Diagnosi prenatale di aneuploidie fetali da DNA fetale circolante nel plasma materno
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- Bernardo Catalano
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1 Diagnosi prenatale di aneuploidie fetali da DNA fetale circolante nel plasma materno Francesca Torricelli SOD Diagnostica Genetica AOU- Careggi Firenze Pievesestina, 12 Ottobre 2013
2 1. Introduzione: diagnosi prenatale non invasiva (NIPD), cellule fetali e DNA libero circolante cffdna 2. Le tecnologie di sequenziamento massivo in parallelo e i test prenatali non invasivi: overview 3. La determinazione della frazione fetale 4. Il progetto: risultati preliminari 5. Discussione e conclusioni
3 Introduzione Negli ultimi decenni sono state sviluppate importanti linee di ricerca nel campo della diagnosi prenatale non invasiva (NIPD) in epoca gestazionale precoce, sia per la diagnosi delle aneuploidie che per la diagnosi delle malattie monogeniche. E stata dimostrata la presenza di cellule fetali nella circolazione periferica materna ed è stata documentata la presenza di DNA fetale libero circolante (cff DNA: cell free fetal DNA), fin dalle prime settimane di gravidanza. Le modalità con cui vengono effettuati lo screening e la diagnosi prenatale stanno rapidamente cambiando in tutto il mondo Il cambiamento avviene in tempo reale ed è molto rapido Chitty LS, 2013
4 Scarsamente rappresentate nel sangue materno (1-6 cellule/ml di sangue materno) Difficili da isolare Cellule fetali nel circolo materno Nonostante in letteratura siano stati descritti diversi casi di NIDP eseguiti con successo utilizzando cellule fetali presenti nel circolo materno, le metodologie d indagine utilizzate non hanno trovato applicazione nella pratica clinica. Infatti le cellule fetali sono: Presenti nel circolo materno per anni dopo il parto
5 DNA fetale libero circolante nel plasma materno (cffdna) Nel 1948 venne descritta per la prima volta, la presenza di acidi nucleici liberi nel plasma materno (Mandel et al., 1948). Nel 1997, il gruppo di Lo riuscì ad amplificare specifiche sequenze del cromosoma Y, dimostrando per la prima volta che il cffdna libero è presente nel plasma di donne in attesa di un feto di sesso maschile. Una prima stima della concentrazione del cffdna è stata determinata mediante real time PCR: il cffdna aumenta durante la gravidanza in maniera progressiva, partendo da una concentrazione frazionaria media del 3,4% sino al raggiungimento di un valore massimo del 6,2% relativo al termine.
6 DNA fetale libero circolante nel plasma materno (cffdna) Nel 2008 utilizzando metodologie di nuova generazione come la PCR digitale, è stato dimostrato che (Lun et al, 2008): Il DNA libero circolante è una «mistura» di DNA materno e di DNA placentare (deriva dall apoptosi delle cellule del citotrofoblasto). Frammentato < 300 bp Presente a partire dalla 5 a settimana di gravidanza Costituisce il 5-15% del DNA circolante nel plasma materno
7 DNA fetale libero circolante nel plasma materno (cffdna) Caratteristiche cffdna Presente nel plasma materno precocemente (4-5 sett) (Lo YM et al 1998) Vantaggi Diagnosi precoce Rapida clearance (Lo YM et al 1999) Gravidanza-specifico Rappresentativo del genoma fetale totale (Lo Y et al 2010) Analisi di qualsiasi regione genomica fetale
8 Prime applicazioni diagnostiche del cffdna 1. Determinazione del sesso fetale (mediante real-time PCR per mezzo di sequenze specifiche del cromosoma Y ): Rischio di malattie X-linked (emofilia e distrofia muscolare di Duchenne ) Genitali ambigui evidenziati ecograficamente 2. Determinazione precoce l RhD fetale in donne Rh- Identificazione di sequenze specifiche del gene RHD nel plasma materno mediante real-time PCR): Profilassi precoce mirata solo in casi di feti RhD+ Evitare i rischi legati alla somministrazione di emoderivati
9 Le tecnologie di sequenziamento massivo in parallelo (MPS) e i test prenatali non invasivi: overview
10 Past and Current Sequencing Technologies SANGER MPS
11 MPS e test prenatali non invasivi Le nuove tecnologie di sequenziamento (MPS), oltre a consentire il sequenziamento massivo dell intero esoma/genoma, possono essere utilizzate per QUANTIFICARE il DNA presente in un campione biologico contando il numero di sequenze ottenute Questo approccio consente, a partire da DNA totale libero circolante (fetale e materno) isolato da plasma, di identificare variazioni nel numero di copie di uno specifico cromosoma e identificare le aneuploidie più frequenti (T13, T18, T21 e aneuploidie dei cromosomi sessuali)
12 MPS e test prenatali non invasivi Nel 2007 due gruppi distinti avevano ipotizzato che sequenziare, mappare e contare le molecole di DNA avrebbe permesso di identificare una trisomia fetale anche in presenza di grosse quantità di DNA materno e senza necessità di isolare il DNA fetale
13 MPS e test prenatali non invasivi Nel 2008 sono stati pubblicati esperimenti proof of principles che dimostrano la possibilità di identificare aneuploidie fetali mediante sequenziamento massivo in parallelo (MPS) del ccffdna
14 : validazione clinica
15 Whole Genome Sequencing cff DNA Isolamento da plasma del DNA totale circolante Maternal DNA Il DNA totale circolante (materno e fetale) viene sequenziato, e il numero delle sequenze relative ai cromosomi di interesse è quantitativamente comparato con il n di sequenze «atteso» per quel cromosoma in un campione euploide.
