. Nell infanzia questa condizione è contraddistinta da scarso tono muscolare (ipotonia), disturbi dell alimentazione, crescita ridotta e ritardo dello sviluppo. Fin da piccoli, questi soggetti hanno un appetito insaziabile che li porta al cronico consumo eccessivo di cibo (iperfagia) e all obesità. Alcuni, in particolare chi ha problemi di obesità, sviluppano anche il diabete mellito di tipo 2 (la forma più comune di diabete). Chi è affetto dalla sindrome di Prader-Willi in genere ha un deficit intellettivo da lieve a medio e disturbi dell apprendimento. I problemi comportamentali sono frequenti, tra cui scoppi d ira, testardaggine e comportamenti compulsivi come la dermatilomania. Si possono verificare anche anomalie del sonno. Tra le altre caratteristiche di questa condizione, si ricordano i tipici tratti facciali come la fronte stretta, gli occhi a mandorla e la bocca triangolare, ma anche la bassa statura nonché le mani e i piedi di piccole dimensioni. Alcuni soggetti affetti da sindrome di Prader-Willi hanno la pelle insolitamente pallida e i capelli di colore chiaro. Sia gli uomini che le donne presentano genitali sottosviluppati. La pubertà è ritardata o incompleta e la maggior parte non è in grado di procreare (infertilità). Di solito si eredita una copia del cromosoma 15 da ciascun genitore. Alcuni geni vengono attivati solo sulla copia ereditata dal padre (copia paterna). Questa attivazione del gene di origine parentale è causata da un fenomeno detto imprinting genomico. La maggior parte dei casi di sindrome di Prader-Willi (circa il 70%) si verifica quando si cancella nelle cellule un segmento del cromosoma 15 di origine paterna. A chi è affetto da questa alterazione cromosomica mancano alcuni geni critici in questa regione, dato che i geni della copia paterna sono stati cancellati e i geni della copia materna sono disattivati. Nel 25% dei casi, il soggetto colpito ha due copie del cromosoma 15 ereditato dalla madre (copie materne) invece di una copia da ogni genitore. Questo fenomeno è noto come disomia uniparentale materna. In casi rari, la sindrome di Prader-Willi può essere provocata anche da un riarrangiamento cromosomico noto come traslocazione o da una mutazione o altro difetto che disattiva i geni del cromosoma 15 paterno. È probabile che i tratti caratteristici della sindrome di Prader-Willi derivino dalla perdita di funzione di diversi geni del cromosoma 15. Tra questi, ci sono geni che forniscono istruzioni per realizzare molecole note come small nucleolar RNA (snornas). Queste molecole svolgono una varietà di funzioni, tra cui contribuire a regolare altri tipi di molecole RNA (le molecole RNA svolgono ruoli fondamentali nella produzione delle proteine e in altre attività cellulari). Dagli studi emerge che la perdita di un determinato gruppo di geni snorna, noto come cluster SNORD116, possa svolgere un ruolo importante nell insorgenza dei sintomi e dei tratti caratteristici della sindrome. Tuttavia non è stato ancora chiarito come l assenza del cluster SNORD116 possa contribuire al deficit intellettivo, ai problemi comportamentali e alle caratteristiche fisiche tipiche della patologia. In alcuni soggetti affetti da sindrome di Prader-Willi, la perdita di un gene noto come OCA2 è all origine di una pelle insolitamente pallida e capelli di color chiaro. Il gene OCA2 è situato in quel segmento del cromosoma 15 che spesso risulta cancellato nei soggetti affetti da questa condizione. Tuttavia, la sua perdita non comporta l insorgenza di altri sintomi o tratti distintivi della sindrome di Prader-Willi. La proteina prodotta da questo gene è quella che contribuisce a determinare la colorazione (pigmentazione) della pelle, dei capelli e degli occhi. Nella maggior parte dei casi, la sindrome di Prader-Willi non è ereditaria, soprattutto quando all origine c è la delezione del cromosoma 15 di origine paterna o la disomia uniparentale materna. Queste alterazioni genetiche si manifestano come eventi casuali durante la formazione delle cellule riproduttive (ovuli e spermatozoi) o nella prima fase dello sviluppo embrionico. Di solito nei soggetti colpiti non si riscontra un anamnesi familiare. Secondo le stime, la sindrome di Prader-Willi colpisce 1 persona su in tutto il mondo. 28 / GENOMA Tranquility Approfondimento Scientifico Patologie indagate / 29

