Thalassaemias. Thalassaemia Hb Variants. A group of blood deseases caused by a genetically determined. alteration in globin synthesis

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1 Approccio diagnostico delle Varianti Hb Giovanni Ivaldi Laboratorio di Genetica Umana - Settore Microcitemia Ospedali Galliera - Genova

2 A group of blood deseases caused by a genetically determined reduction in globin synthesis A group of blood deseases caused by a genetically determined reduction and alteration in globin synthesis A group of blood deseases caused by a genetically determined alteration in globin synthesis Thalassaemias Thalassaemia Variants Hb Variants Haemoglobinopathies (Haemoglobin disorders)

3 Le Varianti Emoglobiniche Sono dovute a difetti genetici dell Emoglobina, più frequentemente mutazioni puntiformi degli esoni, che di solito comportano la sostituzione di un aminoacido, da cui consegue la formazione di una catena emoglobinica anomala In presenza di una catena anomala si possono produrre effetti diversi così le Varianti si potranno classificare in vari modi: sulla base della catena mutata, dell affinità per l ossigeno, dell instabilità, della % relativa, etc

4 Hb Var : A Database of Human Haemoglobin Variants and Thalassaemias (May 2012) ( Total entries in database 1513 Total haemoglobin variant entries 1128 Total Talassaemia entries 435 Total entries in both variant and thalassaemia categories 51 Entries involving the alpha1 gene 314 Entries involving the alpha2 gene 374 Entries involving the beta gene 799 Entries involving the delta gene 95 Entries involving the Agamma gene 55 Entries involving the Ggamma gene 65 Entries with an isertion mutation 63 Entries with a fusion gene mutation 9 Entries with a deletion mutation 181 Entries with a substitution mutation 1236 Haemoglobins with high oxygen affinity 93 * Unstable Haemoglobins 142 * Methaemoglobins 9 > 500 Var

5 Il Laboratorio ha un ruolo centrale nella diagnosi dei Difetti dell Emoglobina - Al laboratorio di 1 livello pervengono di solito quesiti diagnostici orientati verso i difetti talassemici: raramente si pensa alle Varianti nell ambito della prevenzione - Oggi il fenomeno migratorio, il maggior numero di esami per le emoglobinopatie eseguiti in zone tradizionalmente non a rischio, l utilizzo diffuso di strumenti HPLC per l Hb A 1c contribuiscono a rivelare la presenza di molte più Varianti Hb in gran parte asintomatiche allo stato eterozigote - In seguito al riscontro di un maggior numero di Varianti Hb le conclusioni presuntive del laboratorio di 1 livello sono aumentate: con la necessità di ricorrere ad esami di conferma e talvolta alla caratterizzazione nell ambito di un laboratorio di 2 livello. - La conferma o la caratterizzazione molecolare delle Varianti (in gran parte rare) e la definizione delle loro caratteristiche funzionali si rendono necessarie per le opportune previsioni sul fenotipo clinico associato allo stato eterozigote, a quello omozigote o nella formazione dei Composti con Difetti Talassemici o con altre Varianti.

6 Da: «R accomandaz ioni per la diagnos tica di I livello delle emoglobinopatie» SITE, 2012 Diagramma di Venn con la rappresentazione delle possibili interferenze tra difetti dei geni globinici e metabolici Anche in Italia la Variante Hb maggiormente coinvolta in composti o riscontrata allo stato omozigote è l Hb S: è una Variante che può essere diagnosticata dal laboratorio di 1 livello, dopo una specifica conferma senza dover ricorrere all analisi molecolare.

7 Come o quando si SOSPETTA la presenza di una Variante Hb che suggerisce un approfondimento diagnostico e quindi specifiche INDAGINI DI LABORATORIO? Come per le altre emoglobinopatie: da una storia clinica con sintomi caratteristici da una anamnesi personale o familiare genericamente in base all etnia da esami eseguiti per motivi diversi dalle Hbpatie (es. per l A 1c ) da esami generici eseguiti in epoca preconcezionale durante esami eseguiti alla nascita

8 Al laboratorio di 1 livello deve giungere: - un quesito diagnostico Da: «R accomandaz ioni per la diagnos tica di I livello delle emoglobinopatie» SITE, 2012

9 Al laboratorio di 1 livello deve giungere: - un quesito diagnostico - la richiesta di un insieme di esami utili a riconoscere l eventuale presenza della maggior parte di difetti dell Hb e quindi anche delle Varianti Hb

10 Da: «Raccomandazioni per la diagnostica di I livello delle emoglobinopatie» SITE, Assetto Hb qualiquantitativo Assetto marziale Emocromo

11 Al laboratorio di 1 livello devono giungere: - un quesito diagnostico - la richiesta di un insieme di esami utili a riconoscere l eventuale presenza della maggior parte di difetti dell Hb e quindi anche delle Varianti Hb - alcune informazioni minime sul soggetto - alcune informazioni minime sul soggetto in esame

