II Anno II Semestre A.A. 2012/2013 Sbobinatura Patologia Generale Prof. Banfi

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1 Seconda Università di Napoli II Anno II Semestre A.A. 2012/2013 Sbobinatura Patologia Generale Prof. Banfi Gruppo di studio La Sbobba A cura di dodo e Ely24e 1) Introduzione alla Genetica Medica Pag. 2 2) Malattie Auto. Reces. Patol. Molecolare Complic. Pag. 22 3) Complicazioni rispetto ai principali modelli di eredit. mendel. Aberr. cromos. Pag. 44 4) Tipi di anomalie cromosomiche Anomalie strutturali cromosomiche Pag. 64 5) Test genetico I Micro Rna e il loro ruolo nelle malattie genetiche Pag. 86 1

2 Introduzione alla genetica medica Banfi 1.1 (Venerdì 15 Marzo 2013) Oggi faremo una breve introduzione sul genoma, la struttura dei geni e poi diremo qualcosa sulla trasmissione delle malattie genetiche e diremo brevemente qualcosa sulle mutazioni puntiformi e sull effetto delle mutazioni. La genetica studia quale è la variabilità biologica degli organismi viventi, quindi studia perché tutte le varie specie e che cosa rende diverse le varie specie e anche all interno di una stessa specie cosa è che causa la diversità che c è tra individuo e individuo, secondo si occupa di studiare come da un organismo all altro nella stessa specie si possono trasmettere dei caratteri che vengono ereditati appunto da un organismo all altro e da una cellula all altra, quindi la variabilità biologica è la trasmissione dei caratteri e in ultimo, cosa più recente, quale è il ruolo del genoma e in particolare dei geni che sono le unità principali del nostro genoma nella regolazione dei processi fondamentali della vita e in particolare lo sviluppo di un organismo e la funzione dei vari organi e l attività dei vari organi una volta formati. Quindi variabilità biologica, trasmissione dei caratteri, ruolo dei genoma, ruolo del patrimonio ereditario nel funzionamento di una cellula o di un organismo. Nella storia della genetica c è stata una grossa rivoluzione negli ultimi due secoli, all inizio l argomento principale era lo studio dell ereditarietà e della variabilità tra individui, le prime due funzioni di cui abbiamo parlato prima, poi successivamente quando si sono effettuati studi del genoma quindi studi più molecolari, quindi all inizio la genetica era soprattutto formale, poi quando la genetica è diventata più molecolare quindi sullo studio del DNA, lo studio si è incentrato sullo studio dei geni, le funzioni dei geni e nell ambito della genetica medica quali erano i geni responsabili di malattia e come le variazioni di questi geni, le mutazioni, possono determinare malattia, quindi la funzione dei vari geni in condizioni normali e patologiche e come queste mutazioni possono portare al processo patologico quindi alla malattia. Questo all inizio era effettuato su base singola gene per gene poi questi studio è stato esteso al genoma intero c è proprio una branca della genetica che si occupa proprio di genomi interi, la genomica, ed essendo la genetica 2