16 Tranquility

17 Caratteristiche e performance Tranquility, il test prenatale non invasivo più completo Un processo consolidato per risultati affidabili Tranquility analizza il DNA fetale libero circolante nel sangue materno. Il quantitativo di DNA fetale presente nel flusso sanguigno materno a partire dalla 10 a settimana di gestazione (12 a per le gravidanze gemellari) è sufficiente per effettuare il test e ottenere risultati affidabili. Il campione di sangue viene ricevuto nei laboratori Genoma di Ginevra e i frammenti di DNA libero circolante vengono estratti dal sangue materno, purificati e infine analizzati con il metodo di sequenziamento massivo in parallelo del genoma basato sull uso della tecnologia NGS (Next Generation Sequencing). I dati del sequenziamento sono infine analizzati con avanzati mezzi bioinformatici per fornire risultati chiari e accurati. Tranquility si attiene ai più severi standard qualitativi e rispetta le leggi e direttive dell Unione Europea. Il test è certificato CE-IVD per il rilevamento delle trisomie 21, 18 e 13. Aneuploidie cromosomiche Normalmente, ogni cromosoma ha due copie. Quando il rapporto di un cromosoma è diverso da 1:1, si ha un aneuploidia cromosomica, che può generare una patologia nel nascituro. Le più comuni sono: Trisomia 21 Trisomia 18 Trisomia 13 Aneuploidie dei cromosomi sessuali (X,Y) Microdelezioni L analisi del genoma può evidenziare la delezione di alcune parti dei cromosomi. Le delezioni possono interessare uno o più geni contigui e portare all insorgenza di patologie. Tra le più frequenti clinicamente riconosciute: Sindrome di Angelman Sindrome di Cri-Du-Chat Sindrome di DiGeorge Sindrome di Prader-Willi Sindrome da microdelezione 2q33.1 Sesso del feto* La combinazione cromosomica XY determina il sesso maschile. Dato che la madre non ha cromosomi Y, il sesso del nascituro è determinato dal rilevamento di tale cromosoma. * Se consentito dalla normativa vigente Il sequenziamento dell intero genoma e le tecniche bioinformatiche d avanguardia garantiscono l assoluta affidabilità dei test per tutte le patologie indagate 32 / GENOMA Tranquility Approfondimento Scientifico

18 Massima accuratezza Dalla 10 a * settimana di gestazione, l analisi effettuata con Tranquility sui frammenti di DNA liberi circolanti nel sangue materno genera risultati di assoluta affidabilità. La frazione fetale viene calcolata e inserita nell algoritmo, riducendo così al minimo le probabilità di falsi positivi o falsi negativi. Questa accuratezza è di primaria importanza per il medico e per il paziente. Alta sensibilità > 99,9% Questo valore esprime la capacità di Tranquility di evitare falsi negativi. Questi si verificano quando il risultato del test è negativo (nessuna anomalia rilevata), mentre invece il feto presenta l anomalia indagata. L inserimento nell algoritmo del calcolo della frazione fetale porta la probabilità di falsi positivi e falsi negativi prossima allo 0% Screening completo del DNA libero circolante Gravidanze singole I risultati forniti da Tranquility si riferiscono al rischio di aneuploidie cromosomiche e microdelezioni per il feto. Se richiesto, è possibile precisare anche il sesso del nascituro. Gravidanze gemellari I risultati forniti da Tranquility si riferiscono al rischio di trisomia dei cromosomi 21, 18 o 13 di almeno un feto. Se si richiedono informazioni sul sesso dei nascituri, sarà possibile comunicare la presenza di due femmine oppure del cromosoma Y. Tranquility Cell Free Fetal DNA Sequencing Report Singleton Pregnancy Patient information Name: Date of Birth: Gestational age at the time of blood draw (weeks): Patient ID: Doctor s name: Sample ID Order ID: Sample ID: Blood Draw Date: Receipt Date: Your results Report Date: Chromosomes Chromosomes 21 Chromosomes 18 Chromosomes 13 Sex chromosomes Microdeletions (Reported if detected) Risk LOW LOW LOW LOW No Aneuploidy Dectected Interpretation Results consistent with two copies of chromosomes 21 Results consistent with two copies of chromosomes 18 Results consistent with two copies of chromosomes 13 Results consistent with two copies of sex chromosomes Alta specificità > 99,9% Questo valore esprime la capacità di Tranquility di evitare falsi positivi. I falsi positivi inducono a esami invasivi rischiosi e non necessari, mentre il feto non presenta l anomalia indagata. Trisomia T21 T18 T13 N Sensibilità > 99.9% > 99.9% > 99.9% N. di casi 43/43 10/10 5/5 95% IC % - 100% 58.7% % 35.9% - 100% Specificità > 99.9% > 99.9% > 99.9% N. di casi 394/ / /432 95% IC % - 100% 98.7% - 100% 98.7% - 100% Trisomie 21, 18, 13 (CE-IVD) In caso di Risultato coerente con due copie del cromosoma, questo vuol dire che è stato individuato il numero atteso di copie di cromosomi. Questo risultato comporta un rischio Basso. In caso di Risultato coerente con una trisomia, questo vuol dire che il test ha individuato tre copie di uno dei cromosomi indici di trisomia. Questo risultato comporta un rischio Alto. Aneuploidie sessuali* In caso di Risultato coerente con due cromosomi sessuali, questo vuol dire che è stato individuato il numero atteso di copie dei cromosomi. In caso di Risultato coerente con un aneuploidia dei cromosomi sessuali, questo vuol dire che il test ha individuato un alterazione nel numero dei cromosomi indici di un aneuploidia sessuale. Il tipo di aneuploidia sarà specificato: XXY, XXX, X o XYY. Microdelezioni* Se il risultato è Rilevate, questo vuol dire che sono state individuate una o più microdelezioni. Nel referto saranno precisate la posizione sul genoma e le dimensioni della microdelezione. 1 IC - Intervallo di confidenza Dati disponibili nel sito *Solo per le gravidanze singole 34 / GENOMA Tranquility Approfondimento Scientifico Tranquility / 35

