L emostasi in scena. Generalità sull emostasi UNITA DIDATTICA N 1. N. Ciavarella M. Petronelli Bari

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1 L emostasi in scena Generalità sull emostasi UNITA DIDATTICA N 1 N. Ciavarella M. Petronelli Bari 1

2 La disfida di Barletta 13 febbraio

3 La coagulazione come la disfida di Barletta Fattore XI Fattore XII Fattore VII Fattore IX protrombina Fattore von Willebrand Fattore V Fattore VIII fibrinogeno Fattore X Ca++ Fattore XIII fosfolipidi 3

4 Distretti coinvolti nel meccanismo dell emostasi EMOSTASI Endotelio 4

5 da Colucci mod. La fasi della coagulazione amplificazione ATTIVAZIONE propagazione modulazione FIBRINOGENO FIBRINA FXIII stabilizzazione TAFI 5

6 da Scaraggi Fisiologia dell emostasi 1 6

7 da Scaraggi Fisiologia dell emostasi 2 7

8 da Scaraggi Fisiologia dell emostasi 3 FIBRINA TAFI 8

9 I fattori della coagulazione ( raggruppati in base alla loro funzione) Sistema di contatto = HMWK, PK,XII,XI Cofattori = FVIII,FV,Tissue Factor Fattori vitamina K-dipendenti = VII,IX,X,II 9

10 da Semeraro Interazione della superficie piastrinica con le proteine della coagulazione piastrina a riposo piastrina attivata 10

11 da Colucci, mod. Principali inibitori della coagulazione XIa TF VIIa VIIIa IXa apc Va Xa trombina 11

12 Proprietà antitrombotiche dell endotelio Inibisce l attivazione piastrinica Sistema Proteina C AT Attivazione Fibrinolisi trombomodulina EPCR eparansolfato tpa 12

13 Schema del sistema fibrinolitico t-pa u-pa Pro u-pa PAI-1 PAI-2 plasminogeno plasmina α2-ap fibrina FDP 13

14 Proprietà antitrombotiche dell endotelio Inibisce l attivazione piastrinica Sistema Proteina C AT Attivazione Fibrinolisi trombomodulina EPCR eparansolfato tpa 14

15 Schema del sistema fibrinolitico t-pa u-pa Pro u-pa PAI-1 PAI-2 plasminogeno plasmina α2-ap fibrina FDP 15

16 Azioni coagulanti e anticoagulanti della trombina TROMBINA VIIIi VIII VIIIa Tenase Amplificazione e inattivazione Protrombinase V Va Vi Amplificazione e inattivazione Fibrinogeno XIII XIIIa Monomeri e polimerizzazione Fibrinopeptidi A e B polimeri di Fibrina Fibrina stabilizzata Fibrina stabilizzata TAFI TAFIa Fibrina non lisabile piastrine reclutamento piastrine cellule endoteliali trombomodulina release del t-pa Attivazione PC inattivazione V e VIII 16

17 Testa,mod. Test di screening della coagulazione Attivatore, fosfolipidi + Calcio XII XI aptt IX VIII X VII Fattore tessutale + Calcio PT TT Trombina RT Reptilasi V II D-dimero Fibrinogeno Fibrina Fibrinolisi Prodotti di degradazione del Fibrinogeno/Fibrina 17

18 Tempo di protrombina (PT) Plasma citratato povero di piastrine Tromboplastina + Calcio Tempo di formazione del coagulo di fibrina valori normali :

19 Tempo di tromboplastina parziale attivata (aptt) Plasma citratato povero di piastrine Fosfolipidi + Attivatore (acido ellagico,caolino,silice micronizzata) Calcio Tempo di formazione del coagulo di fibrina valori normali :

20 Caso n. 1 PT 2.5 Ratio aptt 1.0 Ratio PLT /μL ipotesi diagnostica Deficit FVII paziente in TAO 20

21 Caso n.2 PT 1.8 Ratio aptt 2.5 Ratio PLT /uL ipotesi diagnostica Deficit X,V,II e FBG (via comune) Paziente in TAO (VII,X,IX,II) Deficit congeniti combinati (V + VIII) oppure (VII,X,IX,II) 21

22 Caso n. 3 PT aptt PLT 1.1 Ratio 2.0 Ratio / μl Ipotesi diagnostica Deficit VIII,IX,XI,XII Presenza di eparina Presenza di LA Inibitori specifici eseguire Mixing test (1:1) TT / RT 22

23 Caso 3 a PT aptt Mixing test PLT 1.1 Ratio 2.0 Ratio 1.12 Ratio /μL ipotesi diagnostica Deficit VIII,IX,XI,XII Pazienti con deficit di XII non sanguinano 23

24 Caso 3b PT aptt Mixing test PLT 1.1 Ratio 2.1 Ratio 1.8 Ratio /μL Ipotesi diagnostica Presenza di lupus anticoagulant Presenza di inibitore specifico eseguire Test specifici 24