16 Target Capture Sequencing cff DNA Estrazione DNA Totale circolante Ibridazione con sonde specifiche Maternal DNA Specifiche sequenze di DNA, quelle relative ai cromosomi di interesse, vengono sequenziate Lavaggio e eliminazione del DNA non catturato Sequenziamento chr 13, 18, 21, X e Y
17 MPS e test prenatali non invasivi Da ottobre del 2011 i test prenatali non invasivi sono offerti in commercio Sequenom Verinata Ariosa* Natera Test Name MaterniT21Plus Verifi Harmony Prenatal Test Panorama Prenatal Test Gestational age >10 weeks >10 weeks >10 weeks >10 weeks Required fetal fraction 4% 4% 4% not indicated Genetic testing method Whole genome MPS Whole genome MPS Targeted MPS SNP-based Targeted MPS Conditions T13, T18, T21 and sex chromosome aneuploidies T13, T18, T21 and sex chromosome aneuploidies T13, T18, T21 and sex chromosome aneuploidies (optional) T13, T18, T21 and sex chromosome aneuploidies Turnaroud 8-10 days 8-10 days 8-10 days 15 days Test result Positive/Negative Aneuploidy detected, suspected, or no aneuploidy detected Risk of aneuploidy Risk of aneuploidy
18 MPS e test prenatali non invasivi FALSI POSITIVI (0,01 1% su popolazione ad alto rischio per aneuploidie) Indipendentemente dall approccio utilizzato (targeted o whole genome) in circa 1:200 casi vi e discordanza tra NIPT e risultato del cariotipo ottenuto con procedure invasive. POSSIBILI SPIEGAZIONI ( biologiche più che tecniche!) - Mosaicismi confinati alla placenta - Anomalie cromosomiche materne - Presenza di tumore solido materno POCHI STUDI SU POPOLAZIONE LOW-RISK: IL TASSO DI FALSI POSITIVI POTREBBE AUMENTARE NELLA POPOLAZIONE GENERALE (AD OGGI STUDIATE SOLO POPOLAZIONI AD ALTO RISCHIO PER ANEUPLOIDIE) Chitty and Bianchi 2013 Prenat Diagn
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20 MPS e test prenatali non invasivi FALSI NEGATIVI o MANCATA RISPOSTA Molti casi dovuti ad una insufficiente quantità di DNA FETALE presente nel plasma materno (Fetal Fraction) la Fetal Fraction deve essere maggiore o uguale al 4% del DNA totale per assicurare una buona accuratezza del test. Motivi biologici/tecnici (es. cromosoma 13: basso contenuto in GC)
21 Fetal Fraction (FF) FF(%) = ccfdna fetale ccfdna totale (fetale + materno) FF influenza l accuratezza della NIPD campioni con FF < 3-4% sono considerati non idonei per l analisi (Canick et al. 2013) in quanto possono dare origine a risultati falsi negativi o non interpretabili (fallimento del test). La determinazione della FF rappresenta un importante step preliminare (pre-mps) per selezionare i campioni che possono essere utilizzati per NIPD.