3 medica una disciplina prettamente medica non solo vogliamo riconoscere i meccanismi e quali sono le cause delle malattie ma vogliamo arrivare in ultima analisi anche a curarle; oltre alle normali procedure terapeutiche che sono comuni a tutte le discipline mediche ci sono dei tipi di terapie che sono specifiche delle malattie genetiche in particolare la terapia genica. Cosa si intende per genoma? E l intero patrimonio genetico di un organismo vivente, paragonato a un enciclopedia in cui sono contenute tutte le istruzioni che regolalo lo sviluppo e il funzionamento di un organismo, e la lingua in cui è scritta questa enciclopedia genomica è il DNA, il genoma all interno di un organismo è uguale in tutte le cellule ed è contenuto nel nucleo, diverso invece se parliamo di come questo DNA si esprime, funziona nelle varie cellule, tutte le cellule sono uguali per quanto riguarda composizione dell organismo, bene o male in buona approssimazione sono uguali mentre non è uguale il corredo di geni che è attivo in una cellula di un tessuto rispetto a un altro, quindi l espressione del genoma poi varia tra tessuto e tessuto e da cellula a cellula. La grandezza totale del genoma umano è di circa di 3 miliardi e 70 milioni di basi di cui 2843mila sono costituiti da eucromatina, per eucromatina si intende quella porzione del genoma del DNA che non si presenta compatto ma si presenta srotolato che può essere quindi trascritto e produrre RNA e poi in ultima analisi proteine, a differenze dell eterocromatina che è quella porzione del genoma che per lo più costituita da sequenze ripetute ma che non dà luogo, apparentemente, a nessun tipo di trascrizione e produzione di proteine anche se questi concetti schematici negli ultimi anni stanno mutando perché stanno uscendo fuori un pò di sorprese. Parlando del genoma dobbiamo introdurre il progetto del genoma umano che ha portato negli ultimi anni ad una grossa rivoluzione sia nella genetica che nell ambito di varie discipline biologiche vere e proprie e l ultima analisi di genoma umano non è stato altro che la decodificazione di tutta la sequenza del genoma umano; ma se vogliamo risalire più a monte il progetto del genoma umano che è cominciato nel 1990 negli Usa non è stato altro che la generazione di mappe ha provveduto a generare altre mappe che hanno potuto portare alla codifica del genoma umano in particolare vari tipi di mappe, se per mappe intendiamo lo 3

4 stabilire di un ordine lineare di elementi noti, quindi prima di tutto si è dovuto identificare questi elementi noti, che quando si è cominciato il progetto genoma si sapeva davvero poco a parte un pò la grandezza della molecola di DNA del genoma, non si avevano dei punti di riferimento si conoscevano pochissime sequenze, prima cosa si è dovuto identificare questi elementi noti e poi si è dovuto posizionali in ordine ben precisi per identificare le mappe. Tra i vari tipi di mappe, la mappa di tipo genetico che è una mappa distribuita lungo tutto il genoma di elementi di DNA che sono variabili nella popolazione, se un elemento non è variabile non ci consente di stabilire una mappa genetica. Quindi sono quegli elementi che ci permettono di seguire, di identificare i geni malattia perché i vari marcatori che variano in una popolazione possono essere associati alla trasmissione di un carattere patologico. Insieme alla mappa genetica esiste una mappa fisica e stiamo parlando di elementi di DNA noti che non necessariamente variano ma che ci servono per aiutarci a posizionare i marcatori genetici, questi sono stati i primi due grossi risultati del progetto genoma umano quindi lo stabilire di una mappa genetica e di una mappa fisica. Altri tipi di mappe che esistono possono aiutarci per identificare per identificare i genomi erano già note come la mappa citogenetica. Invece la mappa dei geni non era nota quindi l identificazione di tutti i geni presenti nel genoma e la loro localizzazione nei cromosomi che ci permette di avere un mappa dei geni malattia cioè quali di questi geni si associano a malattia e in ultima analisi la mappa di sequenza cioè la sequenza completa di tutto il genoma. E come sapete nel 2001 è stata pubblicata bozza del genoma umana e pubblicata da due gruppi in contemporanea, un gruppo pubblico quello che ha cominciato il progetto genoma e un gruppo privato quello diretto da Kenneth Bender e un paio di anni dopo poi la decodifica del genoma umano è stato decodificato anche il genoma di topo che ha permesso di fare degli studi importanti evolutivi sulle varie funzioni della sequenza di DNA contenuto nel genoma. Per arrivare a questo primo abbozzo di genoma il progetto è cominciato nel 1990 e questa prima abbozza è stata pubblicata nel 2001 quindi sono accorsi 10 anni e il costo totale è di 3 miliardi di dollari quindi un dollaro per ogni base. Questi costi sono drasticamente ridotti ed è possibile sequenziare un genoma a costi incredibilmente più bassi, 4

