TEST GENETICI INDIRETTI. per la diagnosi di patologie genetiche ereditarie

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1 TEST GENETICI INDIRETTI per la diagnosi di patologie genetiche ereditarie

2 Diagnosi molecolare indiretta Quando non è nota la mutazione malattia, la diagnosi molecolare di quella malattia in una data famiglia può essere eseguita con metodi indiretti L analisi indiretta o di linkage consiste nell identificazione di polimorfismi vicini o interni al gene d interesse al fine di seguire la trasmissione, nei membri di una famiglia, della mutazione causativa Non si ricerca quindi la mutazione, bensì un polimorfismo (marcatore genetico) vicino al locus della malattia Il marcatore viene trasmesso assieme alla malattia stessa (segrega con la malattia) Si valuta se il marcatore genetico, presente nel soggetto affetto, si ritrova anche in altri membri della stessa famiglia Quanto più il marcatore è vicino al locus della malattia tanto maggiore è la possibilità che esso indichi anche la presenza della mutazione se entrambi erano presenti nel soggetto sicuramente affetto Si utilizzano marcatori extragenici ma specialmente intragenici che hanno un altissima probabilità di marcare l alterazione genica da studiare

3 Diagnosi molecolare indiretta L analisi genetica indiretta (Analisi di linkage) per la diagnosi molecolare di malattie ereditarie monogeniche si esegue: Quando dopo l indagine diagnostica diretta, non è stato possibile identificare la/e mutazione/i Quando è necessario effettuare una diagnosi prenatale e non è possibile identificare direttamente le mutazioni presenti nella famiglia Per la tipizzazione dei portatori (es. la tipizzazione dei genitori di un individuo affetto in vista di eventuali nascituri della medesima coppia (indagine prenatale))

4 Problematiche legate all analisi di linkage La possibilità di eseguire una diagnosi molecolare indiretta dipende dalla: Disponibilità dell albero genealogico della famiglia (l indagine viene eseguita sia sui genitori che sui figli) Disponibilità dei componenti il nucleo familiare a sottoporsi al prelievo di sangue Talvolta la diagnosi molecolare indiretta di una malattia genetica può non essere conclusiva per: Scarsa informatività dei marcatori utilizzati Mancata disponibilità dei familiari al prelievo di sangue E possibile che una ricombinazione genica separi la segregazione dell alterazione genica causa di malattia da quella del marcatore genico Per ovviare a tale evenienza si usano più marcatori extragenici ed intragenici Problemi legati a presenza di false paternità

5 Diagnosi molecolare indiretta Tipi di marcatori genici STR (Short Tandem Repeats) Microsatelliti Unità di 2-4 bp ripetute in tandem Frequenti variazioni nel numero di ripetizioni molti alleli presenti nella popolazione (frequenza di eterozigosità-70%) Fino ad un centinaio di ripetizioni Fino a qualche centinaio di bp totali SNP (Single Nucleotide Polymorphisms) Variazioni di 1 bp Sono usati soprattutto gli RFLP (Restriction Fragment Length Polymorfism)

6 Polimorfismo associato alla mutazione di interesse

7 Polimorfismi in corrispondenza di un sito di restrizione possono portare alla perdita o all acquisizione di un sito di restrizione.in entrambi i casi, si verificherà una variazione nelle dimensioni dei frammenti di restrizione La metodica più veloce per analizzare un SNP/RFLP è: 1. Amplificazione mediante PCR utilizzando una coppia di primers complementari a regioni fiancheggianti il sito di restrizione 2. Digestione con enzimi di restrizione del frammento amplificato 3. Analisi dei frammenti mediante elettroforesi su gel d agarosio Analisi di RFLP

8 Analisi di STR mediante PCR

9 Analisi di STR Amplificazione dei loci STR tramite PCR multiplex: una coppia di primers per ogni locus da amplificare il primer F di ciascuna coppia è marcato mediante colorante fluorescente (5-6 Fam, 5 -Hex, ecc.)* *per i loci i cui frammenti di DNA rientrano nello stesso range di peso molecolare vengono utilizzati coloranti differenti onde evitare, durante la fase di rivelazione, la sovrapposizione di alleli dello stesso colore indistinguibili fra loro Trattamento del campione amplificato (aggiunta dell allelic ladder e denaturazione dei campioni con formammide a 95 C per 5 min) Separazione e rivelazione dei prodotti di PCR fluorescenti con EC (alleli dello stesso locus) Interpretazione dei risultati

10 Analisi di STR La genotipizzazione mediante STRs può avvenire confrontando i dati dei campioni con gli allelic ladders Microvariant allele Allelic ladder: è uno standard di riferimento contenente tutti gli alleli più frequenti per ciascun locus analizzato Consente una corretta identificazione degli alleli di ciascun campione