22 Fetal Fraction (FF) FF è influenzata principalmente da: FF non influenzata da: BMI (Body Mass Index) materna Periodo gestazionale Tipo di aneuploidia Gravidanze singole vs gemellari Preeclampsia Età materna Valore NT
23 (Wang et al. 2013) Fetal Fraction e BMI FF diminuisce all aumentare del BMI a causa dell elevato turnover degli adipociti che determina un aumento del DNA circolante materno Fetal Fraction e periodo gestazionale Studio condotto su 22,384 campioni di plasma Tra la settimana di gravidanza il DNA fetale aumenta dello 0.1% ogni settimana (nel 2% dei casi FF era <4%) Oltre la 21 settimana si ha un aumento del DNA fetale dell 1% ogni settimana
24 Fetal Fraction e gravidanze gemellari La FF non aumenta nelle gravidanze gemellari FF per feto nelle gravidanze gemellari diminuisce fino al 50% rispetto alla gravidanza singola Ad oggi pochi studi FF e aneuploidie La FF media delle gravidanze con maschio euploide è 12.6% T21 è del 13.5% T18 è del 8.9% T13 è del 9% Monosomia X è del 10.6% Rava et al. 2013
25 FF e Preeclampsia A settimane di gestazione la quantità di DNA di derivazione fetale è più elevata nelle gravidanze che successivamente svilupperanno preeclampsia FF può essere utilizzata per individuare le gravidanze a rischio di preeclampsia (con cut-off di 512 Εq/mL: sensibilità e specificità del 100%!!) Papantoniou et al. 2013
26 NIPD in ITALIA Come in altri paesi, la NIPD è disponibile solo in laboratori privati e non in laboratori pubblici I test sono forniti da società commerciali estere (Germania, USA, Cina) Rischio principale: marketing diretto sulle donne in gravidanza bypassando assistenza sanitaria e consulenza
27 DISCUSSIONE E CONCLUSIONI Come può essere inserita la NIPD nel percorso diagnostico? 1. Come integrazione dell attuale screening del primo trimestre di gravidanza. Il prelievo potrebbe essere eseguito in parallelo con quello per il test combinato (marcatori biochimici). 2. Solo nelle donne con test combinato positivo (o comunque per gravidanze con aumentato rischio per aneuploidie) per selezionare più accuratamente i casi su cui eseguire DP invasiva. 3. In sostituzione al test combinato Considerare aspetti scientifici, emozionali, legali, etici, finanziari OBIETTIVO COMUNE: RIDURRE IL RICORSO ALLE TECNICHE INVASIVE SELEZIONANDO PIU ACCURATAMENTE LE DONNE A RISCHIO
28 Specificità e sensibilità dello screening del primo trimestre TEST COMBINATO: Test Combinato vs NIPT Su 20 gravidanze con Bi-Test positivo, una risulterà non affetta da sindrome di Down. Falsi Positivi: 3-5 % Su 20 gravidanze affette dasindrome di Down, 3-4 non vengono evidenziate dal Bi-test. Sensibilità: % NIPD: alta SENSIBILITA e SPECIFICITA Falsi positivi 1-2% T 21 detection rate 98-99% T13 detection rate 44-91% Tuttavia nell interpretazione del risultato di un test la prevalenza della condizione esaminata ha una rilevanza fondamentale T18 detection rate 83-95%
29 Valutazione delle tecnologie Il California Technology Assessment Forum (CTAF) ha il compito di valutare le tecnologie emergenti in medicina, allo scopo di identificare quelle in grado di migliorare la salute. Criteri per la valutazione della tecnologia Criterio 1 Approvazione degli organi governativi Criterio 2 Criterio 3 Le evidenze scientifiche devono permettere conclusioni sull efficacia della sua applicazione in termini di esiti per la salute Deve migliorare la salute Criterio 4 Criterio 5 Deve avere gli stessi benefici delle alternative esistenti I miglioramenti devono essere raggiungibili anche al di fuori degli ambiti di ricerca
30 Valutazione delle tecnologie Lo studio è stato condotto attraverso revisione dei dati di letteratura (pubblicati fino a Maggio 2012) (Medline database, Cochrane clinical trials database, Cochrane reviews database, database of Abstracts of Reviews of Effects) Criteri di inclusione per lo studio: Valuta il test su cffdna come screening prenatale Confronta il test su cffdna rispetto al gold standard Include solo esseri umani E pubblicato in inglese come articolo peer-reviewed