5 il costo del sequenziamento è una delle poche cose ha avuto un crollo verso il basso, e permette anche di avere sequenze personali del genoma a costi più accessibili, naturalmente era un progetto molto ambizioso per cui è stato un progetto pioneristico e questo spiega il motivo per cui si è spesa una cifra così elevata perché non c erano ancora le tecnologie disponibili per arrivare a un processo più rapido. Questo è un es di cosa consiste questa sequenza e come questa pagina così densa dovete considerare 550mila di queste pagine che costituiscono tutto il genoma umano a indicare la complessità dei dati che sono stati ottenuti e l interpretazione di questi dati che ci terrà impegnati per un bel pò di tempo. Oltre al genoma umano è stato sequenziato il genoma di topo ma questo processo continua e continuamente vengono sequenziati altri genomi di altre specie, alcuni es di specie che variano dai batteri fino a mammiferi e primati vicino all uomo e ormai centinaia e centinaia i genomi che sono stati sequenziati e continuano ad essere sequenziati. Ovviamente il sequenziamento di genomi delle varie specie ci permette di fare degli studi evolutivi e ci permette di identificare quali sono gli elementi più importanti che sono comuni presenti durante l evoluzione che svolgono un ruolo di base, ma ci permettono anche di identificare quali sono gli elementi che contraddistinguono una specie e che contribuiscono a rendere quella specie diversa rispetto alle altre. Da un lato possiamo vedere cosa ci accomuna anche a specie più distanti da noi fino al lievito per es per vedere quali sono i geni che svolgono un ruolo di base e quali sono i geni che contribuiscono a rendere l uomo quella che dovrebbe la specie più evoluta presente sul pianeta. Quali sono stati i risultati principali di questo progetto genoma umano, e anche quello che è venuto dopo nei 10 anni che si sono seguiti alla sequenze del genoma umano. In questi 4 punti si riassume: innanzitutto il progetto del sequenziamento del genoma ci ha permesso di identificare quali sono le fonti di variabilità intra individuale quindi all interno della specie tra individuo e individuo. Quindi per quanto riguarda la variabilità sono stati identificati due principali fonti di variabilità nel genoma che sono comuni nella popolazione normale, la prima fonte di variabilità è rappresentata dai polimorfismi di singoli nucleotidi nominati Snp o Snip e in cosa consistono questi Snip? Praticamente consistono in variazioni di 5

6 sequenza che avvengono a livello di una particolare base del genoma nell ambito della popolazione quindi in un certo nucleotide, in questa particolare zona nella popolazione possono esistere basi diverse non tutti gli individui presentano la stessa sequenza ad es a quella base la potremmo avere individui che presentano una A e individui che presentano la T o individui che presentano sia la A che la T se si tratta di un locus autosomico che è presente in due copie, queste variazioni coinvolgono un solo nucleotide per questo si chiamano Snp se invece coinvolgono altre regioni più grandi si chiameranno in un altro modo che vediamo dopo. Quindi sequenziando un singolo individuo per quella regione per quel locus noi possiamo trovare sequenze diverse e quindi potremmo avere il caso di un individuo che avrà in questo locus una doppia T sarà omoziogote per la T o omozigote per la C o sarà eterozigote e quindi presenterà la T e la C, per parlare di polimorfismo nella genetica formale quella variazione particolare di sequenza deve essere presente almeno nel 1% della popolazione, al di sotto del 1% è più incerto il significato di polimorfismo oppure di mutazione quindi frequenza al di sopra del 1%, osservando una tabella, questo più o meno dice la stessa cosa però il numero di Snp (polimorfismo singolo nucleotide) è molto alto nel genoma ne sono stati identificati almeno una decina di milioni e il loro numero continua ad aumentare perché poi ogni popolazione può avere un certo numero diverso di polimorfismi, addirittura anche un individuo può avere nell ambito di una stessa popolazione della stessa zona potrebbe esserci variazioni diverse; quindi, in media, ogni individuo presenta un Snp ogni mille basi quindi se consideriamo due individui c è la probabilità che abbiano una variazione di singola base è di 1 su ogni 1000 basi quindi ognuno di noi presenta una variazione rispetto ad un altro individuo. Questi Snp hanno un grossa importanza perché possono essere usati come markers genetici e costituiscono a formare la mappa genetica e hanno una grossa importanza per la ricerca biomedica, infatti questo è solo un es dell informazione che ci può dare un Snp se noi consideriamo una certa mutazione che è responsabile per una malattia genetica e se consideriamo questi Snp che hanno una diversa composizione vediamo che questa mutazione può essere presente in individui che presentano corredo diverso di Snp e possiamo dire che questa 6