19 G C T C G G A G G G T C C T A C G C C C A C G G A A T C T C G C T G A T T G C T A G C A C A G C A Processi ad alta tecnologia Sequenziamento massivo in parallelo dell intero genoma Tranquility ha ottenuto la certificazione CE-IVD per le trisomie 21, 18 e 13 Una procedura ottimizzata A Purificazione dei frammenti di DNA estratti dal sangue materno B Preparazione dei frammenti di DNA per costituire una libreria ad hoc Tranquility utilizza una procedura automatizzata per assicurare la coerenza e la riproducibilità dei risultati. Genoma ha optato per il metodo del sequenziamento massivo in parallelo dell intero genoma per l elevata precisione dei risultati, il basso tasso di errori degli esami e la capacità di fornire dettagli analitici. Adattatore sequenziamento Indice Molecolare + Adattatore sequenziamento C Immobilizzazione della libreria sul supporto del sequenziamento D Sequenziamento della libreria tramite NGS (Next Generation Sequencing) E Analisi delle informazioni di sequenziamento tramite bioinformatica CGATTTAACT GCTAAATTGC ACCACGAT TGGAGCTA 36 / GENOMA Tranquility Approfondimento Scientifico

20 Purificazione dei frammenti di DNA estratti dal sangue materno A Preparazione dei frammenti di DNA per costituire una libreria ad hoc B Il DNA viene recuperato dal sangue e, dopo centrifugazione, i frammenti liberi sono estratti dal plasma. Il materiale cellulare e proteico è sottoposto a lisi mentre il DNA viene recuperato con perle magnetiche cui si lega in modo selettivo. Il DNA è successivamente purificato e sottoposto a eluizione per ottenere un campione della massima qualità. Tramite un sistema robotico chiuso ad alta capacità di produzione, si possono trattare fino a 96 campioni al giorno con il massimo quantitativo di frammenti di DNA genomico recuperato. Questo sistema consente di evitare gli errori manuali e garantire la coerenza dei risultati. Assicura inoltre la totale tracciabilità per tutta la procedura di purificazione e analisi. Una volta contrassegnati e amplificati, i frammenti di DNA purificati vengono a costituire una libreria di sequenziamento. La preparazione della libreria è automatizzata per migliorare l efficienza e la riproducibilità del processo. I frammenti di DNA sono saldati alle estremità per smussarle e gli adattatori di sequenziamento sono legati su entrambi i lati. Ogni adattatore contiene un indice molecolare ad hoc per il campione che consentirà il riconoscimento delle sue specifiche sequenze. Il campione è purificato e arricchito secondo la costruzione del giusto sequenziamento. Tutti i frammenti preparati costituiscono la libreria di sequenziamento, che è ad hoc per i singoli soggetti e facilmente identificabile grazie all indice molecolare. 38 / GENOMA Tranquility Approfondimento Scientifico Tranquility / 39