Istruzioni per l uso GenDx SBTexcellerator

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1 Ottavo edizione Luglio 2011 Istruzioni per l uso GenDx SBTexcellerator Sequence-based typing (SBT) per HLA ad alta risoluzione Genome Diagnostics B.V. Telefono: info@gendx.com Web: Indirizzo: Yalelaan CM Utrecht Paesi Bassi 0344 Distributed by Sample & Assay Technologies

2 Marcatura CE Numero di catalogo Marcatura CE SBTexcellerator HLA-A , CE 0344 SBTexcellerator HLA-B , CE 0344 SBTexcellerator HLA-C , CE SBTexcellerator HLA-DRB , CE 0344 SBTexcellerator HLA-DRB3/4/ CE 0344 SBTexcellerator HLA-DQA , n.a. SBTexcellerator HLA-DQB , CE SBTexcellerator HLA-DPB , CE Copyright La presente pubblicazione, ivi comprese tutte le fotografie e le illustrazioni, è protetta dalle leggi internazionali sul copyright. Tutti i diritti riservati. Il presente manuale e tutti i materiali in esso contenuti non possono essere riprodotti senza autorizzazione scritta dell'autore. Copyright 2011 Limitazione di responsabilità Genome Diagnostics B.V. ha compiuto ogni sforzo per assicurare che le presenti Istruzioni per l uso siano accurate. Genome Diagnostics B.V. non si assume alcuna responsabilità per le eventuali imprecisioni od omissioni presenti nelle istruzioni. Le informazioni delle presenti Istruzioni per l uso sono soggette a modifica senza preavviso. Genome Diagnostics B.V. non si assume alcuna responsabilità per eventuali imprecisioni che potrebbero essere contenute nel presente Istruzioni per l uso. Genome Diagnostics B.V. si riserva il diritto di apportare miglioramenti alle presenti Istruzioni per l uso e/o ai prodotti in esse descritti, in qualsiasi momento senza preavviso. Se fossero presenti in questo manuale informazioni inesatte, fuorvianti o incomplete, saremo lieti di ricevere commenti e suggerimenti. Inviare all indirizzo info@gendx.com. Pagina 2

3 Ottavo edizione Luglio 2011 Indice Marcatura CE 2 Indice 3 Contenuto del kit 5 Per HLA di classe I 5 Per HLA di classe II 7 Trasporto e conservazione 9 Avvertenze e precauzioni 9 Limitazioni d uso del prodotto 9 Informazioni sulla sicurezza 10 Uso previsto 10 Assistenza tecnica 10 Principio e procedura 10 Note importanti prima di iniziare 11 Preparazione del campione 11 Preparazione del primer SBTexcellerator 11 Impostazione dell analisi 11 Attrezzature e reagenti da fornire da parte dell utente 13 Protocollo 1A: amplificazione loci HLA di classe I 15 Protocollo 1B: amplificazione di loci HLA-DRB 18 Protocollo 1C: amplificazione locus HLA-DQA1 22 Protocollo 1D: amplificazione locus HLA-DQB1 25 Protocollo 1E: amplificazione locus HLA-DPB1 28 Protocollo 2: pulizia del prodotto della PCR 31 Protocollo 3: sequenziamento di loci HLA 32 Protocollo 4: pulizia e analisi dei prodotti di sequenziamento HLA 34 Guida alla soluzione dei problemi 36 Appendice A: controllo della contaminazione 40 Note 42 Page 3

4 Spiegazione dei simboli Numero di materiale Componenti Numero Diagnostica in vitro di dispositivi medici Codice del lotto/numero di lotto Numero di catalogo Consultare le istruzioni per l uso Contiene i reagenti per le prove N Store at -20 C Conservare a -20 C Produttore legale Aggiungere liquido Pagina 4

5 Ottavo edizione Luglio 2011 Contenuto del kit Per HLA di classe I Kit SBTexcellerator HLA-A Core Kit (50) Kit esteso (50) N. catalogo Numero di reazioni P rimer di amplificazione HLA-A (tappo rosso) 1 provetta Primer HLA-A Sequencing (tappo giallo) Più provette Primer HLA-A GSSP (tappo verde) Più provette H 2 O nucleasi-free (tappo trasparente) 1 provetta 1 provetta Foglio protocollo HLA-A Istruzioni per l uso Kit SBTexcellerator HLA-B Core Kit (50) Kit esteso (50) N. catalogo Numero di reazioni Primer di amplificazione HLA-B (tappo rosso) 1 provetta Primer HLA-B Sequencing (tappo giallo) Più provette Più provette Primer HLA-B GSSP (tappo verde) Più provette H2O nucleasi-free (tappo trasparente) 1 provetta 1 provetta Foglio protocollo HLA-B Istruzioni per l uso * Vedere il foglio protocollo per i dettagli primer. Page 5

6 Kit SBTexcellerator HLA-C Core Kit (50) Kit esteso (50) N. catalogo Numero di reazioni Primer di amplificazione HLA-C (tappo rosso) 1 provetta Primer HLA-C Sequencing (tappo giallo) Più provette Più provette Primer HLA-C GSSP (tappo verde) Più provette H2O nucleasi-free (tappo trasparente) 1 provetta 1 provetta Foglio protocollo HLA-C Istruzioni per l uso * Vedere il foglio protocollo per i dettagli primer. Pagina 6

7 Ottavo edizione Luglio 2011 Per HLA di classe II Kit SBTexcellerator HLA- DRB HLA- DRB1 Core (50) HLA-DRB1 est. (50) HLA- DRB3/4/50 N. catalogo Numero di reazioni Primer di amplificazione HLA-DRB1 (tappo rosso) HLA-DRB3 primer di amplificazione (tappo rosso) HLA-DRB4 primer di amplificazione (tappo rosso) HLA-DRB5 primer di amplificazione (tappo rosso) Primer HLA-DRB1 Sequencing (tappo giallo) Primer HLA-DRB3/4/5 Sequencing (tappo giallo) Primer HLA-DRB1 GSSP (tappo verde) Primer HLA-DRB3/4/5 GSSP (tappo verde) H 2 O nucleasi-free (tappo trasparente) 1 provetta 1 provetta 1 provetta 1 provetta Più provette 1 provetta Più provette* 1 provetta Più provette* 1 provetta 1 provetta 1 provetta 1 provetta Foglio protocollo HLA-DRB Istruzioni per l uso * Vedere il foglio protocollo per i dettagli primer. Page 7

8 Kit SBTexcellerator HLA-DQA1 Core Kit (50) Kit esteso (50) N. catalogo Numero di reazioni HLA-DQA1 primer di amplificazione (tappo rosso) Primer HLA-DQA1 Sequencing (tappo giallo) 2 provette Più provette Più provette H2O nucleasi-free (tappo trasparente) 1 provetta 1 provetta Foglio protocollo HLA-DQA Istruzioni per l uso Kit SBTexcellerator HLA-DQB1 Core Kit (50) Kit esteso (50) N. catalogo Numero di reazioni HLA-DQB1 primer di amplificazione (tappo rosso) Primer HLA-DQB1 Sequencing (tappo giallo) 1 provetta Più provette Primer HLA-DQB1 GSSP (tappo verde) Più provette H2O nucleasi-free (tappo trasparente) 1 provetta 1 provetta Foglio protocollo HLA-DQB Istruzioni per l uso * Vedere il foglio protocollo per i dettagli primer. Pagina 8

