Valutazione del test rapido Geenius HIV1/2 per la conferma degli anticorpi anti HIV1-2. Gianna Mazzarelli
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1 Valutazione del test rapido Geenius HIV1/2 per la conferma degli anticorpi anti HIV1-2 Gianna Mazzarelli 14/09/2015
2 Tempi di rilevazione di specifici markers di infezione HIV Test combinati Ag/Ab Ag ricombinanti e peptidi sintetici (HIV-1 compreso sottotipo O / HIV-2) Metodi sandwich per IgG e IgM Ag ricombinanti (HIV-1 / HIV-2) Lisato virale purificato (HIV-1) Metodi indiretti per IgG
3 Profilo dei markers di infezione HIV
4 Raccomandazioni per il laboratorio Test di screening: raccomandati i test di quarta generazione test disponibili in Europa: eccellente sensibilità ( %) e specificità ( %)
5 Conferma di risultati reattivi allo screening I risultati reattivi allo screening dovrebbero essere confermati in un laboratorio con esperienza Gli algoritmi di conferma possono variare generalmente includono almeno un ulteriore test sierologico anticorpale o antigenico/anticorpale che impiega una differente piattaforma utilizzato anche un test anticorpale in grado di differenziare HIV-1 da HIV-2 La ripetizione del test su un secondo campione è raccomandata per eliminare errori e confermare l identità del paziente 2014 European Guideline on HIV testing
6 Recente infezione da HIV I test NAAT (Nucleic Acid Amplification Tests), essenzialmente l HIV RNA, e il test p24 antigene sono indicati in pazienti con sospetto di infezione primaria che hanno dato un risultato negativo/indeterminato ai test sierologici I pazienti con risultato HIV RNA positivo dovrebbero essere ritestati 1-2 settimane dopo, per evidenziare la eventuale sieroconversione I risultati che restano equivoci e non confermati nel tempo sono indicativi di falsa positività allo screening I test NAAT non sono raccomandati per lo screening in quanto non sono approvati per uso diagnostico 2014 European Guideline on HIV testing
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9 Test di screening HIV sempre più sensibili Test di conferma Western blot problemi di cross-reattività HIV-1 / HIV-2 possibilità di risultati falsi negativi o indeterminati
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11 Il rischio di trasmissione per HIV è molto più elevato durante la fase acuta di infezione Linee guida: indicazioni per il trattamento antiretrovirale anche in fase precoce di infezione Guidelines for the Use of Antiretroviral Agents in HIV-1 Infected Adults and Adolescents DHHS Rev. Aprile 2015 Linee Guida Italiane sull utilizzo dei farmaci antiretrovirali e sulla gestione diagnostico-clinica delle persone con infezione da HIV-1 Dicembre 2014
12 Necessità di una diagnosi di laboratorio più accurata e rapida delle infezioni acute alto VPP con il minor numero di test Riduzione dei risultati indeterminati Corretta identificazione dell HIV tipo 2 rispetto al tipo 1 Diminuzione dei costi