7 mutazione ha avuto una diversa origine perché tutti i genotipi di questi individui sono praticamente diversi tra loro, in un altra situazione tutti gli individui che portano questa mutazione presentano lo stesso corredo di Snp per cui ipotizziamo che la origine di questa mutazione è comune quindi questa mutazione è derivato da un singolo individuo mutato che poi l ha trasmessa alla sua discendenza che ha conservato lo stesso genotipo in quella regione. Invece una l altra fonte di variabilità riguarda non singoli nucleotidi ma regioni più grandi e questo per i singolo nucleotidi sapevamo che esistevano questi polimorfismi questa è stata una sorpresa perché parliamo di regioni più grandi e parliamo di variazioni del numero di copie Cnv e la variazione è determinata da grossi segmenti di DNA qui non parliamo di singola base ma di centinaia, migliaia, milioni di basi che possono variare nel loro numero di copie da un individuo all altro e varie migliaia di queste variazioni, Cnv, sono state identificate nel genoma e la stima è ancora abbastanza bassa ma sembra che sia più elevato è che il 12 % del genoma è costituito da regioni variabili e che il numero di copie può variare da individuo a individuo, così come le Snp anche le Cnv costituiscono una sorgente di variabilità interindividuale e addirittura parliamo del 12% del genoma e questi Cnv possono essere o polimorfismi come nel caso delle Snip o secondo alcuni possono essere associati a suscettibilità e a malattie in particolare è stato ipotizzato il loro ruolo nella patogenesi di malattie psichiatriche. Per darvi un es di cosa consistono questi Cnv, se in una condizione normale e queste sono due copie di un certo locus sul genoma e questa è una regione di centinaia, migliaia di basi che è presente in numero normale all interno di questo individuo quindi su entrambi i cromosomi c è la stessa copia di DNA, invece poi ci sono individui che presenteranno una singola copia di questi due quindi un cromosoma che presenterà questa regione e l altro cromosoma in cui questa copia non sarà presente o altri individui in cui oltre alla singola copia normale sarà presente una copia addizionale quindi ci saranno due copie di questo frammento più o meno grande di DNA quindi variazioni del numero di frammenti grandi, queste sono le sorgenti principali di variabilità. Altri due punti importanti che costituiscono il risultato del progetto del genoma umani sono l identificazione dei geni e dei trascritti che 7

8 possono essere codificanti e non codificanti e la comprensione del ruolo biologico di sequenze che non sono geniche. La prima domanda che si è posti prima ancora di arrivare alla sequenza completa del genoma era quanti geni sono presenti nel genoma umano e qui la risposta era molto incerta, solo un es. di un paio di lavori che sono stati pubblicati nel 2000 quindi a un anno prima del completamento del genoma in cui diversi gruppi di ricercatori scommettevano sul numero di geni presenti nel genoma e un gruppo ipotizzava la presenza di geni e quest altro che ipotizzava la presenza di geni e alla fine nessuno dei due aveva ragione. Il gene sul genoma umano è organizzato in modo abbastanza complesso, è organizzato in un alternanza di esoni ipotiziamoli come rettangoli rossi che sono separati da sequenze genomiche chiamate introni e quando viene trascritto il gene viene trascritto nella sua interezza quindi verrà fatto un primo RNA eterogene nucleare in cui saranno contenuti all inizio della trascrizione sia gli esoni che gli introni, questo RNA immaturo subirà il processo di splicing in cui ci sarà la rimozione degli introni e rimaranno solamente le sequenze esoniche, oltre alle sequenze esoniche ed introniche dobbiamo tener conto che esiste una sequenza regolatrice a monte del sito di inizio della trascrizione chiamata promotore e in un prima porzione della sequenza trascritta esiste il 5 non tradotto che viene a far parte delle RNA messaggero ma non viene a far parte della proteina che comincia al codone di inizio, meteonina di inizio e termina la sequenza codificante per proteina a livello del codone di stop e a valle del codone di stop c è un altra porzione non tradotta, che entra a far parte dell rna messaggero, 3 non tradotto che poi termina con il segnale di poliadeninazione, poli A, tutta questa regione 5 non tradotto sequenze esoniche codificanti e 3 non tradotto vengono a far parte dell RNA messaggero. Quindi per dare un informazione sulle dimensioni di queste regioni la grandezza normale,media di un gene sul genoma può essere di 60 Kb (kilobasi) la porzione intronica in genere è molto più grande di quella esonica, quindi abbiamo queste grosse porzioni intervallari che occupano molto spazio quindi questa è una grandezza media di 60 kb che viene trascritta completamente a partire dal sito di inizio della trascrizione rna immaturo, RNA eterogeneo nucleare, che poi una volta 8