9 Ottavo edizione Luglio 2011 Kit SBTexcellerator HLA-DPB1 Core Kit (50) Kit esteso (50) N. catalogo Numero di reazioni HLA-DPB1 primer di amplificazione (tappo rosso) 1 provetta Primer HLA-DPB1 Sequencing (tappo giallo) Più provette Primer HLA-DPB1 GSSP (tappo verde) Più provette H2O nucleasi-free (tappo trasparente) 1 provetta 1 provetta Foglio protocollo HLA-DPB Istruzioni per l uso * Vedere il foglio protocollo per i dettagli primer. Trasporto e conservazione I kit SBTexcellerator HLA sono: - spediti a temperatura ambiente e devono essere conservati a -20 C all arrivo; - stabili fino alla data di scadenza del kit, se conservati a -20 C; - stabili per 5 mesi dopo la dissoluzione dei primer in H 2 O nucleasi-free, se conservati a -20 C. Avvertenze e precauzioni Limitazioni d uso del prodotto Per garantire le migliori prestazioni, utilizzare i kit SBTexcellerator HLA con i materiali, reagenti e attrezzature raccomandati in Attrezzature e reagenti da fornire da parte dell utente, a pagina 13. L uso di materiali diversi da quelli specificati deve essere convalidato dall utente! La ricostituzione o la diluizione dei primer in volumi diversi da quelli descritti in queste Istruzioni per l uso è vivamente sconsigliato. Prestare particolare attenzione all Appendice A: controllo della contaminazione, a pagina 40. Page 9

10 Informazioni sulla sicurezza Lavorando con sostanze chimiche, indossare sempre un camice da laboratorio adatto, guanti monouso e occhiali di protezione. Uso previsto I prodotti SBTexcellerator sono destinati all identificazione ad alta risoluzione degli alleli degli antigeni dei leucociti umani (HLA) mediante il metodo chiamato sequence-based typing (SBT). SBTexcellerator prodotti possono essere utilizzati per la tipizzazione dei donatori di registro e la diagnostica trapianto. Il materiale campione è DNA genomico umano. I prodotti SBTexcellerator sono destinati a uso diagnostico in vitro da parte di personale sanitario professionista, come tecnici di laboratorio e medici, addestrati nella tipizzazione HLA e nel sequenziamento del DNA in laboratori diagnostici, EFI o ASHI, accreditati o in grado di lavorare secondo le specifiche EFI o ASHI. Assistenza tecnica Per l assistenza tecnica e per maggiori informazioni, consultare il Technical Support Center all indirizzo o chiamare uno dei reparti di assistenza tecnica QIAGEN, oppure i distributori locali. Principio e procedura I kit SBTexcellerator HLA sono set di primer/oligonucleotidi destinati al sequence-based typing (SBT) di HLA ad alta risoluzione. Per la tipizzazione ad alta risoluzione di HLA di classe I e di classe II, il sequenziamento degli esoni 2, 3, e 4 del locus HLA può essere eseguito (il sequenziamento dell esone 4 non è disponibile per tutti i loci) usando i primer di sequenziamento nei Core kit SBTexcellerator HLA. Il sequenziamento di altri esoni o l uso di primer di sequenziamento specifici di gruppo (GSSP), inclusi nei kit estesi SBTexcellerator HLA, è necessario solo quando occorre risolvere eventuali ambiguità. 1. L amplificazione HLA specifica per locus è effettuata in un termociclatore con il mix di primer di amplificazione, il DNA modello e il kit QIAGEN LongRange PCR. 2. Prima del sequenziamento, i prodotti PCR sono pilitii utilizzando esonucleasi I e fosfatasi alcalina di gambero (o metodi alternativi) per rimuovere i primer e i nucleotidi non incorporati. 3. Il sequenziamento è eseguito utilizzando la chimica di sequenziamento BigDye Terminator. Pagina 10

11 Ottavo edizione Luglio I prodotti del sequenziamento sono purificati mediante Sephadex G-50 Superfine (o metodi alternativi) per rimuovere i primer di sequenziamento non incorporati e i nucleotidi residui. 5. I campioni denaturati sono caricati su un analizzatore genetico automatico. Note importanti prima di iniziare Preparazione del campione Il DNA purificato deve avere un rapporto A 260 /A 280 compreso tra 1,7 e 1,9. Se necessario, diluire il DNA con H 2 O nucleasi-free prima dell uso. I campioni di sangue devono essere raccolti in provette con EDTA o ACD come anticoagulante. NON utilizzare campioni eparinizzati. Preparazione del primer SBTexcellerator Centrifugare brevemente le provette contenenti i primer di amplificazione (tappi rossi) r e i primer di sequenziamento (tappi gialli e verdi) prima di aprirle per la prima volta. Risospendere ciascun primer in H 2 O nucleasi- free (fornita), impiegando i volumi di risospensione elencati in tabella 1. Impostazione dell analisi Leggere il manuale QIAGEN LONGRANGE PCR, prestando particolare attenzione alle sezioni Informazioni sulla sicurezza e Note importanti prima di iniziare la procedura. Impostare tutte le reazioni su ghiaccio. Page 11

12 Tabella 1. Volumi di risospensione per primer di amplificazione e di sequenziamento (risospendere ogni primer in H 2 O nucleasi-free) Loci Primer di amplificazione (tappi rossi) Primer di sequenziamento (tappi gialli o verdi) HLA-A 55 µl 55 µl HLA-B 55 µl 55 µl HLA-C 55 µl 55 µl HLA-DRB1 55 µl 55 µl HLA-DRB3/4/5 55 µl 110 µl HLA-DQA1 55 µl 110 µl HLA-DQB1 55 µl 55 µl HLA-DPB1 55 µl 55 µl Pagina 12

13 Ottavo edizione Luglio 2011 Attrezzature e reagenti da fornire da parte dell utente Lavorando con sostanze chimiche, indossare sempre un camice da laboratorio adatto, guanti monouso e occhiali di protezione. Per ulteriori informazioni, consultare gli opportuni data sheet di sicurezza del materiale (MSDS), resi disponibili dal fornitore del prodotto. Per l amplificazione del locus HLA Kit QIAGEN LongRange PCR Ghiaccio Pipette e puntali (è vivamente raccomandato l utilizzo di puntali con filtri idrofobici) Termociclatore Microcentrifuga Agitatore Vortex Provette PCR (usare provette PCR a parete sottile da 0,2 ml consigliate dal produttore del termociclatore) Sistema di elettroforesi su gel di agarosio Per il sequenziamento di loci HLA Esonucleasi I e fosfatasi alcalina di gambero; possono essere usati metodi di pulizia alternativi Pipette e puntali Termociclatore Microcentrifuga Provette per microcentrifuga da 1,5 o 2 ml Kit BigDye Terminator Cycle Sequencing v1.1 o kit BigDye Terminator Cycle Sequencing v3.1* * Quanto sopra non è un elenco completo dei fornitori e non comprende molti importanti fornitori di prodotti per uso biologico. Page 13