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14 Nuovo algoritmo diagnostico per infezione HIV
15 In Italia non ci sono linee guida consensus condivise per la diagnosi di laboratorio della infezione da HIV Vari algoritmi (che includono test di screening e di conferma) sono stati sviluppati a livello locale Ann Ist Super Sanità 2010
16 Test HIV Ag/Ab (4 gen.) Algoritmo per la diagnosi di infezione da HIV Laboratorio Sierologia NEG POS Test HIV Ag/Ab (4 gen) (altro metodo) * HIV NEG NEG Test HIV Ab (3 gen.) POS Nuovo Prelievo (NP) NEG HIV Ag p24 POS Conf. (NP) Screening + Test di conferma Falso Positivo? Screening + HIV RNA (Test di conferma) POS HIV POS * In soggetti di categorie a rischio ripetere il test POS HIV NEG Ulteriori indagini HIV POS HIV RNA + Test di Resistenza Monitoraggio
17 Valutazione del test Geenius HIV1/2 e confronto con HIV BLOT 2.2
18 HIV BLOT 2.2 Dosaggio qualitativo immunoenzimatico (Western blot) per il rilevamento degli Ab anti HIV-1 e HIV-2 strisce di nitrocellulosa blottate con proteine antigeniche specifiche di HIV-1 (ottenute da lisato virale) + peptide sintetico di HIV-2
19 gp36 HIV BLOT 2.2
20 HIV BLOT 2.2: Criteri di interpretazione
21 HIV BLOT 2.2: Criteri di interpretazione Almeno una banda per GAG, POL e ENV Almeno una banda per GAG, POL e ENV + gp36
22 Caratteristiche del test HIV BLOT Protocollo validato su 2 tipi di campioni (siero e plasma) Protocollo a 16 passaggi Lunghi tempi risposta (procedura overnight) Complessità operativa Reattivi non pronti all uso Utilizzo dei controlli ad ogni seduta Mancanza di standardizzazione per la lettura
23 Geenius HIV1/2 Confirmatory assay Test monouso immunocromatografico (ICT) per la conferma e la differenziazione di Ab anti HIV-1 e HIV-2 antigeni ricombinanti e sintetici di HIV-1 e HIV-2 immobilizzati su membrana di nitrocellulosa la proteina A (coniugata a particelle di oro colloidale) si lega agli eventuali Ab catturati, producendo linee rosa/viola
24 Geenius HIV1/2 Confirmatory assay
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26 Lettore / Software / Cassetta
27 Geenius HIV1/2: criteri di interpretazione Criteri di interpretazione HIV-1 Interpretazione POSITIVO NEGATIVO INDETERMINATO Interpretazione Criteri Bio-Rad 2 delle 4 bande del test HIV-1 con almeno 1 ENV - gp160 (banda 4) o gp41 (banda 6) Nessuna banda 1ENV (banda 4 o 6) 1GAG (banda 5) 1POL (banda 3) 1GAG e 1POL (bande 5 e 3) Criteri di interpretazione HIV-2 POSITIVO NEGATIVO INDETERMINATO Criteri Bio-Rad Devono essere presenti le 2 bande HIV-2: gp36 e gp140 (banda 1 e 2) Nessuna banda Solo gp36 (banda 1) Solo gp140 (banda 2) 2 ENV o 1 ENV + (GAG/POL) 2 ENV
28 Geenius HIV1/2: criteri di interpretazione RISULTATO HIV-2 RISULTATO HIV-1 INTERPRETAZIONE GLOBALE DEL TEST Negativo Negativo HIV NEGATIVO Indeterminato Negativo HIV-2 INDETERMINATO Negativo Indeterminato HIV-1 INDETERMINATO Indeterminato Indeterminato HIV INDETERMINATO Negativo Positivo HIV-1 POSITIVO Indeterminato Positivo HIV-1 POSITIVO Positivo Negativo HIV-2 POSITIVO Positivo Indeterminato HIV-2 POSITIVO Positivo Positivo caso 1 = 1 ENV HIV-1 (gp 160 o gp41) + GAG o POL caso 2 = 2 ENV HIV-1 (gp 160 e gp41) +/- GAG e/o +/-POL HIV 2 POSITIVO (con reattività crociata HIV-1) HIV 1/2 POSITIVO - NON TIPIZZABILE
