Centro di saggio Certificazione M.S. 158/245/2005 DRAFT AM1379-4

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1 Pagina: 1 di 7 DRAFT AM VALUTAZIONE DELL ATTIVITÀ ANTIMICROBICA SU LEGIONELLA PNEUMOPHILA DI AGENTE INCORPORATO SU LAMINATO D ALLUMINIO SECONDO ASTM E 2180/01 Programma di Studio n.: AM1379 Contratto n: M06/0879.1MI Committente: ALP s.r.l. Via Vezze, 62/ CALCINATE (BG) Sostanza in esame: ALPactive Direttore dello Studio:... Data:... (Dr. M. Cavalleri) Il presente rapporto non può essere riprodotto parzialmente salvo approvazione scritta dal laboratorio.

2 Pagina: 2 di 7 SOSTANZA IN ESAME La sostanza in esame consiste in un laminato di alluminio ricoperto di polimero contenente sostanza antimicrobica a base di argento. Denominazione: Composizione quali-quantitativa: Stabilità: ALPactive in corso caratterizzazione presso Biolab SpA presunta maggiore di 10 anni CAMPIONE ANALIZZATO I campioni analizzati, rappresentativi della sostanza in esame, consistono in laminati di metallo trattati con antimicrobico a base di argento. In particolare, il campione denominato A consiste in provini di metallo trattati con antimicrobico a base di argento, mentre il campione denominato B consiste in provini di metallo trattati con antimicrobico a base di argento e spazzolati in modo da simulare 1000 interventi di pulizia ed esposti a 150 C per 72 ore per simulare condizioni ambientali avverse. Lotto: 88804/10 Data di preparazione: 21/12/2005 Ricevimento nr.: R Data di ricevimento: 11/04/2006 Id campione nr:

3 Pagina: 3 di 7 CONDIZIONI SPERIMENTALI Metodo di prova Microorganismo test Provini Controllo Tempo di contatto del microrganismo con la sostanza in esame Temperatura e grado di umidità relativa del test Concentrazione contaminante Volume contaminante ASTM E2180 Legionella pneumophila ATCC33152* Laminati (2.5x2.5 cm) in metallo trattati con antimicrobico a base di argento Laminati (2.5x2.5 cm) in metallo non trattati (senza antimicrobico a base di argento) 24±1 ore 37±1 C; 75±5% RH 1-5x10 6 /ml 1 ml *microorganismo non previsto specificamente dal metodo, ma inserito nello studio quale tipico contaminante degli impianti di condizionamento e areazione cui è destinata la sostanza in esame. MATERIALI E METODI APPARECCHIATURA: - normale apparecchiatura da laboratorio, in particolare: - stufa a secco (MEMMERT) - autoclave a vapore (FEDEGARI) - termostato (MEMMERT) - phmetro (BECKMANN) - Agitatore vortex (VELP) - Apparecchio a ultrasuoni (BRANSONIC) REAGENTI: BCYE: (OXOID) - CYE Agar base 12.5g - acqua sterile 450 ml - BCYE- alfa growth supplement 1 flacone in 50 ml di acqua sterile Soluzione fisiologica contenente NaCl (0.85%)