14 Per la pulizia e l analisi dei prodotti di sequenziamento HLA Nota: in alternativa, possono essere utilizzati altri metodi di esclusione per dimensione o la precipitazione con etanolo dei prodotti di sequenziamento. Sephadex G-50 Superfine Multiscreen 45 ul Column Loader Multiscreen Column Loader Scraper Clear Multiscreen-HV Multiscreen Centrifuge Align Frame Blue Piastre EU Frosted Subskirted a parete sottile da 96 x 0,2 ml Pipette e puntali Pipetta multicanale (consigliata per facilitare la manipolazione) Centrifuga, rotore e adattatori devono essere in grado di centrifugare piastre di microtitolazione da 96 pozzetti) Acqua deionizzata Sequenziatore capillare (ad esempio, analizzatori genetici ABI PRISM 3100 o Applied Biosystems 3130, o analizzatori DNA ABI PRISM 3700 o Applied Biosystems 3730, Applied Biosystems) Software SBTengine o altro software adatto per tipizzazione HLA per analizzare i file di sequenza e creare rapporti di tipizzazione HLA Quanto sopra non è un elenco completo dei fornitori e non comprende molti importanti fornitori di prodotti per uso biologico. I kit SBTexcellerator HLA sono stati testati con vari polimeri e chimiche di sequenziamento. Pagina 14

15 Ottavo edizione Luglio 2011 Protocollo 1A: amplificazione loci HLA di classe I Questo protocollo è destinato all amplificazione di geni HLA-A, A, HLA-B o HLA H LA-C utilizzando il kit QIAGEN LONGRANGE PCR e il rispettivo kit SBTexcellerator HLA. Procedura Importante: impostare tutte le reazioni su ghiaccio. Nota: preparare una miscela di reazione separata per ogni locus (HLA-A, HLA-B e HLA-C). 1. Scongelare 10 unità di LongRange PCR Buffer, dntp mix, H 2 O nucleasi-free e le soluzioni primer. Mescolare le soluzioni accuratamente e centrifugare brevemente prima dell uso. 2. Preparare una miscela di reazione, come illustrato nella tabella 2. Il mix di reazione contiene tipicamente tutti i componenti necessari per PCR eccetto il DNA campione. Preparare un volume di mix di reazione maggiore almeno del 10% rispetto a quanto necessario per il numero totale di analisi PCR da eseguire. La quantità ottimale di DNA campione da usare nella reazione è 100 ng. Tuttavia, possono essere utilizzati DNA campione nell intervallo di ng (in 1-5 µl) senza influenzare i risultati. Per velocizzare il processo, validare la procedura di purificazione del DNA in modo da poter usare un volume definito corrispondente a ng di DNA. Page 15

16 Tabella 2. Composizione del mix di reazione per l amplificazione di loci HLA-A, HLA-B e HLA-C (preparare un mix di reazione separato per ogni locus) Componente LongRange PCR Buffer con Mg 2+, 10 unità Volume in ogni reazione Concentrazione finale 2,5 µl 1 u; 2,5 mm Mg 2+ Mix dntp (10 mm ciascuno) 1,25 µl 500 µm di ogni dntp HLA di classe I Primer di amplificazione (tappo rosso) 1 µl Mix LongRange PCR Enzyme 0,4 µl 2 unità per reazione H 2 O nucleasi-free Variabile (14,85-18,85 µl) DNA campione aggiunto al passo 5 Volume totale 25 µl Variabile (1-5 µl) ng per reazione (ottimale 100 ng) 3. Mescolare accuratamente il mix di reazione e centrifugare brevemente. 4. Distribuire il mix di reazione in ciascuna provetta PCR. Il volume appropriato è di 25 µl meno la quantità di DNA aggiunto nella fase successiva. 5. Aggiungere 1-5 µl di DNA campione ( ng) a ciascuna provetta contenente il mix di reazione. Il volume finale deve essere di 25 µl. La quantità ottimale di DNA campione da usare nella reazione è 100 ng. Tuttavia, possono essere utilizzati DNA campione nell intervallo di ng (in 1-5 µl) senza influenzare i risultati. 6. Programmare il termociclatore secondo le istruzioni del produttore, utilizzando le condizioni indicate nella Tabella 3. Pagina 16

17 Ottavo edizione Luglio 2011 Tabella 3. Protocollo di ciclo per l amplificazione HLA di classe I Commenti Passo iniziale di attivazione: 3 min 95 Ciclo in 3 passi: Denaturazione 15 s 95 Ricottura 30 s 65 Estensione 3 min 68 Numero di cicli 35 Estensione finale: 10 min 68 Denaturazione iniziale del DNA campione. Non superare questa temperatura. Dimensioni di prodotto PCR da 3,1 kb a 4,1 kb Fine del ciclo PCR: Indefinito 4 7. Importante: per un avvio semplificato a caldo, posizionare immediatamente le provette in un termociclatore riscaldato a 95 C e avviare il programma di ciclo, come indicato nella Tabella 3. Utilizzare l avvio semplificato a caldo per garantire la specificità della PCR. Dopo l amplificazione, i campioni possono essere conservati durante la notte a 2-8 C. La pulizia dei prodotti di PCR (pagina 31) deve essere effettuata entro le 24 ore. 8. Confermare i prodotti PCR con un sistema di rilevamento appropriato, ad esempio l elettroforesi su gel di agarosio. Preparare un gel di agarosio all 1% secondo il protocollo di laboratorio, analizzare 3 µl di ciascun test PCR. Vedere la tabella 3 per le dimensioni approssimative dei prodotti PCR. 9. Procedere con il protocollo n. 2, pagina 31. Page 17

18 Protocollo 1B: amplificazione di loci HLA-DRB Questo protocollo è usato per l amplificazione di una parte dei geni HLA-DRB1, HLA LA-DRB3, HLA-DRB4, e/o HLA-DRB5 utilizzando il kit QIAGEN LONGRANGE PCR e il kit SBTexcellerator HLA-DRB1 e/o il kit SBTexcellerator HLA- DRB3/4/5. Procedura Importante: impostare tutte le reazioni su ghiaccio. Nota: preparare un mix di reazione separato per ogni locus (HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4 e HLA-DRB5). 10. Scongelare 10 unità di LongRange PCR Buffer, dntp mix, H 2 O nucleasi-free e le soluzioni primer. Mescolare le soluzioni accuratamente e centrifugare brevemente prima dell uso. 11. Preparare una miscela di reazione, come illustrato nella tabella 4. Il mix di reazione contiene tipicamente tutti i componenti necessari per PCR eccetto il DNA campione. Preparare un volume di mix di reazione maggiore almeno del 10% rispetto a quanto necessario per il numero totale di analisi PCR da eseguire. La quantità ottimale di DNA campione da usare nella reazione è 100 ng. Tuttavia, possono essere utilizzati DNA campione nell intervallo di ng (in 1-5 µl) senza influenzare i risultati. Per velocizzare il processo, validare la procedura di purificazione del DNA in modo da poter usare un volume definito corrispondente a ng di DNA. Pagina 18

19 Ottavo edizione Luglio 2011 Tabella 4. Composizione della miscela di reazione per l amplificazione loci HLA-DRB (preparare un mix di reazione separato per ogni locus) Componente LongRange PCR Buffer con Mg 2+, 10 unità Volume in ogni reazione Concentrazione finale 2,5 µl 1 u; 2,5 mm Mg 2+ Mix dntp (10 mm ciascuno) 1,25 µl 500 µm di ogni dntp Primer di amplificazione HLA- DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4 o HLA-DRB5 (tappo rosso) 1 µl Mix LongRange PCR Enzyme 0,4 µl 2 unità per reazione H 2 O nucleasi-free Variabile (14,85-18,85 µl) DNA campione aggiunto al passo 14 Volume totaleil volume totale Variabile (1-5 µl) 25 µl ng per reazione (ottimale 100 ng) 12. Mescolare accuratamente il mix di reazione e centrifugare brevemente. 13. Distribuire il mix di reazione in ciascuna provetta PCR. Il volume appropriato è di 25 µl meno la quantità di DNA aggiunto nella fase successiva. 14. Aggiungere 1-5 µl di DNA campione ( ng) a ciascuna provetta contenente il mix di reazione. Il volume finale deve essere di 25 µl. La quantità ottimale di DNA campione da usare nella reazione è 100 ng. Tuttavia, possono essere utilizzati DNA campione nell intervallo di ng (in 1-5 µl) senza influenzare i risultati. 15. Programmare il termociclatore secondo le istruzioni del produttore, utilizzando le condizioni indicate nella Tabella 5. Page 19