29 Caratteristiche del Geenius HIV1/2 Protocollo validato su 3 tipi di campioni (siero, plasma, sangue intero) Protocollo a 3 soli passaggi con tempo per risultati < 30 minuti Alta semplicità operativa Kit e monoreattivo conservabili a temperatura ambiente Utilizzo dei controlli solo a cambio lotto Lettura e interpretazione automatica delle bande Tracciabilità: lettura codice a barre della specifica cassetta e conservazione della immagine e del risultato nel referto Possibilità di interfacciamento bidirezionale con LIS
30 Valutazione del test Geenius HIV1/2 e confronto con HIV BLOT campioni di siero (79 pazienti) 16 HIV negativi 66 HIV positivi Tutti confermati dal follow-up
31 Risultati del confronto Geenius HIV1/2 NEG IND HIV-1 POS HIV-1 POS HIV-1 (+ banda HIV-2) POS HIV-2 NEG 16+2 HIV BLOT IND HIV-1 POS HIV-1 POS HIV-1 + banda HIV IND HIV-1 + banda HIV-2 1
32 Pre-sieroconversione 03/07/2014 HIV 1-2 Ag/Ab (CLIA): Positivo >12 Index HIV 1-2 Ab (CLIA): Negativo 0.37 Index HIV 1-2 Ag/Ab (CMIA): Positivo S/CO HIV Ag p24 (ELFA): Positivo >400 pg/ml (Confermata) Test di conferma HIV 1-2 IgG (Western blot): Negativo HIV 1-2 IgG (ICT): Negativo
33 23/07/2014 HIV 1-2 Ag/Ab (CLIA): Positivo Index HIV 1-2 Ab (CLIA): Positivo 8.03 Index gp160 Test di conferma HIV 1-2 IgG (Western blot): HIV-1 Indeterminato (p24 ++-; gp ) HIV 1-2 IgG (ICT): HIV-1 Positivo (gp160; gp41) 12/08/2014 p24 HIV 1 RNA Quant. (Real Time PCR): cp/ml
34 Risultati del confronto Geenius HIV1/2 NEG IND HIV-1 POS HIV-1 POS HIV-1 (+ banda HIV-2) POS HIV-2 NEG 16+2 HIV BLOT IND HIV-1 POS HIV-1 POS HIV-1 + banda HIV IND HIV-1 + banda HIV-2 1
35 04/05/2013 Sieroconversione: fase iniziale HIV 1-2 Ag/Ab (CLIA): Positivo 7 Index HIV 1-2 Ab (CLIA): Negativo 0.21 Index HIV 1-2 Ag/Ab (CMIA): Positivo S/CO HIV Ag p24 (ELFA): Positivo 146 pg/ml (Confermata) 08/05/2013 Nuovo Prelievo HIV 1-2 Ag/Ab (CLIA): Positivo >12 Index HIV 1-2 Ab (CLIA): Dubbio 1.1 Index HIV 1-2 Ag/Ab (CMIA): Positivo S/CO HIV Ag p24 (ELFA): Positivo >400 pg/ml (Confermata) HIV 1 RNA Quant. (Real Time PCR): cp/ml
36 Sieroconversione: fase iniziale 08/05/2013 Test di conferma gp160 HIV 1-2 IgG (Western blot): HIV-1 Indeterminato (gp ) HIV 1-2 IgG (ICT): HIV-1 Indeterminato (gp41)
37 Sieroconversione: fase iniziale 21/05/2013 HIV 1-2 Ag/Ab (CLIA): Positivo 5.8 index HIV 1-2 Ab (CLIA): Positivo 9.8 index gp160 gp120 Test di conferma HIV 1-2 IgG (Western blot): HIV-1 Indeterminato (p24 +++; gp ; gp ) p24 HIV 1-2 IgG (ICT): HIV-1 Positivo (gp160; p24; gp41)
38 Risultati del confronto Geenius HIV1/2 NEG IND HIV-1 POS HIV-1 POS HIV-1 (+ banda HIV-2) POS HIV-2 NEG 16+2 HIV BLOT IND HIV-1 POS HIV-1 POS HIV-1 + banda HIV IND HIV-1 + banda HIV-2 1