9 processato tramite il processo di splicing dà luogo a un RNA messaggero maturo se vedete la differenza di dimensione è molto marcato, la dimensione media di un gene su un genoma è di 60 kb la dimensione media di RNA messaggero è di 2.2 kb quindi c è tutta una seria di informazioni di regioni DNA che occupano molto spazio e questo ha portato una grossa difficoltà nella predizione di geni e quando noi sequenziamo il genoma non è facile capire dove comincia un gene e dove finisce proprio perché ci sono tutte queste informazioni intermedie. In ogni caso si è arrivati a una soluzione finale e si è stimato che esistono dai 20 ai 25 mila geni codificanti per proteine nel genoma umano quindi numero più basso rispetto anche alle stime negative riportate precedentemente. Questa è stata una grossa sorpresa, proprio perché parlavamo cosa rende un organismo più complesso rispetto a un altro si ipotizzava che l uomo per definizione dovesse avere il numero maggiore di geni nel genoma e questa è stata una grossa sorpresa perché se guardiamo il numero di geni codificanti per proteine nei batteri come nell escherichia coli andando ai lieviti ai primi organismi pluricellulari vediamo che il numero di geni nell uomo non è molto più alto rispetto alle altre specie innanzitutto è uguale a quello del topo è più basso addirittura di altre specie come il pesce palla giapponese e addirittura inferiore a quello di piante, quindi il numero di geni non corrisponde con lo stato evolutivo e quindi non è il numero di geni che rende una specie più complessa rispetto a un altra. Cosa rende una specie diversa da un altra? Ci sono varie ipotesi ma si è ipotizzata che la complessità non è data dal numero di geni ma dal modo in cui questi geni sono usati e dal modo in cui interagiscono, da quante forme alternative possiamo avere da questi geni e dalla presenza di RNA non codificanti ma una risposta ancora precisa a questa domanda non c è. La dimensione media di un gene adesso sulla base del sequenziamento di tutto il genoma è di kb, la dimensione, un esone interno di un gene può avere la grandezza di 150 paia di basi, vi sono geni che sono un pò agli estremi cioè che sono abbastanza grandi ad es. il gene della distrofina che è responsabile della distrofia muscolare ha la più grossa dimensione sul genoma e occupa 2.5 milioni di basi sul genoma mentre invece un altro gene della Titina che è responsabile di alcune forme di distrofia 9

10 muscolare ha la più lunga sequenza codificante in questo caso il più lungo RNA messaggero che è più di 80 mila basi, il più grande numero di esone più di 178 esoni e l esone singolo più grande più di 17mila basi quindi ci sono varie diversità nella grandezza dei geni però più o meno la grandezza media è quella di kb sul genoma e 2 kb come RNA messaggero. I geni possono essere elementi singoli ma possono anche essere organizzati in famiglie cioè ci sono dei geni che presentano varie copie simili nel genoma e queste copie di geni simile tra loro possono connotare una famiglia genica e di famiglie geniche ne esistono varie nel genoma, possiamo avere famiglie cluster raggruppate in cui tutti i geni che sono simili tra loro sono localizzati nella stessa regione genomica e sono derivati da eventi di duplicazione successiva e quindi sono localizzati tutti nello stesso locus genomico, classico è l es del gene delle globine localizzate tutte nelle vicinanze oppure oppure degli omeobox che sono dei cluster di omeobox e quindi sono vari membri di una stessa famiglia che sono localizzate all interno di una stessa regione genomica, invece possiamo avere delle famiglie geniche che sono interspersed sono localizzate in regioni diverse del genoma e abbiamo vari es come i geni PAX che sono geni importanti per lo sviluppo e che hanno almeno 9 membri ma che sono tutti localizzati su cromosomi diversi quindi si pensa che siano derivati da una iniziale duplicazione che però è stata seguita da una traslocazione delle varie copie in varie regioni del genoma. Un es di una famiglia clusterizzata che è il caso della alfa globine e beta globine che sono tutti quanti posizionati in una stessa regione genomica e intervallate da sequenze intergeniche. Sempre parlando del numero delle sequenze codificanti il genoma umano è costituito da 46 cromosomi, geni, 3 miliardi di nucleotidi, se consideriamo tutte le sequenza codificanti di sequenze presenti in questi 3 miliardi di nucleotidi arriviamo a dire che le sequenze codificanti, quindi le sequenze che servono a codificare le proteine e anche del 3 e 5 non tradotto ci troviamo di fronte a una % del genoma che è davvero basso, quindi il 2% del genoma viene a far parte di gene codificanti per proteine. La domanda è a che cosa serve il restante 98%? Prima di questo riconoscimento del numero così basso di geni questa porzione del genoma veniva chiamato 10