20 Tabella 5. Protocollo di ciclo per amplificazione loci HLA-DRB Commenti Passo iniziale di attivazione: 3 min 95 Ciclo in 3 passi: Denaturazione 15 s 95 Ricottura 30 s 65 Estensione 5 min 68 Numero di cicli 35 Estensione finale: 10 min 68 C Fine del ciclo PCR: Indefinito 4 C Denaturazione iniziale del DNA campione. Non superare questa temperatura. Dimensioni di prodotto PCR: 3,7-4,8 kb per HLA-DRB1 3,8 kb per HLA-DRB3 0,4 kb esone 2 e 1,3 kb esone 3 per HLA-DRB4 4,0 kb per HLA-DRB5 (Vedi figura 1, pagina 21) 16. Importante: per un avvio semplificato a caldo, posizionare immediatamente le provette in un termociclatore riscaldato a 95 C e avviare il programma di ciclo, come indicato nella Tabella 5. Utilizzare l avvio semplificato a caldo per garantire la specificità della PCR. Dopo l amplificazione, i campioni possono essere conservati durante la notte a 2-8 C. La pulizia dei prodotti di PCR (pagina 31) deve essere effettuata entro le 24 ore. 17. Confermare i prodotti PCR con un sistema di rilevamento appropriato, ad esempio l elettroforesi su gel di agarosio. Preparare un gel di agarosio all 1% secondo il protocollo di laboratorio, analizzare 3 µl di ciascun test PCR. Vedere la tabella 5 per le dimensioni approssimative dei prodotti PCR. Vedere la figura 1 per un esempio di analisi su gel di agarosio di loci HLA- DRB3, HLA-DRB4 e HLA-DRB5. Pagina 20

21 Ottavo edizione Luglio 2011 Figura 1. Amplificazione specifica per locus HLA-DRB3, HLA-DRB4, e HLA-DRB5 I prodotti PCR sono stati analizzati su un gel di agarosio. M: GelPilot 200 bp Ladder. 18. Procedere con il protocollo n. 2, pagina 31. Page 21

22 Protocollo 1C: amplificazione locus HLA-DQA1 Questo protocollo è usato per l amplificazione di una parte del gene HLA- DQB1 utilizzando il kit QIAGEN LongRange PCR Kit e il kit SBTexcellerator HLA-DQA1. I set di primer di amplificazione QA1*01/3 e QA1*02/4/5/6 sono forniti per la tipizzazione dei gruppi di alleli HLA-DQA1*01/03 e HLA-DQA*02/04/05/06, rispettivamente. Devono essere eseguite entrambe le reazioni di amplificazione. Procedura Importante: impostare tutte le reazioni su ghiaccio. Nota: preparare un mix di reazione separato per l amplificazione di QA1*01/3 e QA1*02/4/5/ Scongelare 10 unità di LongRange PCR Buffer, dntp mix, H 2 O nucleasi-free e le soluzioni primer QA1*01/3 e QA1*02/4/5/6. Mescolare le soluzioni accuratamente e centrifugare brevemente prima dell uso. 20. Preparare un mix di reazione, come indicato nella Tabella 6. Preparare una soluzione per entrambi QA1*01/3 e QA1*02/4/5/6! Il mix di reazione contiene tipicamente tutti i componenti necessari per PCR eccetto il DNA campione. Preparare un volume di mix di reazione maggiore almeno del 10% rispetto a quanto necessario per il numero totale di analisi PCR da eseguire. La quantità ottimale di DNA campione da usare nella reazione è 100 ng. Tuttavia, possono essere utilizzati DNA campione nell intervallo di ng (in 1-5 µl) senza influenzare i risultati. Per velocizzare il processo, validare la procedura di purificazione del DNA in modo da poter usare un volume definito corrispondente a ng di DNA. Pagina 22

23 Ottavo edizione Luglio 2011 Tabella 6. Composizione del mix di reazione per amplificazione locus HLA-DQA1 (preparare un mix di reazione separato per l amplificazione di QA1*01/3 e QA1*02/4/5/6) Componente LongRange PCR Buffer con Mg2+, 10 unità Volume in ogni reazione Concentrazione finale 2,5 µl 1u, 2,5 mm Mg2 + Mix dntp (10 mm ciascuno) 1,25 µl 500 µm di ogni dntp QA1*01/3 QA1*02/4/5/6 Primer di amplificazione (tappo rosso) 1 µl Mix LongRange PCR Enzyme 0,4 µl 2 unità per reazione H 2 O nucleasi-free Variabile (14,85-18,85 µl) DNA campione aggiunto al passo 23 Volume totale 25 µl Variabile (1-5 µl) 5-20 ng per reazione (ottimale 100 ng) 21. Mescolare accuratamente il mix di reazione e centrifugare brevemente. 22. Distribuire il mix di reazione in ciascuna provetta PCR. Il volume appropriato è di 25 µl meno la quantità di DNA aggiunto nella fase successiva. 23. Aggiungere 1-5 µl di DNA campione ( ng) a ciascuna provetta contenente il mix di reazione. Il volume finale deve essere di 25 µl. La quantità ottimale di DNA campione da usare nella reazione è 100 ng. Tuttavia, possono essere utilizzati DNA campione nell intervallo di ng (in 1-5 µl) senza influenzare i risultati. 24. Programmare il termociclatore secondo le istruzioni del produttore, utilizzando le condizioni indicate nella Tabella 7. Page 23

24 Tabella 7. Protocollo di ciclo per amplificazione locus HLA-DQA1 Commenti Passo iniziale di attivazione: 3 min 95 Denaturazione iniziale del DNA campione. Ciclo in 3 passi: Denaturazione 15 s 95 Ricottura 30 s 65 Estensione 6 min 68 Numero di cicli 35 Non superare questa temperatura. Dimensioni di prodotto PCR da 5,4 kb a 5,8 kb Estensione finale: 10 min 68 Fine del ciclo PCR: Indefinito Importante: per un avvio semplificato a caldo, posizionare immediatamente le provette in un termociclatore riscaldato a 95 C e avviare il programma di ciclo, come indicato nella Tabella 7. Utilizzare l avvio semplificato a caldo per garantire la specificità della PCR. Dopo l amplificazione, i campioni possono essere conservati durante la notte a 2-8 C. La pulizia dei prodotti di PCR (pagina 31) deve essere effettuata entro le 24 ore. 26. Confermare i prodotti PCR con un sistema di rilevamento appropriato, ad esempio l elettroforesi su gel di agarosio. Preparare un gel di agarosio all 1% secondo il protocollo di laboratorio, analizzare 3 µl di ciascun test PCR. Vedere la tabella 7 per le dimensioni approssimative dei prodotti PCR. 27. Procedere con il protocollo n. 2, pagina 31. Pagina 24