39 Risultati del confronto Geenius HIV1/2 NEG IND HIV-1 POS HIV-1 POS HIV-1 (+ banda HIV-2) POS HIV-2 NEG 16+2 HIV BLOT IND HIV-1 POS HIV-1 POS HIV-1 + banda HIV IND HIV-1 + banda HIV-2 1
40 Risultati del confronto Geenius HIV1/2 NEG IND HIV-1 POS HIV-1 POS HIV-1 (+ banda HIV-2) POS HIV-2 NEG 16+2 HIV BLOT IND HIV-1 POS HIV-1 POS HIV-1 + banda HIV IND HIV-1 + banda HIV-2 1
41 HIV 1-2 Ig totali (ELISA): Positivo Test di conferma HIV 1-2 IgG (Western blot): HIV-1 Positivo con banda indicativa di HIV-2 HIV-1 (tutte le bande) HIV-2 (gp36) HIV 1-2 IgG (ICT): HIV-1 Positivo HIV-1 (gp160; p24; gp41) HIV-2 (gp36) Paziente HIV 1 positivo HIV 1 RNA Quant. (bdna): cp/ml gp36
42 Risultati del confronto Geenius HIV1/2 NEG IND HIV-1 POS HIV-1 POS HIV-1 (+ banda HIV-2) POS HIV-2 NEG 16+2 HIV BLOT IND HIV-1 POS HIV-1 POS HIV-1 + banda HIV IND HIV-1 + banda HIV-2 1
43 Paziente HIV 2 positivo HIV 1-2 Ag/Ab (CLIA): Positivo 5.7 index Test di conferma HIV 1-2 IgG (Western blot): HIV 1 Indeterminato con banda indicativa di HIV2 HIV-1 (p24+-- ) HIV-2 (gp36) HIV 1-2 IgG (ICT): HIV-2 Positivo HIV-1 (p31) HIV-2 (gp36; gp140) p24 gp36
44 Considerazioni (1) Ottima concordanza HIV BLOT e Geenius Sensibilità e specificità per la rilevazione degli anticorpi: 100% Geenius: capacità di differenziare HIV-1 e HIV-2 Geenius: < numero risultati indeterminati
45 Considerazioni (2) Tutti i campioni che risultano indeterminati ai test di conferma non presentano la banda per p31 (pol)
46 Infezione acuta/primaria Periodo compreso tra l inizio della infezione (comparsa di HIV-RNA) e la piena sieroconversione (comparsa anticorpi) confermata mediante Western blot Stadio I: è presente solo l RNA virale Stadio II: si positivizza l Ag P24 Stadio III: compaiono gli anticorpi IgM anti HIV (picco viremia) Stadio IV: il test Western blot risulta indeterminato Stadio V: il test Western blot risulta positivo con assenza della p31 (pol) Stadio VI: positivizzazione della p31
47 Considerazioni (3) 64 campioni IND/POS ai test di conferma In 22 di 61 campioni (36%) risulta assente la banda per p24 al test Geenius rispetto al test HIV BLOT In 15 di 45 campioni (33%) risulta assente la banda per p31 al test Geenius rispetto al test HIV BLOT In 15 di 63 campioni (24%) risulta assente la banda per gp41 al test HIV BLOT rispetto al test Geenius
48 L elevata sensibilità di Geenius per la reattività verso gp41 permette una precoce conferma della diagnosi nelle infezioni acute Molto più elevato numero di campioni p31 negativi con Geenius rispetto ad Western blot
49 Cosa dice la Letteratura???? Alta concordanza tra Geenius HIV1/2 ed altri test di conferma Alta capacita di differenziare HIV1 e HIV2 Elevate sensibilità e specificità Bassissima percentuale di risultati indeterminati
50 Prima valutazione del Geenius HIV1/2 a confronto con Western blot (HIV BLOT 2.2)