11 genoma spazzatura, questa porzione del 98% del genoma è costituito da 3 grossi gruppi, la prima porzione è costituita da sequenze ripetute e queste costituiscono il 50% del genoma e sono sequenze di DNA che sono ripetute in numero variabili di copie e ci sono due grossi gruppi di sequenze ripetute, uno è costituito dal DNA satellite che sono blocchi di sequenze ripetute presenti, clusterizzate cioè regioni di DNA ripetute presenti in certe regioni particolari del genoma, cioè in regioni cromosomiche specifiche caratterizzate dalla presenza di eterocromatina, il DNA insieme ai complessi proteici presenta una formazione altamente condensata che è priva di geni e questi geni sono localizzate nelle regioni telomeriche e in altre regioni del genoma e questo costituisce il gruppo più sostanzioso di sequenze ripetute in cui apparentemente non ci sono sequenze geniche. L altro gruppo è costituito dalle Repeats interspersed (disperse) nel genoma in cui abbiamo dei moduli che sono presenti in multiple copie ma in regioni più svariate del genoma e queste sono localizzate in genere nelle regioni eucromatiniche, regioni che sono attivamente trascritte e addirittura alcune di queste sequenze ripetute sono presenti all interno del RNA messaggero e in 5 e 3 non tradotto potremmo avere regioni ripetute, quindi possono essere anche trascritti, in genere sono derivati dai trasposoni che sono questi elementi che possono far saltare una regione da una parte all altra e possono migrare da regione a regione del cromosoma per lo più sono derivati da trasposoni. Un altra parte è caratterizzata dalla presenza di pseudogeni in cui c è sempre un meccanismo di trasposizione praticamente un gene può duplicarsi e dare luogo a un altro membro di una famiglia genica ma questa duplicazione può dare luogo a un gene che evolve in modo negativo, accumula mutazione e viene a formare un pseudogene che non è più funzionante e non è più in grado di dare luogo a una sequenza proteica perché accumula varie mutazioni, questi sono pseudogeni non processati. Alcune volte, RNA messaggero viene a fare parte di un trasposone va a localizzarsi già processato in un altra regione del genoma dove accumula mutazione e viene a costituire una sorta di pseudogene processato che non ha più una funzione e buona parte di queste repeats interspersed sono caratterizzate da pseudogeni processati che fino a pochi anni fa venivano considerati come una cosa inutili 11