4 Pagina: 4 di 7 Il ceppo batterico è stato fatto crescere su piastra contenente BCYE per ore e poi diluito in acqua fisiologica fino a raggiungere circa la concentrazione di 10 8 CFU/ml. Successivamente, 1 ml di sospensione è stato diluito 1:100 in un liquido semigelatinoso composto da agar-agar a una concentrazione dello 0.3% e NaCl allo 0.85% equilibrato a 45 ±2 C. In questo modo è stata ottenuta una sospensione batterica pari a 1-5x10 6 CFU/ml. 1 ml di questa sospensione è stato inoculato con una siringa direttamente sui provini A e B e sul controllo, in modo tale che l inoculo si distribuisse in maniera omogenea sulla superficie di saggio formando uno pseudo-biofilm. I provini sono stati lasciati a contatto con la sospensione batterica per 24±1 ore alla temperatura di 37±1 C e a un umidità relativa pari al 75±5%.. Il recupero, effettuato al tempo 0 e dopo 24 ore di contatto è stato effettuato prendendo i provini con pinzette sterili e immergendolo in 100 ml di soluzione fisiologica e sottoponendolo a ultrasuoni per 1 minuto. L efficacia neutralizzante della soluzione fisiologica è stata verificata n un saggio preliminare. E stato poi prelevato 1 ml della soluzione di recupero, piastrato su BCYE e incubato a 37±1 C per 48±1 ore. Il numero di CFU/ml è stato contato mediante diluizioni successive 1:10 in acqua fisiologica e semina di 1 ml su piastra, eseguita in triplo. BIBLIOGRAFIA 1 ASTM E 2180/01 (presente metodo) 2 ASTM E 1054: Practice for evaluation of inactivators of antimicrobial agents used in disinfectant, sanitizer, antiseptic, or preserved products 3 ASTM G 21/96: Practice for determining resistance od synthetic polymeric materials to fungi. CALCOLO ED ESPRESSIONE DEI RISULTATI I risultati sono stati espressi in forma di riduzione percentuale della contaminazione batterica del trattato rispetto al controllo (bianco), secondo quanto prescritto dal metodo ASTM E 2180/01: è stata calcolata la media geometrica del numero di microorganismi recuperati nelle tre repliche effettuate per i due provini trattati (A e B) e per il provino di controllo; quindi è stata calcolata la differenza percentuale tra l antilogaritmo della media geometrica del provino di controllo e l antilogaritmo della media geometrica del provino trattato. Media geometrica = (LogR1 + LogR2 + LogR3)/3 R1 = numero totale di microorganismi recuperati dopo esposizione alla sostanza in esame o al controllo e incubazione (replica 1) R2 = numero totale di microorganismi recuperati dopo esposizione alla sostanza in esame o al controllo e incubazione (replica 2) R3 = numero totale di microorganismi recuperati dopo esposizione alla sostanza in esame o al controllo e incubazione (replica 3)

5 Pagina: 5 di 7 Riduzione % = (a-b)x100/a a = antilog(media geometrica) del campione trattato b = antilog(media geometrica) del controllo Il saggio è stato considerato valido quando il conteggio iniziale è stato uguale o superiore a 10 6 CFU/ml. RISULTATI La sospensione di partenza presentava una concentrazione pari a 1.0x10 6. Sono quindi soddisfatti i criteri di accettabilità del saggio. La tabella qui sotto riporta i valori delle medie geometriche su 3 repliche del numero totale (numero che tiene quindi conto sia del fattore di diluizione della piastra contata, sia della diluizione 1:100 dovuta all immersione del provino di metallo inoculato con un 1 ml di sospensione iniziale in 100 ml di diluente di recupero) di microorganismi recuperati dopo esposizione alla sostanza in esame o al controllo e dopo incubazione. L.pneumophila (recupero dopo 24 ore) B (ALPactive + spazzolamento A (ALPactive) + esposizione Controllo a 150 x 72 ore) < Dopo 24 ore di esposizione alla sostanza in esame, il provino A presenta una riduzione della contaminazione rispetto al controllo nelle stesse condizioni sperimentali, superiore al 99.76%. Dopo 24 ore di esposizione alla sostanza in esame, il provino B presenta una riduzione della contaminazione rispetto al controllo nelle stesse condizioni sperimentali, pari al %. Nota: Già al tempo 0 si osserva una riduzione anche se minima delle CFU/ml per i provini A e B rispetto al controllo (vedi Appendice).

6 Pagina: 6 di 7 VALUTAZIONE DELL ATTIVITÀ ANTIMICROBICA SU LEGIONELLA PNEUMOPHILA DI AGENTE INCORPORATO SU LAMINATO D ALLUMINIO SECONDO ASTM E 2180/01 APPENDICI

7 Pagina: 7 di 7 TABELLE Le tabelle qui sotto riportate contengono i dati relativi alle CFU/ml di Legionella pneumophila recuperate rispettivamente al tempo 0 e dopo 24±1 ore di esposizione del microorganismo test alla sostanza in esame, tenendo in considerazione il fattore di diluizione della piastra contata. L. pneumophila (recupero al tempo 0) B (ALPactive + Sostanza spazzolamento A + esposizione Controllo (ALPactive) a 150 x 72 ore) CFU/ml L. pneumophila (recupero dopo 24 ore) B (ALPactive + Sostanza spazzolamento A + esposizione Controllo (ALPactive) a 150 x 72 ore) Replica 1 < Replica 2 < Replica 3 <