31 Criteri per la valutazione della tecnologia 1) Approvazione degli organi governativi 2) Le evidenze scientifiche devono permettere conclusioni sull efficacia della sua applicazione in termini di esiti per la salute V I test negli USA vengono effettuati presso laboratori CLIA-certified V 3) Deve migliorare la salute V per T21 e T18 in popolazioni ad alto rischio, come test di screening X per T13 in popolazioni ad alto rischio, come test di screening X nella popolazione generale, come test di screening 4) Deve avere gli stessi benefici delle alternative esistenti V per T21 e T18 in popolazioni ad alto rischio, come test di screening avanzato X per T13 in popolazioni ad alto rischio, come test di screening avanzato X in popolazioni ad alto rischio, come test di screening di primo livello X nella popolazione generale, come test di screening di primo livello 5) I miglioramenti devono essere raggiungibili anche al di fuori degli ambiti di ricerca V per T21 e T18 in popolazioni ad alto rischio, come test di screening avanzato X per T13 in popolazioni ad alto rischio, come test di screening avanzato X in popolazioni ad alto rischio, come test di screening di primo livello X nella popolazione generale
32 DISCUSSIONE E CONCLUSIONI La diagnosi prenatale non invasiva delle aneuploidie fetali può essere considerata il metodo standard per lo screening della T21 per tutte le donne in gravidanza? ASPETTI A FAVORE DELL INTRODUZIONE DELLA NIPD COME TEST DI SCREENING NELLA POPOLAZIONE GENERALE 1. Incremento della detection rate e riduzione del n di fasi positivi (accuratezza del 99% per trisomia 21) rispetto all attuale test di screening. 2. Riduzione dell accesso alle indagini invasive con conseguente riduzione del rischio di aborto (0,5-1%) legato alla manovra: diverse donne non si sottopongono a DP invasiva anche con test di screening positivo a causa del rischio di aborto. 3. Obbligo professionale di fornire il test migliore (più accurato) tra quelli disponibili. D. Bianchi, D.oepkes, A. Ghidini. 2013
33 DISCUSSIONE E CONCLUSIONI ASPETTI CONTRARI ALL INTRODUZIONE DELLA NIPD COME TEST DI SCREENING NELLA POPOLAZIONE GENERALE 1. Poiché sono disponibili solo dati preliminari sulle gravidanze gemellari, in questi casi il test non è raccomandato. 2. E necessario un esame ecografico prima del test per confermare : la vitalità del feto, gravidanza non gemellare e per stabilire la datazione gestazionale. 3. Ad oggi non ci sono dati sperimentali sulla applicazione del test nella popolazioni a basso rischio che valutino: il tasso di fallimento del test, idoneità dei campioni (FF), il cut-off per il peso della gestante oltre il quale non è possibile effettuare NIPD, la FF necessaria per l identificazione di mosaicismi per le più comuni aneuploidie. 4. Mancanza di linee guida e di controlli di qualità esterni. 5. Un analisi completa sui costi-benefici non è ancora stata riportate per le popolazioni a basso rischio Questi aspetti hanno importanti ripercussioni in termini costi, tempi di refertazione, qualità del dato, impatto sulla scelta e sui tempi per effettuare un test diagnostico invasivo e per l eventuale interruzione di gravidanza. D. Bianchi, D.oepkes, A. Ghidini. 2013
34 DISCUSSIONE E CONCLUSIONI La diagnosi prenatale non invasiva delle aneuploidie fetali può essere considerata il metodo standard per lo screening della T21 per tutte le donne in gravidanza? Sebbene sia presumibile ipotizzare che la NIPD possa essere una metodica accurata anche nella popolazione a basso rischio, i dati di letteratura non sono ad oggi sufficienti per proporre il test alla popolazione a basso rischio. E necessaria una adeguata formazione del personale sanitario coinvolto nel percorso clinico Ogni tecnica ha i suoi vantaggi/svantaggi. Tuttavia non sono ancora disponibili dati sulla performance, la resa e i costi delle diverse metodiche.
35 DISCUSSIONE E CONCLUSIONI La DIAGNOSI PRENATALE NON INVASIVA E UN TEST di SCREENING e NON UN TEST DIAGNOSTICO!! Questo screening non può sostituire il test combinato Non valuta la presenza/assenza di una condizione genetica, ma fornisce una valutazione del RISCHIO per le aneuploidie oggetto dell indagine (T21, T18, T13, aneuploidie cromosomi sessuali) Sempre necessario confermare un risultato positivo/alto rischio con DP invasiva (amniocentesi)!! NIPD deve essere offerta in un contesto di una consulenza pre e posttest:
36 DISCUSSIONE E CONCLUSIONI Potenziali benefici Gli studi attuali sostengono l evidenza che il test su cffdna sia un test di screening avanzato Può essere eseguito in donne che risultino ad alto rischio dopo i test di screening convenzionali allo scopo di definire il rischio in maniera più accurata Ridurre in questo modo l accesso alla diagnosi prenatale invasiva
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