12 Da: «R accomandaz ioni per la diagnos tica di I livello delle emoglobinopatie» SITE, 2012

13 - un quesito diagnostico - la richiesta di un insieme di esami utili a riconoscere l eventuale presenza della maggior parte di difetti dell Hb e quindi anche delle Varianti Hb - alcune informazioni minime sul soggetto in esame Solo in tal modo il laboratorio potrà adempiere al suo compito in modo appropriato

14 Da: «R accomandaz ioni per la diagnos tica di I livello delle emoglobinopatie» SITE, 2012

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16 Ma a differenza dei difetti Talassemici: NELLA MAGGIOR PARTE DEI CASI I PRINCIPALI CAMBIAMENTI PRODOTTI DALLA MUTAZIONE DI UN SINGOLO NUCLEOTIDE NELLA MOLECOLA Hb (SOSTITUZIONE DI UN AMINOACIDO) O PIU RARAMENTE DELEZIONI O INSERZIONI SONO: Una diversa carica elettrica totale dell Hb mutata Instabilità del tetramero Hb Una diversa affinità per l O 2 (aumentata o diminuita)

17 Nel valutare la presenza di una Variante Emoglobinica occorre ricordare che tra tutte quelle note: il 65% sono asintomatiche il 15% sono instabili il 17% presentano alterata affinità per l ossigeno l 1% sono associate a fenomeni di falcizzazione il 2% hanno un fenotipo simil-talassemico

18 E che la % relativa di una Variante può dipendere dal: Tipo di catena mutata (α,β,δ,γ) Gene coinvolto (es. α2, α1) Stabilità della catena mutata nel tetramero globinico Affinità della catena mutata (facilità a formare legami) risptto alla catena omologa Affinità della variante a formare legami con l ossigeno Effetto positivo o negativo della eventuale associazione con difetti talassemici Anemia e/o carenza di ferro...

19 Da: «R accomandaz ioni per la diagnos tica di I livello delle emoglobinopatie» SITE, 2012

20 Da: «R accomandaz ioni per la diagnos tica di I livello delle emoglobinopatie» SITE, 2012

21 Altri sistemi separativi alternativi a quelli usati durante il 1 livello diagnostico

22 Varianti dell Hb e [Hb A 2 ] (α 2 δ 2 ) (in assenza di difetti talassemici) Varianti delle catene δ : [A 2 + A 2 X] = N Varianti delle catene α : [A 2 + A 2 X] = N Varianti delle catene β non instabili : [A 2 ] = N Varianti delle catene β instabili : [A 2 ] = N o Varianti delle catene γ : [A 2 ] = N

23 Da: «R accomandaz ioni per la diagnos tica di I livello delle emoglobinopatie» SITE, 2012

24 Il Laboratorio nella diagnosi delle VARIANTI alla Nascita

25 G.Ivaldi, L.Leone et al. Biochimica Clinica, 2007; 31(4): 276-9

26 Hb S eterozigote alla nascita adulto

27 -Different Retention time - Similar quantification of the Hb A (apparently) Hb S + β + Thal. (IVSI-110) Molecular studies are required for a final correct identification Homozygous Hb S

28 Hb M Saskatoon: β 63 His>Tyr Neonato Adulto Cianosi, methb cronica

29 Variante instabile delle catene alfa resa più marcata dalla presenza di Alfa Tal. Adulto Hb Contaldo: α 102 Ser>Arg

30 Il Laboratorio nella diagnosi di Varianti nell Adulto (in epoca preconcezionale)

31 Hb S eterozigote + Alfa Talassemia (-3.7Kb) Hb S: 25.3% Test di Sickling

32 Variant II - Beta Thal. Bio-Rad Separazione cromatografica di un soggetto portatore eterozigote della variante emoglobinica Hb S. Diego. La variante non si separa dall Hb A ma ne condiziona l eluzione anticipandola a 2.28 minuti. Separazione cromatografica di un soggetto normale. Si può osservare come l Hb A venga eluita a 2.45 min. E utile osservare che l analisi quali-quantitativa delle frazioni emoglobiniche che ha lo scopo di valutare l eventuale presenza di trait talassemici e di varianti emoglobiniche richiede sempre una attenta lettura e confronto anche dei tempi di ritenzione

33 Da: «R accomandaz ioni per la diagnos tica di I livello delle emoglobinopatie» SITE, 2012

34 Frequenze relative delle Varianti Hb in Italia Hb S Hb D Punjab (Los Angeles) Hb Lepore Hb C Hb Hasharon Hb J Oxford Hb J Sardegna Hb G Copenhagen Hb G St. Josè Hb E Altre (oltre 100) % 68.0 % Personal revision

35 Promuovere Utili e Reciproci Rapporti a vantaggio del Paziente Laboratorio 1 livello Clinica Laboratorio 2 livello

36 Grazie per l attenzione