25 Ottavo edizione Luglio 2011 Protocollo 1D: amplificazione locus HLA-DQB1 Questo protocollo è usato per l amplificazione di una parte del gene HLA- DQB1 utilizzando il kit QIAGEN LongRange PCR e il kit SBTexcellerator HLA- DQB1. Procedura Importante: impostare tutte le reazioni su ghiaccio. Nota: è necessaria l aggiunta di Q-Solution! 28. Scongelare 10 unità di LongRange PCR Buffer, dntp mix, H 2 O nucleasi-free e le soluzioni primer. Mescolare le soluzioni accuratamente e centrifugare brevemente prima dell uso. 29. Preparare un mix di reazione, come indicato nella Tabella 6. Notare che è necessaria l aggiunta di Q-Solution! Il mix di reazione contiene tipicamente tutti i componenti necessari per PCR eccetto il DNA campione. Preparare un volume di mix di reazione maggiore almeno del 10% rispetto a quanto necessario per il numero totale di analisi PCR da eseguire. La quantità ottimale di DNA campione da usare nella reazione è 100 ng. Tuttavia, possono essere utilizzati DNA campione nell intervallo di ng (in 1-5 µl) senza influenzare i risultati. Per velocizzare il processo, validare la procedura di purificazione del DNA in modo da poter usare un volume definito corrispondente a ng di DNA. Page 25

26 Tabella 6. Composizione del mix di reazione per amplificazione locus HLA-DQB1 Componente LongRange PCR Buffer con Mg 2+, 10 unità Volume in ogni reazione Concentrazione finale 2,5 µl 1 u; 2,5 mm Mg 2+ Mix dntp (10 mm ciascuno) 1,25 µl 500 µm di ogni dntp HLA-DQB1 primer di amplificazione (tappo rosso) 1 µl Mix LongRange PCR Enzyme 0,4 µl 2 unità per reazione Q-Solution, 5 unità 5 µl 1 unità H 2 O nucleasi-free Variabile (9,85-13,85 µl) DNA campione aggiunto al passo 32 Variabile (1 5 µl) Volume totale 25 µl ng per reazione (ottimale 100 ng) 30. Mescolare accuratamente il mix di reazione e centrifugare brevemente. 31. Distribuire il mix di reazione in ciascuna provetta PCR. Il volume appropriato è di 25 µl meno la quantità di DNA aggiunto nella fase successiva. 32. Aggiungere 1-5 µl di DNA campione ( ng) a ciascuna provetta contenente il mix di reazione. Il volume finale deve essere di 25 µl. La quantità ottimale di DNA campione da usare nella reazione è 100 ng. Tuttavia, possono essere utilizzati DNA campione nell intervallo di ng (in 1-5 µl) senza influenzare i risultati. 33. Programmare il termociclatore secondo le istruzioni del produttore, utilizzando le condizioni indicate nella Tabella 7. Pagina 26

27 Ottavo edizione Luglio 2011 Tabella 7. Protocollo di ciclo per amplificazione locus HLA-DQB1 Commenti Passo iniziale di attivazione: 3 min 95 Denaturazione iniziale del DNA campione. Ciclo in 3 passi: Denaturazione 15 s 95 Ricottura 30 s 65 Estensione 4 min 68 Numero di cicli 35 Estensione finale: 10 min 68 Non superare questa temperatura. Dimensioni di prodotto PCR da 3,7 kb a 4,1 kb Fine del ciclo PCR: Indefinito Importante: per un avvio semplificato a caldo, posizionare immediatamente le provette in un termociclatore riscaldato a 95 C e avviare il programma di ciclo, come indicato nella Tabella 7. Utilizzare l avvio semplificato a caldo per garantire la specificità della PCR. Dopo l amplificazione, i campioni possono essere conservati durante la notte a 2-8 C. La pulizia dei prodotti di PCR (pagina 31) deve essere effettuata entro le 24 ore. 35. Confermare i prodotti PCR con un sistema di rilevamento appropriato, ad esempio l elettroforesi su gel di agarosio. Preparare un gel di agarosio all 1% secondo il protocollo di laboratorio, analizzare 3 µl di ciascun test PCR. Vedere la tabella 7 per le dimensioni approssimative dei prodotti PCR. 36. Procedere con il protocollo n. 2, pagina 31. Page 27

28 Protocollo 1E: amplificazione locus HLA-DPB1 Questo protocollo è usato per l amplificazione di una parte del gene HLA-DPB1 utilizzando il kit QIAGEN LongRange PCR e il kit SBTexcellerator HLA-DPB1. Procedura Importante: impostare tutte le reazioni su ghiaccio. 37. Scongelare 10 unità di LongRange PCR Buffer, dntp mix, H 2 O nucleasi-free e le soluzioni primer. Mescolare le soluzioni accuratamente e centrifugare brevemente prima dell uso. 38. Preparare una miscela di reazione, come illustrato nella tabella 8. Il mix di reazione contiene tipicamente tutti i componenti necessari per PCR eccetto il DNA campione. Preparare un volume di mix di reazione maggiore almeno del 10% rispetto a quanto necessario per il numero totale di analisi PCR da eseguire. La quantità ottimale di DNA campione da usare nella reazione è 100 ng. Tuttavia, possono essere utilizzati DNA campione nell intervallo di ng (in 1-5 µl) senza influenzare i risultati. Per velocizzare il processo, validare la procedura di purificazione del DNA in modo da poter usare un volume definito corrispondente a ng di DNA. Pagina 28

29 Ottavo edizione Luglio 2011 Tabella 8. Composizione della miscela di reazione per amplificazione locus HLA-DPB1 Componente LongRange PCR Buffer con Mg 2+, 10 unità Volume in ogni reazione Concentrazione finale 2,5 µl 1 u; 2,5 mm Mg 2+ Mix dntp (10 mm ciascuno) 1,25 µl 500 µm di ogni dntp HLA-DPB1 primer di amplificazione (tappo rosso) 1 µl Mix LongRange PCR Enzyme 0,4 µl 2 unità per reazione H 2 O nucleasi-free Variabile (14,85-18,85 µl) DNA campione aggiunto al passo 41 Volume totale 25 µl Variabile (1-5 µl) ng per reazione (ottimale 100 ng) 39. Mescolare accuratamente il mix di reazione e centrifugare brevemente. 40. Distribuire il mix di reazione in ciascuna provetta PCR. Il volume appropriato è di 25 µl meno la quantità di DNA aggiunto nella fase successiva. 41. Aggiungere 1-5 µl di DNA campione ( ng) a ciascuna provetta contenente il mix di reazione. Il volume finale deve essere di 25 µl. La quantità ottimale di DNA campione da usare nella reazione è 100 ng. Tuttavia, possono essere utilizzati DNA campione nell intervallo di ng (in 1-5 µl) senza influenzare i risultati. 42. Programmare il termociclatore secondo le istruzioni del produttore, utilizzando le condizioni indicate nella Tabella 9. Page 29