25 Caso 3c PT aptt TT RT PLT 1.0 Ratio >3.0 Ratio >3.0 Ratio 1.1 Ratio /uL ipotesi diagnostica Presenza di eparina 25

26 Tempo di trombina Plasma citratato povero di piastrine Trombina Tempo di formazione del coagulo di fibrina Conversione del fibrinogeno in fibrina Sensibile all eparina valori normali :

27 Principali applicazioni diagnostiche del TT Cause congenite Ipo-disfibrinogenemia Cause acquisite Epatopatia scompensata D.I.C. Paraproteine Eparina (non frazionata > frazionata) 27

28 Tempo di Reptilasi Plasma citratato povero di piastrine Reptilasi Conversione del valori normali :17-20 fibrinogeno in fibrina Cause congenite Ipo-disfibrinogenemia Insensibile all eparina 28

29 Principali applicazioni diagnostiche del TT Cause congenite Ipo-disfibrinogenemia Cause acquisite Epatopatia scompensata D.I.C. Paraproteine Eparina (non frazionata > frazionata) 29

30 Tempo di Reptilasi Plasma citratato povero di piastrine Reptilasi Conversione del valori normali :17-20 fibrinogeno in fibrina Cause congenite Ipo-disfibrinogenemia Insensibile all eparina 30

31 Caso 3d PT 1.3 Ratio aptt 1.4 Ratio TT RT 2.2 Ratio 2.0 Ratio PLT /μL Ipotesi diagnostica Ipo-disfibrinogenemia eseguire Dosaggio Fibrinogeno (funzionale/immunologico) 31

32 Dosaggio del Fibrinogeno (sec.von Clauss) Plasma citratato povero di piastrine(diluito 1:10) eccesso di TROMBINA valori normali :17-20 Il tempo di coagulazione dipende solo dal contenuto del fibrinogeno 32

33 Caso 4 PT aptt TT RT Fbg D-Dimero PLT 1.4 Ratio 1.3 Ratio 1.4 Ratio 1.4 Ratio 100 mg/dl 2000/μg/L /μL Score per DIC: PLT,PT,FBG,D-D Ipotesi diagnostica : DIC 33

34 Dosaggio del D-Dimero Metodi che si basano su un sistema fotometrico o turbidimetrico Rapidi (5-10 min) Usano tubo primario Automatizzabili, non richiedono un apparecchio dedicato Hanno sufficiente sensibilità e valore predittivo negativo? Espressione dei risultati Cut - off = SI! valori di riferimento = NO! 34

35 Il campione da analizzare deve sempre pervenire accompagnato dal modulo di richiesta, contenente informazioni relative al paziente? 35

36 Quesito clinico 1 Screening: test di ingresso Screening preoperatorio PT, aptt, PLT PT, aptt, PLT Funzionalità epatica Senza modulo di richiesta 36

37 Quesito clinico 2 Monitoraggio TAO/ Eparina Standard PT/ aptt Valutazione rischio emorragico PT, aptt,tt,rt,fbg, D-D, PLT, TE/CT Valutazione rischio trombotico Unità didattica N 4 Con modulo di richiesta 37

38 Quali informazioni deve contenere il modulo di richiesta per i test dell emostasi? 38

39 Modello richiesta semplificato Dati anamnestici personali Dati anamnestici familiari Dati clinici Trattamento farmacologico in atto Quesito diagnostico ed esami correlati 39

40 G. MARTINI. Tipo di modello richiesta 40

41 In presenza di una storia emorragica personale (familiare) o in corso di emorragia qual è l algoritmo diagnostico? 41

42 Algoritmo storia emorragica /emorragia in atto Test di screening (PT,aPTT,PLT) normali alterati Normale TE/CT allungato Test specifici Malattia di von Willebrand (vw:ricof,vw:ag, FVIII:C) Piastrinopatia (aggr. piastrinica,nucleotidi,serotonina) 42

43 Emostasi primaria Adesione e aggregazione piastrinica 43

44 Studio dell emostasi primaria Tempo di emorragia ( test in vivo ) Closure time ( test in vitro ) L accuratezza del test dipende dall abilità dell operatore Sistema in vitro specifico per lo screening della funzionalità piastrinica su sangue intero Relazione inversa tra conta piastrinica e TE Piastrine < / μl prolungano il TE Principio :Misura il tempo impiegato per la formazione di un aggregato piastrinico in risposta allo stimolo collag./adp o collag./epinefrina 44

45 Studio dell emostasi primaria TE / CT prolungati Cause congenite Malattia di von Willebrand Piastrinopatie ereditarie Cause acquisite Piastrinopenie DIC,Uremia,Paraproteine ASA, ticlopidina, clopidogrel FANS Il Closure Time, rispetto al TE, sembra essere più sensibile e specifico per la diagnosi della malattia di von Willebrand e delle piastrinopatie, ma non è in grado di evidenziare tutti i disordini lievi dell emostasi primaria 45