51 Geenius HIV1/2 HIV BLOT Sieroconversioni 8 Falsi positivi screening non confermati dal follow up 5 Positivi 4 Negativi 2 IND 1 Invalido 5 Negativi 2 IND 3 Positivi 2 Negativi 6 IND 8 IND
52 10 Infezioni acute / sieroconversioni Geenius HIV1/2 5 Positivi 5 Negativi RIBA HIV1/2 10 IND
53 14 Infezioni acute (AHI) Geenius HIV1/2 12 Positivi 1 Negativo 1 IND New LAV I 14 IND 2 Falsi positivi non confermati 2 HIV 2 2 Negativi 2 HIV-2 2 IND 2 IND
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55 Nostro studio < numero indeterminati con Geenius rispetto ad HIV BLOT: nessun caso HIV BLOT Indeterminato e Geenius negativo nessun caso indeterminato di HIV BLOT e/o Geenius non confermato dal follow up
56 Campioni analizzati su Geenius Periodo: agosto agosto 2015 Analizzati 85 campioni di siero della routine (81 pazienti) Risultati 65 campioni HIV-1 positivi 1 campione HIV-1 Indeterminato 1 campione HIV-2 Indeterminato 18 campioni Negativi 15 negativi 3 sieroconversioni in fase iniziale
57 Sieroconversione 26/09/2014 HIV 1-2 Ag/Ab (CLIA): Positivo >12 Index HIV 1-2 Ab (CLIA): Dubbio 1.7 Index HIV 1-2 Ag/Ab (CMIA): Positivo S/CO HIV Ag p24 (ELFA): Positivo 62 pg/ml (Confermata) Test di conferma HIV 1-2 IgG (ICT): HIV NEGATIVO HIV 1 RNA Quant. (Real Time PCR): cp/ml
58 HIV 1-2 IgG (Western blot): Indeterminato HIV-1 (p24+--) p24
59 Sieroconversione 10/06/2015 HIV 1-2 Ag/Ab (CLIA): Positivo >12 Index HIV 1-2 Ab (CLIA): Positivo >50 Index HIV 1-2 Ag/Ab (CMIA): Positivo S/CO Test di conferma HIV 1-2 IgG (ICT): HIV NEGATIVO? HIV Ag p24 (ELFA): HIV 1 RNA Quant. (Real Time PCR): Positivo 122 pg/ml (Confermata) cp/ml
60 HIV 1-2 IgG (Western blot): Negativo
61 12/06/2015 HIV 1-2 Ag/Ab (CLIA): Positivo >12 Index HIV 1-2 Ab (CLIA): Positivo >50 Index HIV Ag p24 (ELFA): Positivo 72 pg/ml (Confermata) Test di conferma HIV 1-2 IgG (ICT): HIV-1 Indeterminato (gp160)
62 18/06/2015 HIV 1-2 Ag/Ab (CLIA): Positivo >12 Index Test di conferma HIV 1-2 IgG (ICT): HIV -1 Positivo (p31, gp160; gp41)
63 25/06/2015 HIV 1-2 Ag/Ab (CLIA): Positivo 6.8 Index Test di conferma HIV 1-2 IgG (ICT): HIV -1 Positivo (p31, gp160; p24; gp41)
64 Sieroconversione 20/05/2015 HIV 1-2 Ag/Ab (CLIA): Positivo >12 Index HIV 1-2 Ab (CLIA): Positivo 9.19 Index HIV 1-2 Ag/Ab (CMIA): Positivo S/CO Test di conferma HIV 1-2 IgG (ICT): HIV NEGATIVO HIV Ag p24 (ELFA): HIV 1 RNA Quant. (Real Time PCR): Positivo >400 pg/ml (Confermata) cp/ml
65 25/05/2015 Test di conferma HIV 1-2 IgG Test di conferma (ICT): HIV -1 Positivo (gp160; gp41)
66 Maggior sensibilità dei test di screening rispetto ai test di conferma
67 Conclusioni Geenius 1/2 Valida alternativa al test HIV BLOT, come test di conferma per infezione da HIV, che ben si adatta al nuovo algoritmo diagnostico qualità dei risultati paragonabile ma caratteristiche tecniche vantaggiose capacità di differenziare HIV1 e HIV2 un maggior numero di pazienti HIV-2 sarebbero necessari per valutare il potere discriminatorio del test
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