30 Tabella 9. Protocollo di ciclo per amplificazione locus HLA-DPB1 Passo iniziale di attivazione: 3 min 95 Ciclo in 3 passi: Denaturazione 15 s 95 Ricottura 30 s 65 Estensione 6 min 68 Numero di cicli 35 Estensione finale: 10 min 68 Commenti Denaturazione iniziale del DNA campione. Non superare questa temperatura. Dimensioni di prodotto PCR 2,9 kb esone 1 e 5,7 kb esoni 2-5 Fine del ciclo PCR: Indefinito Importante: per un avvio semplificato a caldo, posizionare immediatamente le provette in un termociclatore riscaldato a 95 C e avviare il programma di ciclo, come indicato nella Tabella 9. Utilizzare l avvio semplificato a caldo per garantire la specificità della PCR. Dopo l amplificazione, i campioni possono essere conservati durante la notte a 2-8 C. La pulizia dei prodotti di PCR (pagina 31) deve essere effettuata entro le 24 ore. 44. Confermare i prodotti PCR con un sistema di rilevamento appropriato, ad esempio l elettroforesi su gel di agarosio. Preparare un gel di agarosio all 1% secondo il protocollo di laboratorio, analizzare 3 µl di ciascun test PCR. Vedere la tabella 9 per le dimensioni approssimative dei prodotti PCR. 45. Procedere con il protocollo n. 2, pagina 31. Pagina 30

31 Ottavo edizione Luglio 2011 Protocollo 2: pulizia del prodotto della PCR Prima del sequenziamento, i prodotti PCR sono trattati utilizzando esonucleasi I e fosfatasi alcalina di gambero (ExoI/SAP) per degradare i primer non incorporati e rimuovere il fosforo dai nucleotidi residui. Come alternativa per la pulizia dei prodotti PCR utilizzando ExoI/SAP, può anche essere usato il kit di purificazione PCR QIAquick. Nota importante prima di iniziare Impostare le reazioni sul ghiaccio. Procedura 1. Preparare un master mix ExoI / SAP in una provetta per microcentrifuga sterile secondo la tabella 10. Tabella 10. Composizione del mix di reazione per pulizia amplicon N=1 N=10 N=25 Exo I 0,5 µl 5 µl 12,5 µl SAP 1 µl 10 µl 25 µl Totale 1,5 µl 15 µl 37,5 µl 2. Aggiungere 1,5 µl di ExoI/SAP Master Mix per ciascuno dei prodotti PCR. 3. Agitare delicatamente la miscela per produrre una reazione omogenea e rallentare brevemente. 4. Programmare il termociclatore secondo le istruzioni del produttore, utilizzando le condizioni indicate nella Tabella 11. Tabella 11. Protocollo di ciclo per pulizia di amplicon ExoI / SAP Tempo Passo di attivazione: 30 min 37 Temperatura Passo di inattivazione: 20 min 80 Raffreddamento: Indefinito 4 5. Procedere con il protocollo n. 3, sequenziamento di loci HLA, pagina 32. Page 31

32 Protocollo 3: sequenziamento di loci HLA Questo protocollo è usato per il sequenziamento di loci HLA sia di classe I sia di classe II. Questa procedura è ottimizzata per la chimica BigDye Terminator, con successiva analisi su analizzatori genetici ABI PRISM 3100 o Applied Biosystems 3130, o analizzatori di DNA ABI PRISM 3700 o Applied Biosystems Note importanti prima di iniziare Impostare le reazioni sul ghiaccio. Centrifugare brevemente le provette contenenti i primer di sequenziamento (tappi giallo e verde) prima di aprire. Leggere il manuale del protocollo BigDye Terminator, prestando particolare attenzione alle sezioni Informazioni sulla sicurezza e Note importanti prima di iniziare la procedura. Procedura 1. Preparare un master mix di sequenziamento secondo la Tabella 12. Il master mix di sequenziamento contiene tipicamente tutti i componenti necessari eseguire tutti i test di sequenziamento. Preparare un volume di master mix di sequenziamento maggiore almeno del 10% rispetto a quanto necessario per il numero totale di analisi di sequenziamento da eseguire. Nota: preparare un mix di sequenziamento separato per ogni primer di sequenziamento. Tabella 12. Composizione del master mix di sequenziamento per il sequenziamento di loci HLA (preparare un master mix separato per ogni primer di sequenziamento) Componente Volume in ogni reazione BDT Ready Reaction Premix, 2,5 unità 1 µl BDT Buffer, 5 unità 1,5 µl H 2 O nucleasi-free 5,5 µl Primer di sequenziamento (tappo giallo o verde) 1 µl Totale 9 µl 2. Mescolare delicatamente il master mix di sequenziamento e centrifugare brevemente. Pagina 32

33 Ottavo edizione Luglio Dispensare 9 µl di master mix di sequenziamento in ogni provetta PCR. 4. Aggiungere 1 µl di prodotto di PCR purificato per ogni provetta contenente il master mix di sequenziamento. Il volume finale è di 10 microlitri. 5. Programmare il termociclatore secondo le istruzioni del produttore, utilizzando le condizioni indicate nella Tabella 13. Tabella 13. Protocollo di ciclo per il sequenziamento di loci HLA Commenti Denaturazione iniziale: 10 s 96 Ciclo in 3 passi: Denaturazione 10 s 96 Denaturazione iniziale del DNA campione. Ricottura 10 s 50 Estensione 2 min 60 Numero di cicli 25 Fine del ciclo PCR: Indefinito 4 6. Posizionare immediatamente le provette in un termociclatore e avviare il programma di ciclo, come indicato nella Tabella Al termine della reazione di sequenziamento, procedere con il protocollo n. 4 Pulizia e analisi dei prodotti di sequenziamento HLA, pagina 42. Page 33

34 Protocollo 4: pulizia e analisi dei prodotti di sequenziamento HLA Questa procedura adotta il metodo di esclusione per dimensioni Sephadex per la pulizia dei prodotti di sequenziamento HLA. I prodotti del sequenziamento sono purificati su una colonna Sephadex per rimuovere i primer di sequenziamento non incorporati e i nucleotidi residui. Note importanti prima di iniziare Preparare Sephadex almeno 3 ore prima dell uso. In alternativa alla pulizia utilizzando Sephadex, possono essere utilizzati altri metodi equivalenti di esclusione per dimensione (ad esempio kit Qiagen DyeEx) o precipitazione in etanolo dei prodotti di sequenziamento. Procedura di preparazione (3 ore prima dell uso) Riempire i pozzetti del caricatore a colonna da 45 µl con Sephadex G-50. Rimuovere la polvere in eccesso raschiando il restante Sephadex G-50 con il raschietto Multiscreen Column Loader. 2. Stendere una piastra filtro Multiscreen-HV capovolta sopra il Column Loader da 45 µl pieno e capovolgerla nuovamente in modo che la piastra filtro si riempia con Sephadex G Aggiungere 300 µl di acqua deionizzata a ciascun pozzetto utilizzando una pipetta multicanale. Accertarsi di evitare di inserire bolle d aria con la pipetta. 4. Macerare il Sephadex G-50 per almeno 3 ore a temperatura ambiente coperto dal coperchio. Accertars che Sephadex non si dissecchi a causa di calore e/o flusso d aria eccessivo. Sephadex macerato può essere conservato per una settimana a 4 C. Pulire il caricatore a colonna con colpetti sulla piastra capovolta e rimuovere residui di polvere con un panno asciutto. Pulizia di prodotti di sequenziamento: 5. Inserire la piastra filtrante Multiscreen-HV contenente Sephadex G- 50 macerato su una micropiastra a 96 pozzetti a fondo circolare, ponendo in mezzo il Multiscreen Centrifuge Align Frame. 6. Ruotare a 750 g per 5 minuti. 7. Eliminare l acqua nella micropiastra a 96 pozzetti a fondo circolare e conservare la piastra per un uso futuro. Pagina 34

