AMPLIFICAZIONE IN VITRO DEL DNA REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR)

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1 AMPLIFICAZIONE IN VITRO DEL DNA REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR)

2 PCR: reazione polimerasica a catena Inventata da Kary Mullis negli anni 80 (premio Nobel 1993) Serve per ottenere una grande quantita di una specifica sequenza di DNA in vitro Puo amplificare un tratto di DNA per piu di 1 milione di volte

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4 ELEMENTI NECESSARI ALLA REAZIONE: 1- DUE OLIGONUCLEOTIDI COMPLEMENTARI A DUE REGIONI CHE SI TROVANO SU FILAMENTI OPPOSTI DEL DNA STAMPO AI LATI DELLA REGIONE CHE SI VUOLE AMPLIFICARE 2- DNA STAMPO CHE CONTENGA LA REGIONE DA AMPLIFICARE 3- POLIMERASI TERMOSTABILE (NON VIENE DENATURATA SE PORTATA A 95 C) 4- I 4 DESOSSINUCLEOTIDI TRIFOSFATI

5 IL PROCESSO DI PCR PREVEDE UN CERTO NUMERO DI CICLI. OGNI CICLO CONSISTE DI 3 PASSAGGI: 1- DENATURAZIONE: TEMP. 95 C. IL DNA STAMPO VIENE DENATURATO, I DUE FILAMENTI SI SEPARANO 2-APPAIAMENTO: 55 C CIRCA. I PRIMERS SI APPAIANO CON IL DNA STAMPO 3- SINTESI: TEMP.72 C E OTTIMALE PER IL FUNZIONAMENTO DELLA Taq (Termus aquaticus) POLIMERASI

6 PCR: Reazione a catena della polimerasi Metodo di amplificazione del DNA usando una polimerasi termostabile quale la Taq DNA polimerasi, uno stampo di DNA, un eccesso di primers e dideossinucleotidi (dntp) in un buffer.

7 PCR: Reazione a catena della polimerasi

8 PCR: Reazione a catena della polimerasi

9 PCR: amplificazione n.ro cicli n.ro sequenze bersaglio La sequenza bersaglio è la sequenza di DNA sintetizzata tra i due primers Occorre ~1 g di DNA per l analisi di una sequenza o una digestione con enzimi di restrizione tali da poter essere visibili in elettroforesi. Se vi sono ~5 pg di DNA/cellula umana (5x10-12 g) allora ~1 g of DNA potrebbe essere isolato da cellule ma avremmo un miscuglio di tutti i geni. In 1 g di DNA genomico, una copia singola di un gene (300 bp) equivarrebbe a ~0.1 pg di DNA. Questo 0.1 pg di DNA potrebbe essere amplificato mediante PCR producendo 0.8 g in 25 cicli e 27 g in 30 cicli.

10 PCR VANTAGGI: Sensibilita Rapidita Si presta all analisi simultanea di molti campioni (high throughput) Si presta all analisi simultanea di diverse sequenze sullo stesso campione Si presta all analisi di DNA degradato o incluso in mezzi strani, o fissato SVANTAGGI: Sensibilita (rischio di contaminazioni-falsi positivi) Variabile efficienza di amplificazione a seconda della sequenza Richiede conoscenza di base delle sequenze da amplificare e messa a punto per coppie di oligonucleotidi di innesco (primers) Può sintetizzare frammenti relativamente corti La sintesi è imprecisa e introduce errori nella sequenza (la Taq pol non possiede attività 3 ->5 esonucleasica)

11 Esempi di utilizzo della PCR Su DNA: segnalare la presenza o meno di sequenze specifiche (mutazioni, inserzioni virali, micro-organismo patogeni) - > PCR DIAGNOSTICA Amplificare frammenti specifici da usare in seguito come sonde oppure da clonare Su RNA messaggero (RT-PCR): segnalare la presenza di specifiche molecole di RNA (espressione genica, presenza di RNA di micro-organismi infettivi) Amplificare frammenti specifici da usare in seguito come sonde oppure da clonare - isolare cdna specifici per determinati geni.

12 PCR in genetica forense Quale delle persone sospette può avere commesso il crimine? La tecnica PCR è utile, spesso necessaria, per amplificare il DNA estratto dai reperti trovati sulla scena del delitto. Si usano sonde multi-locus con molti alleli.

13 Diagnosi genetica pre-impianto

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15 PCR utilizzata per rivelare uno specifico mrna: PCR in seguito a trascrittasi inversa (RT-PCR) Estrazione dell RNA Purificazione dell RNA poliadenilato (mrna) Sintesi del cdna con la trascrittasi inversa 3 5 cdna mrna TTTTTTTT 5 AAAAAAAA 3

16 PCR utilizzata per rivelare uno specifico mrna: 3 5 PCR in seguito a trascrittasi inversa (RT-PCR) cdna mrna TTTTTTTT 5 AAAAAAAA 3 Amplificazione della sequenza di interesse con oligonuceotidi di innesco specifici TTTTTTTT 5 AAAAAAAA 3 Analisi dei prodotti dell amplificazione (elettroforesi)

17 Number of molecules La PCR non e una tecnica quantitativa Number of cycles

18 PCR quantitativa: RT-PCR in tempo reale Utilizza particolari sostanze la cui fluorescenza si rivela quando intercalano la catena di DNA sintetizzata durante la reazione di amplificazione. L utilizzo di appositi apparecchi permette la misurazione della fluorescenza accumulata in tempo reale, proporzionale al numero di molecole amplificate e quindi al numero di molecole presenti in partenza