12 ma nell ultima lezione vedremo che questi pseudogeni sono importanti soprattutto quando vengono trascritti nel RNA; poi ci sono semplici di multipli di nucleotidi poli A, poli T poli AC etc... e duplicazioni segmentali ma l importante è che sapete che esistono sequenze di DNA satellite e repeats interspersed. Invece gli altri gruppi di DNA non codificante presente nel genoma abbiamo un vasto gruppo di DNA non trascritto e una funzione che può essere ascritta a questa regione è quello di costituire elementi di controllo dell espressione dei geni quindi promotori, sequenze Hans che servono ad aiutare la trascrizione di un gene a renderlo tessuto specifico, oppure sequenze Silens che bloccano l espressione di un gene in un certo tessuto, e tra queste sequenze regolatorie è curiosa la presenza di sequenze non codificanti non conservate che è stata una grossa sorpresa del sequenziamento dei vari genomi cosa sono queste sequenze Cnc, quando è stato sequenziato il genoma di topo si è fatta una comparazione tra il genoma di uomo e il genoma di topo e si è visto che il 5% dei due genomi era altamente conservato tra le due specie e ovviamente si pensava che queste sequenze conservate fossero costituite da sequenze codificanti, da geni e la grossa sorpresa è stata che solo ⅓ di queste sequenze corrispondeva a geni il restante ⅔ non erano sequenze codificanti per cui si è dato il nome a queste regioni conservate tra topo e uomo di Cnc o Cns, è stata data anche una definizione quindi sono sequenze lunghe almeno 100 paia di basi con una % di identità almeno del 70%. Queste Cnc possono rappresentare elementi di controllo dell espressione sono stati ipotizzati anche il loro ruolo come RNA non codificanti ma queste ipotesi non sono state convalidate. Questo è un es di come si visualizza queste Cnc nel genoma e questo è un gene che vedremo più avanti, è un gene responsabile della fibrosi cistica CFTR e in questo grafico sull asse dell ascisse è rappresentata la regione genomica umana e sull asse delle ordinate è indicata questi picchi corrispondono alla % di identità che c è nella corripondente regione genomica tra uomo e topo quindi la parte più bassa corrisponde al 50%, questo al 75% e poi 100%, in celeste vedete le regioni corrispondenti agli esoni del gene CFTR poi vedere tutti questi altri picchi che superano il 75% che presentano un identità molto simili a quello di esoni ma non sono esoni e che 12

13 sono le Cnc e il significato rimane da chiarire. L ultimo gruppo è rappresentato da sequenze che sono trascritte ma non sono codificanti, nell ambito di questo 98% non codificante, e stiamo parlando degli RNA non codificanti e tra questo possiamo annoverare i micro RNA. Una delle grosse sorprese sempre del genoma era che mentre la componente codificante era stata inferiore all attesa come quantità invece la componente non codificante presente nel genoma umano è stata molto più importante di quanto si pensasse e oltre agli RNA non codificanti che erano già conosciuti molto prima del sequenziamento del genoma i cosiddetti RNA non codificanti che svolgono funzioni di base come ad es. RNA rimosomiale, transfer etc... è venuta fuori questa grossa categoria di RNA non codificante con ruolo regolatorio che serve a svolgere un ruolo che è diverso da cellula a cellula, questi sono vari tipi di RNA, ma abbiamo soprattutto micro RNA ma adesso stanno venendo fuori Long non coding RNA che svolgono un ruolo interessante sia per la regolazione genica che per vari funzioni biologiche di base. Così come abbiamo visto prima che la correlazione tra numero di gene e complessità di un organismo non esiste se invece andiamo a considerare la % del genoma che costituisce RNA non codificante vediamo che c è una correlazione nell ambito dell evoluzione partendo da escherichia coli le regione non codificanti sono indicate qui in grigio chiaro e vedete che nell escherichia coli il batterio è inesistente, l 1% mentre una grossa parte del genoma è costituita da regioni codificanti e man mano che andiamo in alto nell evoluzione vediamo che nel lievito questa componente tende a crescere al 10% negli organismi pluricellulari arriva a costituire il 30% e invece nell uomo al 43% quindi mentre con le regioni codificanti non c è correlazione con RNA non codificante c è una correlazione con la complessità di una specie nell ambito dell evoluzione quindi sembra che gli RNA codificanti possano essere una delle spiegazioni alla domanda che ci eravamo fatti prima sul perché alcune specie sono più complesse rispetto a un altre forse dipende dalla quantità di rna non codificante. Quindi è solamente una carrellata sui risultati principali del progetto genoma umano e dato questi risultati e tutte le serie di domande che emerge da questi risultati si è venuta a formare una nuova 13