35 Ottavo edizione Luglio Sostituire la micropiastra a 96 pozzetti a fondo circolare e il Multiscreen Centrifuge Align Frame con la piastra EU Frosted Subskirted a parete sottile 96 x 0,2 ml. 9. Aggiungere 10 µl di acqua deionizzata per ogni prodotto della reazione di sequenziamento utilizzando una pipetta multicanale. 10. Dispensare il campione di sequenziamento (20 l) sulla piastra filtro Multiscreen-HV al centro del pozzetto. 11. Ruotare a 750 g per 5 minuti. 12. Caricare la piastra EU Frosted Subskirted a parete sottile 96 x 0,2 ml contenente i campioni nel termociclatore, riscaldare i campioni per 2 minuti a 95 C e successivamente metterli su ghiaccio per poi caricarli nell analizzatore genetico. 13. Caricare la piastra EU Frosted Subskirted a parete sottile 96 x 0,2 ml contenente i campioni nell analizzatore genetico ed eseguire secondo le istruzioni del produttore. Nota: Utilizzando per la prima volta le reazioni BigDye Terminator, occorre eseguire standard di matrice. Seguire le istruzioni fornite nel kit BigDye Terminator Cycle Sequencing o dal produttore. I kit SBTexcellerator HLA sono stati testati con vari polimeri e chimiche di sequenziamento. Se il sequenziamento non è possibile lo stesso giorno; sigillare le piastre con un sigillo adesivo e conservarle a -20 C. 14. Elaborare i dati raccolti di sequenziamento grezzo prima con il software di analisi di sequenziamento SBTengine o con altri software adatti per la tipizzazione HLA. Page 35

36 Guida alla soluzione dei problemi La presente guida alla soluzione di problemi può essere utile per risolvere gli eventuali problemi riscontrati. Per ulteriori informazioni, consultare anche la pagina Domande frequenti presso il Centro di Supporto Tecnico QIAGEN: Gli scienziati di QIAGEN Servizi tecnici sono sempre felici di rispondere a tutte le domande poste sia suiprotocolli sia sulle informazioni delle presenti Istruzioni per l uso o sulle tecnologie di campionamento e dosaggio (per le informazioni di contatto visitare il sito). Poco o nessun prodotto di PCR a) a) LongRange PCR Enzyme Mix non è stato aggiunto al mix di amplificazione o non è stato mescolato correttamente all aggiunta b) b) Condizioni non ottimali di ciclo c) c) Concentrazione di DNA non ottimale d) DNA genomico di scarsa qualità o degradato e) Amplificazione debole dell esone 3 di HLA- DRB4 Commenti e suggerimenti Ripetere l amplificazione prestando attenzione all aggiunta e alla miscelazione di LongRange PCR Enzyme Mix con il mix di amplificazione. Quando si utilizza un termociclatore veloce, ridurre il tasso di salita a 1 C/s. Dosare nuovamente il DNA e regolare a 50 ng/µl. Se la concentrazione campione è inferiore all intervallo consigliato e non si osserva prodotto di amplificazione, o solo in piccola quantità, eseguire il sequenziamento del campione. Possono essere ottenuti sequenziamento e tipizzazione accettabili. Porre il DNA genomico su un gel di agarosio 1% per valutarne la qualità. Il DNA purificato deve avere un rapporto A 260 /A 280 compreso tra 1,7 e 1,9. Usare la quantità raccomandata di prodotto PCR purificato per il sequenziamento, anche se l amplificazione dell esone 3 è debole. Usare la ricottura a 63 C anziché quella a 65 C descritta nella tabella 5. Possono essere ottenuti dati di sequenziamento ancora accettabili. Pagina 36

37 Ottavo edizione Luglio 2011 Prodotti di PCR insoliti a) a) Due prodotti PCR visibili dopo l amplificazione di locus HLA-DRB1, HLA- DRB4 o HLA-DQB1 b) b) ampliconi HLA-DRB1 e HLA-DQB1 di diversi campioni hanno dimensioni diverse Rumore di fondo eccessivo a) a) Prodotti di PCR non puliti prima di sequenziamento b) b) Nessuna o scarsa pulizia delle reazioni di sequenziamento c) c) Potenza del segnale troppo alta Commenti e suggerimenti In un campione eterozigote, 2 bande possono comparire per i prodotti di PCR HLA-DRB1 o HLA-DQB1 a causa di polimorfismo di lunghezza nelle regioni introne del gene HLA- DRB1 o HLA-DQB1. L amplificazione di HLA-DRB4 normalmente si concretizza in due prodotti di PCR (vedi Figura 1, pagina 21), fatta eccezione per DRB40301N, che non possiede esone 2. A causa di polimorfismi di lunghezza nelle regioni introne del gene HLA-DRB1 o HLA- DQB1, gli ampliconi possono variare nelle dimensioni in campioni diversi. Pulire i prodotti PCR utilizzando il metodo ExoI / SAP prima del loro utilizzo nella reazione di sequenziamento. a) Accertarsi di eseguire la pulizia delle reazioni di sequenziamento usando il protocollo 4: pulizia e analisi dei prodotti di sequenziamento HLA. Disporre il campione con una pipetta direttamente al centro della superficie ricoperta di gel. Non permettere il contatto del mix di reazione o del puntale della pipetta con i lati della superficie del gel o con i lati dei pozzetti delle piastre. Vedere potenza eccessiva del segnale di seguito. d) Scarsa o errata matrice Ripetere la calibrazione spettrale e la re-iniezione di campioni. e) Iniezione scarsa Re-iniettare i campioni. Page 37

38 f) Tempo di iniezione troppo alto g) g) Picchi differiti o uno sopra l altro h) Qualità scadente di sequenza in una delle 2 sequenze in avanti dell esone 2 HLA-DRB1 Segnale debole a) Il tempo di iniezione deve essere aumentato b) Concentrazione del prodotto di PCR troppo bassa Commenti e suggerimenti Ridurre il tempo di iniezione e re-iniettare. Le potenze di segnale tra 100 e 1500 sono ottimali. I campioni di scarsa qualità possono avere potenze di segnale inferiori, ma possono comunque essere analizzati e tipizzati. Alcuni campioni possono avere segnali superiori a 1500 senza eccessivo rumore di fondo. Scelta di file di mobilità errato. Scegliere il file di mobilità corretto. Esistono 2 primer di sequenziamento in avanti per l esone 2. Devono essere normalmente usati entrambi. Il primer R3 è specifico per il sequenziamento di alleli nel gruppo DR1/2/3/5/6/8/10. Il primer R4 è specifico per il sequenziamento di alleli presenti nel gruppo DR4/7/9. Con campioni omogenei, si ottengono sequenze da uno solo dei primer. Nei campioni eterozigoti che possiedono 2 alleli dello stesso set di gruppi (cioè gruppo DR1 e gruppo DR6), i dati di sequenza eterozigote è attesa dal primer per il gruppo corrispondente, mentre l'altro primer genererà una sequenza scarsa o nessuna sequenza. Il software SBTengine rifiuta tali dati di sequenza nella maggioranza dei casi, quindi non interferiscono con l analisi di tipizzazione. Ripetere le reazioni di sequenziamento e aumentare il tempo di iniezione. Aumentare la quantità di prodotto di PCR nella reazione di sequenziamento e ridurre la quantità di H 2 O nucleasi-free in proporzione. Pagina 38