19 Log[DNA] Polymerase Chain Reaction: resa Resa teorica: 2 n P=(2) n T Il prodotto (P) incrementa esponenzialmente con il numero di cicli di PCR (n) Il prodotto di PCR dipende da T,numero di copie di template di partenza Lineare Plateau Esponenziale Prodotto variabile N cicli termici

20 Polymerase Chain Reaction: plateau Resa effettiva: effetto plateau Il processo di duplicazione non procede all infinito, esso è limitato da: Quantità dei primers Attività della Taq polimerasi Reannealing dei filamenti Raggiunto il plateau non si osserva più un incremento nei prodotti

21 Soluzioni U t i l i z z a r e i d a t i o t t e n u t i d u r a n t e la f a s e e s p o n e n z i a l e Il prodotto di PCR è proporzionale al template iniziale Questo è reso possibile mediante il rilevamento, di una fluorescenza, che è p r o p o r z i o n a l e a l p r o d o t t o d i P C R La fluorescenza, durante ogni ciclo di amplificazione, può essere rilevata utilizzando uno strumento quantitativo ma anche dei marcatori fluorescenti il cui accumulo segue la stessa cinetica della reazione di PCR

22 RT-PCR convenzionale Real-time RT-PCR Reverse transcription Reverse transcription PCR reaction Nested PCR reaction Gel electrophoresis DNA sequencing Southern blot Manual or automated analysis PCR reaction Quantitative result

23 Perché Real-Time? Misura l'amplificazione in tempo reale durante la fase esponenziale della PCR, quando cioè l'efficienza di amplificazione è influenzata minimamente dalle variabili di reazione, permettendo di ottenere risultati molto più accurati rispetto alla PCR t r a d i z i o n a l e " e n d p o i n t "

24 RT-PCR quantitativa Rilevamento della fluorescenza associata all amplificazione Il prodotto di PCR non viene analizzato su gel di agarosio Analisi del prodotto di fluorescenza tramite computer Plot lineare Incremento di fluorescenza Cicli di PCR

25 Analisi tramite software

26 Chimiche fluorescenti per PCR Real-Time La fluorescenza si genera durante la PCR per effetto di diverse possibili reazioni chimiche Le chimiche principali sono basate sia sul legame di coloranti fluorescenti che si intercalano nella doppia elica di DNA, come il SYBR Green, sia sull'ibridazione di sonde specifiche.

27 SYBR Green

28 SYBR Green: principio Utilizza una molecola fluorescente non specifica che si lega al solco minore del DNA

29 SYBR Green All inizio del processo di amplificazione, la miscela di reazione contiene DNA denaturato, primers e la molecola fluorescente

30 SYBR Green Dopo l annealing dei primers, si legano poche molecole fluorescenti alla doppia elica.

31 SYBR Green Durante l elongazione si verifica un aumento di fluorescenza che corrisponde all aumento del numero di copie dell amplicone

32 SYBR green Metodica semplice Possono essere utilizzati primers in uso in qualitativa Non costosa Non-specifica La molecola fluorescente si lega random a tutte le doppie eliche, includendo i dimeri di primers È necessario ottimizzare la metodica per evitare la formazione di prodotti aspecifici

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34 TaqMan

35 TaqMan La Real-Time PCR si può realizzare mediante l impiego: coloranti intercalanti ( es. SYBR green), che si legano in m a n i e r a a s p e c i f i c a a t u t t o il D N A sonde ad ibridazione, specifiche per il frammento di interesse, m a r c a t e c o n m o l e c o l e f l u o r e s c e n t i Esistono diversi tipi di sonde: Dual-labeled (come le sonde TaqMan) Molecular beacons Scorpion Sonde FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)

36 Sonde TaqMan La sonda di tipo TaqMan è un oligonucleotide che, come i primers della PCR, viene disegnato per essere complementare a l l a s e q u e n z a b e r s a g l i o da a m p l i f i c a r e Primer 3 R Q 5 3 Primer La sonda è disegnata in modo da ibridarsi all interno del frammento amplificato nella reazione di PCR

37 Sonda TaqMan Presenta all estremità 5 un fluoroforo Reporter ed a l l e s t r e m i t à 3 u n a m o l e c o l a Q u e n c h e r 5 3

38 Reporter-Quencher Dye Quencher 5,6 FAM BHQ-1/TAMRA HEX/JOE Texas Red/ROX BHQ-2 Cy5/Quasar670 BHQ-2 BHQ-2 ( or-3) 6-carbossifluoresceina 6-carbossitetrametilrodamina

39 Reporter-Quencher 5 REPORTER (R): fluorocromo ad alta energia che emette fluorescenza 3 QUENCHER (Q): fluorocromo a bassa energia che spegne la fluorescenza del reporter R Q 5 3 Se R e Q si trovano vicini, Q spegne l'effetto di R perchè i fotoni di R vengono assorbiti da Q

40 Real-Time PCR: attività 5 >3 esonucleasica R Q 5 R Q R Q 5 3 5

41 L aumento di fluorescenza del Reporter è direttamente proporzionale al numero di ampliconi generati Forward primer Probe Reverse primer

42 Real-Time PCR: applicazioni Quantificazione virale Quantificazione dell espressione genica Efficacia della terapia farmacologica Misura dei danni al DNA Controllo di qualità e validazione dei saggi Detenzione dei patogeni Controllo degli OGM Genotyping