11 Diagnosi di Fibrosi cistica mediante STRs

12 Marcatore per l analisi di linkage Deve essere localizzato in una regione del DNA poco distante ( bp) dal gene che si intende analizzare e sul medesimo cromosoma

13 Linkage disequilibrium Specifica combinazione di alleli in fase a due o più loci associati che si verifica più spesso di quanto accadrebbe per puro caso Associazione a livello di popolazione tra un particolare allele marcatore e una malattia In una popolazione molte persone non imparentate hanno ereditato un cromosoma con una patologia da un antenato comune

14 Analisi di linkage

15 Diagnosi molecolare indiretta Perché sia possibile effettuare un analisi genetica indiretta è necessario che: La famiglia sia sufficientemente numerosa Siano presenti idividui affetti (casi indice) I marcatori utilizzati per seguire il destino di un cromosoma in una famiglia siano informativi Cioè deve essere possibile: (A) Distinguere i due cromosomi dei genitori (B) Determinare la fase cioè quale è il cromosoma con allele patologico (capire quale allele marcatore segrega con l allele della malattia) (C) Quale cromosoma e stato trasmesso al probando Per essere informativo un marcatore deve essere altamente polimorfico, in modo che gli individui siano, con elevata probabilità, eterozigoti per quel polimorfismo (impossibile seguire la segregazione di due specifici cromosomi se un individuo è omozigote per il marcatore selezionato)

16 Diagnosi prenatale mediante analisi di linkage Non informativo Pienamente informativo Parzialmente informativo

17 Il polimorfismo KM 19 è, in questo caso, informativo

18 Diagnosi prenatale di CF mediante analisi di linkage MetH: extragenico, ~1Mb L allele 2 del padre è normale Quale degli alleli della madre? Quello normale o quello mutato? Il feto è un portatore oppure è sano Nel caso sia un portatore l allele mutato gli è stato trasmesso dalla madre

19 Diagnosi prenatale di CF mediante analisi di linkage Xv-2c: extragenico, ~200 kb Uno degli alleli mutati è un 2 L altro allele mutato è un 1 Poiché il feto non ha un 2 ma ha entrambi gli 1 è sicuramente portatore

20 Diagnosi prenatale di CF mediante analisi di linkage MetH: extragenico, ~1Mb portatore o sano Se portatore dalla madre Xv-2c: extragenico, ~200 kb portatore Il feto è un portatore e l allele mutato gli è stato trasmesso dalla madre

21 Diagnosi di portatrice di DMD/BMD: analisi di linkage mediante STR STR 5 Dys II 224 bp 216 bp 206 bp

22 Diagnosi di portatrice di DMD/BMD analisi di linkage mediante STR Controlli normali STR 50 J Allele H Allele

23 Diagnosi molecolare indiretta Ricordate che: Talvolta la diagnosi molecolare indiretta di una malattia genetica può non essere conclusiva per: scarsa informatività dei marcatori utilizzati E possibile che una ricombinazione genica separi la segregazione dell alterazione genica causa di malattia da quella del marcatore genico Per ovviare a tale evenienza si usano più marcatori extragenici ed intragenici

24 Diagnostica molecolare prenatale di Fibrosi Cistica I genitori del caso indice devono essere tipizzati prima di effettuare il prelievo dei villi coriali Se nel caso indice sono state riscontrate mutazioni note, l iter diagnostico prevede la sola ricerca delle mutazioni presenti nell affetto; quindi, la metodica è scelta in base alla mutazione nota (RDB, macrodelezioni, sequenziamento diretto dell esone in cui è stata identificata la/le mutazione/i) Se nel caso indice è stata riscontrata la presenza di una o entrambe le mutazioni non note, si esegue l indagine indiretta, mediante il seguente pannello di polimorfismi:

25 F508del/no mut non nota/no mut Poly Tn 9 7 M470V 1 2 T854T 1 1 J IVS8 GT IVS17b CA IVS17b TA Poly Tn 7 7 M470V 2 2 T854T 1 1 J IVS8 GT IVS17b CA IVS17b TA F508del/non nota Poly Tn 9 7 M470V 1 2 T854T 1 1 J IVS8 GT IVS17b CA IVS17b TA 30 30

26 Analisi genetica indiretta di DMD La procedura routinaria dello studio del linkage familiare mediante STR prevede l'amplificazione di diversi loci presenti nel gene della distrofina: DXS1242, IVS44SK21, 5-5n3, 5-5n4, DXS1238, DXS1235, DXS997, DXS1214, DXS992, DXS1237, DXS1236, DXS1243, 5-7n4, DMD07A, DXS1241 D H I P N A B F H P L B B A F F H I P M L B B G D B H F I H P P N L A B B F H P L B A D C H G I L P J N H C A C G L J H A B C F G H L P J L H B