39 Ottavo edizione Luglio 2011 Eccessivi blob coloranti a) Nessuna o scarsa pulizia delle reazioni di sequenziamento b) Reazione di sequenziamento scarsa a causa di errore nella dispensazione di prodotti o prodotto di debole amplificazione Eccessiva potenza del segnale a) Prodotto di PCR troppo concentrato b) b) Troppo BDT Ready Reaction Premix nella reazione di sequenziamento c) Tempo di iniezione troppo alto Commenti e suggerimenti Accertarsi di eseguire la pulizia delle reazioni di sequenziamento usando il protocollo 4: pulizia e analisi dei prodotti di sequenziamento HLA. Disporre il campione con una pipetta direttamente al centro della superficie ricoperta di gel. Non permettere il contatto del mix di reazione o del puntale della pipetta con i lati della superficie del gel o con i lati dei pozzetti delle piastre. Accertarsi che l amplicon pulito e il miz di sequenziamento corretto siano stati aggiunti e combinati. Nel caso di amplificazione debole, confermare l'intensità dell'amplicon eseguendo un gel di agarosio. Diluire il prodotto di PCR con H 2 O nucleasi-free H2O prima del sequenziamento. Ridurre la quantità di BDT Reaction Premix e regolare la quantità di BDT Buffer secondo le istruzioni del produttore. Ridurre il tempo di iniezione e re-iniettare. Le potenze di segnale tra 100 e 1500 sono ottimali. I campioni di scarsa qualità possono avere potenze di segnale inferiori, ma possono comunque essere analizzati e tipizzati. Alcuni campioni possono avere segnali superiori a 1500 senza eccessivo rumore di fondo. Page 39

40 Appendice A: controllo della contaminazione È estremamente importante includere almeno un controllo negativo in ogni impostazione di PCR che manca di acido nucleico campione per rilevare eventuali contaminazioni. Precauzioni generali di tipo fisico Separare le aree di lavoro per la creazione del mix di amplificazione PCR e la manipolazione del DNA, tra cui l aggiunta del campione di partenza, l analisi del prodotto di PCR o la preparazione del plasmide. Idealmente, usare locali separati. Usare un set di pipette separate per il mix di amplificazione PCR. È vivamente consigliato l uso di puntali con filtri idrofobici. Preparare e congelare piccole quantità di soluzioni primer e mix dntp. È vivamente consigliato l uso di H 2 O nucleasi-free. In caso di contaminazione, banchi di laboratorio, apparecchi e pipette possono essere decontaminati pulendoli con una diluizione di 1/10 di una soluzione di candeggina commerciale*. Successivamente, i banchi e le pipette devono essere lavati con H 2 O nucleasi-free. Precauzioni generali di tipo chimico Le soluzioni conservate PCR possono essere decontaminate anche ai raggi UV. Tale metodo à tuttavia laborioso e la sua efficienza è difficile da controllare, quindi non può essere garantita. Consigliamo di conservare le soluzioni in piccole quantità e di usare nuove dosi per ciascuna PCR. Un altro approccio per evitare l amplificazione di DNA contaminante è quello di trattare miscele di reazione individuale con DNase I o enzimi di restrizione che tagliano tra i siti di legame dei primer di amplificazione usati, prima di aggiungere il campione di DNA. * La maggioranza delle soluzioni di candeggina commerciale è ipoclorito di sodio circa al 5,25%. L ipoclorito di sodio è un irritante e deve essere manipolato con cautela. Lavorando con sostanze chimiche, indossare sempre un camice da laboratorio adatto, guanti monouso e occhiali di protezione. Per ulteriori informazioni, consultare gli opportuni data sheet di sicurezza del materiale (MSDS), resi disponibili dal fornitore del prodotto. Pagina 40

41 Ottavo edizione Luglio 2011 Informazioni per l ordine I prodotti Sequence Based Typing QIAGEN (SBT) sono supportati direttamente dalle filiali QIAGEN, dal vostro distributore o dal rivenditore locale QIAGEN reseller. Contattare il distributore locale HLA o QIAGEN Customer Care Service al numero Contratto di licenza limitata L utilizzo di questo prodotto sottintende l accordo di eventuali acquirenti o utenti del kit SBTexcellerator HLA ai seguenti termini. 1. I kit SBTexcellerator HLA possono essere usati soltanto secondo le Istruzioni per l uso GenDx SBTexcellerator e con i componenti compresi nel kit. Genoma Diagnostics B.V. non concede licenza, per nessuna delle sue proprietà intellettuali, di utilizzare o incorporare i componenti compresi in questo kit con componenti non inclusi in questo Kit, tranne per quanto descritto nelle Istruzioni per l uso SBTexcellerator GenDx e protocolli aggiuntivi disponibili a com. 2. Salvo quanto espressamente dichiarato nelle licenze, Genome Diagnostics B.V. non garantisce che questo kit e/o il suo uso non violino i diritti di terzi. 3. Il Kit e le sue componenti sono concessi in licenza come prodotti monouso e non possono essere riutilizzati, ristrutturati o rivenduti. 4. Genoma Diagnostics B.V. esclude specificamente ogni altra licenza, espressa o implicita, diversa da quelle espressamente indicate. 5. L acquirente e utilizzatore del kit si impegnano a non assumere o permettere a nessuno di prendere qualsiasi iniziativa che possa causare o facilitare eventuali operazioni vietate di cui sopra. Genome Diagnostics B.V. potrà far valere i divieti di questo accordo di licenza limitata in qualsiasi tribunale e provvede a recuperare tutti i costi di indagine e di giudizio, comprese le spese legali, in ogni azione per far rispettare il presente contratto di licenza limitata o qualunque dei suoi diritti di proprietà intellettuale relativi al kit e/o ai suoi componenti. Per le condizioni di licenza aggiornate, vedere Genome Diagnostics B.V., tutti i diritti riservati. Marchi commerciali: QIAGEN, QIAquick, DyeEx (QIAGEN Group); ABI PRISM, BigDye (Applera Corporation); SBTengine, SBTexcellerator (Genome Diagnostics). I kit SBTexcellerator HLA sono concessi in licenza da Genome Diagnostics BV. QIAGEN opera come distributore in co-esclusiva del software SBTengine. Page 41

42 Note Pagina 42

43 Ottavo edizione Luglio 2011 Page 43

44 DE Die Gebrauchsanweisungen und Protokollblätter können in deutscher Sprache von der folgenden Website heruntergeladen werden: Wenn Sie diese Website nicht erreichen können, senden wir Ihnen gerne die einschlägige Übersetzung per , Fax oder Post zu. Kontaktieren Sie bitte Genome Diagnostics B.V. unter der Telefonnummer EN The English instructions for use and protocol sheets can be downloaded at the following web site: If you do not have access to this web site, we will gladly send you the relevant translation by , fax, or post. Please contact Genome Diagnostics B.V. at the telephone number ES Puede descargarse las instrucciones de uso y las hojas de protocolo en español en la siguiente página web: Si no tiene acceso a este sitio web, será un placer enviarle la traducción pertinente por correo electrónico, fax, o correo postal. Póngase en contacto con Genome Diagnostics B.V. en el número de teléfono FR Les guides d'utilisation en français ainsi que les fiches de protocole, peuvent être téléchargés sur le site Web suivant : Si vous n'avez pas accès à ce site web, nous vous enverrons volontiers la traduction appropriée par , fax ou courrier. Veuillez contacter Genome Diagnostics BV au numéro de téléphone IT Le istruzioni di utilizzo e i protocolli in italiano possono essere scaricati dal sito Web: Se non è possibile accedere al sito, potremo inviare la relativa traduzione per , fax o posta. Contattare Genome Diagnostics BV al numero di telefono IT 07/2011 Sample & Assay Technologies