46 Indagini da eseguire in presenza di una chiara storia emorragica e di test di screening normali Fattore XIII α2-antiplasmina Attivatore tessutale del plasminogeno (t-pa) Inibitore dell attivatore tessutale del plasminogeno (PAI-1) Fattore piastrinico 3 Alterazioni rarissime 46

47 Il referto di laboratorio deve riportare la deduzione diagnostica? - E auspicabile. Dovrebbe riportare infatti l ipotesi diagnostica in relazione al quesito formulato nella richiesta. - Per questo è necessario che tra il Laboratorio e il medico richiedente ci sia una collaborazione stretta e continuativa 47

48 Metodi coagulativi CRITICITÀ Fase preanalitica Materiale di riferimento Materiale di Controllo Espressione dei risultati Valori di riferimento 48

49 Criticità: fase preanalitica Standardizzazione delle variabili preanalitiche Tempo (dal prelievo all esecuzione del test) Temperatura ambiente ( in attesa dl processare il campione) Velocità di centrifugazione (1000gx10min) Separazione del plasma Tipo di anticoagulante (citrato trisodico triidrato 109mM) Rapporto anticoagulante/ sangue Presenza di emolisi/bilirubina e lipidi in eccesso Provetta 49

50 Criticità: materiale di riferimento 1. Media geometrica predeterminata (MNPT) * 2. Pool di plasmi normali congelato 3. Pool di plasmi normali liofilo * raccomandato da l OMS Raccomandazioni Media geometrica di 20 o piu soggetti sani (maschi e femmine) (MNPT) determinata con il sistema in uso e ricontrollata al cambio lotto reagente; In alternativa utilizzare il valore del plasma congelato o liofilizzato dopo aver verificato che non si discosti dal valore dell MNPT 50

51 Raccomandazioni Rivalutare l intervallo di riferimento ad ogni variazione del sistema operativo (es. nuovo reagente/ strumento/ lotto ) Verificare sempre la plausibilità biologica e clinica Partecipare a programmi di VEQ allargati 51

52 Limiti dei Test di screening Variabili preanalitiche Test coagulativi a seguito della centrifugazione,non includono la funzionalità degli elementi cellulari del sangue non esplorano il fattore XIII sono poco sensibili alla carenza del fibrinogeno Conteggio delle piastrine - non fornisce informazione sulla funzionalità delle piastrine 52

53 Possibili commenti da inserire nel referto Presenza di eparina Probabile interferenza da emolisi,eccesso di bilirubina o di lipidi Proporzioni non idonee Per Hct <30% >50% è necessario correggere la concentrazione del anticoagulante in rapporto all ematocrito: contattare il Laboratorio per provetta idonea Risultati ottenuti con metodo manuale ( tilt-tube ) Si invita il medico richiedente a compilare in maniera appropriata la richiesta Trasporto non idoneo Si prega di contattare il laboratorio per approfondimenti o altro 53

54 Appropriatezza dei test di screening in corso di coagulopatie acquisite Considerazioni I test di screening non esprimono il potenziale emostatico globale Scarsa correlazione tra test globali e sanguinamento Antitrombina e Proteina C sono ridotte nelle coagulopatie acquisite (cirrosi e DIC) e in alcune condizioni fisiologiche (neonato) L assenza di trombomodulina, nel sistema in vitro, limita l attivazione della Proteina C 54

55 Emostasi : equilibrio instabile Sistema Anticoagulante Sistema Procoagulante molta trombina rischio trombotico poca trombina rischio emorragico 55

56 reaction kinetic (ma/sec) Tempo di generazione della trombina Cmax 1,0 0,8 0,6 0,4 AUC AUC: quantità totale di trombina formatasi Cmax: picco della generazione di trombina tlag: tempo di lag phase iniziale tmax: tempo in cui si osserva il massimo del picco di generazione di trombina 0,2 0, measuring time (sec) tlag tmax 56

57 Tromboelastogramma Prototipo dei test globali dell emostasi Limiti : poco riproducibile e poco standardizzabile 57

58 Bibliografia Ematologia e emostasi G.Spagnoletti,N. Ciavarella USES (1993) Acquired coagulation disorders: revisited using global coagulation/ anticoagulation testing A.Tripodi et all. British Journal of Haematology (2009) 147,77-82 Screening dei pazienti in emergenza emorragica (1999) LG SISET Screening dei pazienti con sospetto difetto emorragico congenito (1999) LG SISET Towards definition,clinical and laboratory criteria, and a scoring system for disseminated intravascular coagulation. Jr,F.B. Taylor et all. Thrombosis and Haemostasis (2001) 86, I costi dell appropriatezza in coagulazione G. Martini et all (RIMEL/IIJLaM;6) Laboratory issues in bleeding disorders (2006) D.Lillicrap et all. Haemophilia 12 (suppl.3)