27 Analisi genetica indiretta di DMD STR 5 Dys II 5 Dys MSA 5-5n3 5-5n4 DMD07A 5-7n4 IVS44 IVS44SK21 IVS45 IVS48 IVS49 IVS50 DMD1-2c DXS1214 DXS992 C.D G.L *A.M Maschio sano Femmina portatrice clinica Maschio affetto Maschio affetto deceduto Feto sano probando

28 Analisi genetica indiretta di DMD STR 5 Dys II 5 Dys MSA 5-5n3 5-5n4 DMD07A 5-7n4 IVS44 IVS44SK21 IVS45 IVS48 IVS49 IVS50 DMD1-2c DXS1214 DXS992 C.D G.L *A.M Ricombinazione Maschio sano Femmina portatrice clinica Maschio affetto Maschio affetto deceduto Feto sano probando

29 Diagnosi molecolare indiretta Fattori che determinano l accuratezza diagnostica nelle analisi di linkage Vicinanza del marcatore al gene frequenza di ricombinazione FC: KM19 <<0.01, MetH e J3.11 =0.01 DMD marcatori intragenici: 0.05 In genere 1 cm (1Mb) =1% di ricombinazione ad ogni evento meiotico) Errori da non paternità biologica Errori di laboratorio Nuove mutazioni Casi sporadici Eterogeneità genetica

30 TEST GENETICI PRENATALI

31 Chi chiede un test genetico prenatale? Donne in gravidanza per le quali esiste il rischio di dare alla luce un bimbo affetto da un anomalia congenita o da una malattia genetica storia familiare età della madre screening emato-chimici esami strumentali

32 Test genetico prenatale Nelle famiglie a rischio - se è disponibile un test diagnostico specifico - quando è noto il difetto genico causa della patologia Nelle gravidanze a rischio - patologie a bassa eterogeneità genetica - patologie da alterazioni del cariotipo

33 CONSULENZA GENETICA Si raccolgono le informazioni sulle caratteristiche della malattia in questione DOCUMENTAZIONE RELATIVA ALLA DIAGNOSI CLINICA TIPO DI TEST DIAGNOSTICO TIPO DI EREDITARIETA RELAZIONI DI PARENTELA Il consulente può quindi: costruire l ALBERO GENEALOGICO valutare il rischio effettivo che il nascituro erediti la patologia informare i genitori su: a) rischio effettivo del feto di avere quella specifica patologia b) rischio complessivo della coppia di avere un figlio affetto da altre patologie genetiche non diagnosticabili c) limiti dell'indagine d) caratteristiche del test e) percentuale di falsi negativi f) implicazioni dei risultati

34 Test genetico prenatale Può stabilire esclusivamente se il nascituro è o meno portatore dell alterazione genica testata Può essere necessario uno studio preventivo dei familiari e/o del caso indice IL CENTRO DIAGNOSTICO ANDREBBE CONTATTATO PRIMA DELLA GRAVIDANZA O AL MASSIMO NELLE PRIME SETTIMANE DI GRAVIDANZA (5 a -6 a settimana)

35 Test genetici per la diagnosi prenatale I genitori devono essere tipizzati prima di effettuare il prelievo di materiale biologico fetale mutazioni identificate Ricerca diretta delle mutazioni mutazioni non identificate Analisi di linkage

36 Diagnosi prenatali Tecniche per il prelievo del campione Villocentesi Amniocentesi Funicolocentesi

37 Epoca di esecuzione: sett Regime: ambulatoriale Preparazione: nessuna Esami preliminari: gruppo sang e fattore Rh Terapia: immunoprofilassi nelle donne Rh- Prelievo dei villi coriali

38 VILLOCENTESI 10a-11a settimana di gravidanza placenta cervice vagina Villocentesi con endoscopio per via transcervicale Mohr J., Acta Pathol Microbiol Scand 73:73-7, 1968

39 VILLOCENTESI 10a-11a settimana di gravidanza parete addominale placenta cervice Villocentesi per via transabdominale Smidt-Jensen S, Hahnemann N., Prenat Diagn 4:163-9, 1984

40 Amniocentesi Epoca di esecuzione: sett Regime: ambulatoriale Preparazione: nessuna Esami preliminari: gruppo sang e fattore Rh Terapia: immunoprofilassi nelle donne Rh-

41 DIAGNOSI PRENATALE Tecniche di prelievo Amniocentesi Prelievo dei villi coriali Contrazioni, perdita ematica e di liquido, infezione Dolori crampiformi, perdita ematica, infezione Aborto : rischio aggiuntivo di 1%

42 Diagnosi prenatali ANALISI del DNA Amniocentesi Amniociti Villocentesi Villi coriali E necessario controllare l eventuale contaminazione materna mediante ANALISI DI STR

43 VILLOCENTESI Coltura di Villi coriali

44 AMNIOCENTESI Coltura di Amniociti

45 Diagnosi prenatali Prelievo del campione

46 DIAGNOSI PRENATALE Conseguenze decisionali Terapia in utero Prevenzione di complicanze alla nascita Interruzione di gravidanza