14 disciplina della genetica la cosiddetta Genomica il cui obiettivo primario è quello di comprendere il significato dell organizzazione molecolare contenuto nei genomi con varie implicazioni cioè una parte che si occupa più di genomica strutturale cioè si occupa di sequenziare, determinare la struttura di genomi completa ma c è questa parte che è più interessane che è la genomica funzionale che si occupa di determinare come la struttura di un genoma poi si associa a una funzione e quale è la funzione del genoma nella sua interezza e del trascrittoma, di tutta la serie di trascritti e del proteoma, di tutte le proteine; questa è una disciplina che sta ottenendo sempre più importanza nell ambito della genetica e per rispondere a queste domande c è stata un evoluzione naturale del progetto genoma umano è stato quello di questo progetto che è nato subito dopo del progetto genoma umano che si chiama progetto Encode che si propone di identificare tutti gli elementi funzionali che sono presenti nel genoma, quindi di annotare base per base con tutti gli elementi funzionali e vedere dove cominciano i trascritti esattamente, dove cominciano i promotori dove finiscono, quali sono le regioni che fanno parte di eucromatina e di eterocromatina e così via. Questo progetto Encode va accumulando tutta un serie di informazioni in modo sistematico quindi è un grosso catalogo di informazioni che al momento non è arrivato a una definizione funzionale ma fornisce l utente di tutte le informazioni che possono essere utilizzati per interpretare i dati quindi sia il genoma che il risultato del progetto Encode sono accessibili a tutti tramite internet. Cominciamo a entrare nel merito della genetica medica e a dare una introduzione su quali sono le varie discipline della genetica. La genetica medica è lo studio della variabilità biologica in genere e entreremo nel merito della genetica medica che è quello che si propone di studiare la variabilità e di associare la variabilità biologica allo stato di salute o di malattia quindi a vedere quali sono le variazioni del DNA che si associa a malattie, conseguenze del risultato della genetica medica appunto la medicina molecolare è quello di applicare la conoscenze della genetica medica per applicarla alla diagnostica delle malattie e la comprensione dei meccanismi alla base di malattie genetiche. La genetica clinica che entra nel merito delle varie patologie e che associa conoscenze di 14

15 genetica alle clinica di varie malattie e poi tutta un altra serie di discipline di cui parleremo rapidamente in queste lezioni. Alcune definizione che ci servono per comprendere quello che diremo dopo; malattia congenita, cosa è malattia congenita? E una malattia che si presenta alla nascita di un individuo e non necessariamente una malattia genetica quindi tutte le malattie che si presentano in un neonato o prima della nascita sono malattie congenite e non significa che sia una malattia genetica può essere anche dovuta una malattia congenita a un infezione durante la gravidanza, o ad agenti fisici a teratogeni. Familiarità è un concetto importante della genetica, per familiarità si intende che nell ambito di una famiglia esiste una ricorrenza di una certa malattia nell ambito di quella famiglia ma non necessariamente ci troviamo di fronte a una malattia mendeliana ma solamente che c è una predisposizione, una familiarità, caso sporadico è che solo un individuo solamente in quella famiglia presenta quella malattia, l unicità di quella malattia in quell individuo che però non implica che la malattia non sia di tipo genetico. Malattia a carattere ereditario intendiamo una malattia che si manifesta con della particolari e precise condizioni che possono essere facilmente riconoscibili, in questo malattie ereditarie intendiamo malattie mendeliane che hanno un chiaro pattern ereditario mendeliano. Genotipo è la costituzione genetica di un individuo, l informazione genomica per quel locus particolare e specificamente gli alleli presenti in quel locus particolare a differenza del genotipo che è la manifestazione fisica di un carattere genetico che dipende dal genotipo e la sua interazione con l ambiente. Le malattie genetiche possono essere raggruppate in alcuni grossi gruppi, allora il gruppo principale sono quello delle malattie mendeliane che possono essere autosomiche dominanti, autosomiche recessive legate al X; l altro grosso gruppo è rappresentato dalle malattie cromosomiche in cui ci sono anomalie di numero e di strutture dei cromosomi, poi abbiamo il gruppo delle malattie multifattoriali o poligeniche in cui ci può essere la conpartecipazione di più geni nella patogenesi e di più geni insieme a fattori ambientali; poi abbiamo malattie da mutazioni di cellule somatiche in particolare del cancro, e poi malattie da mutazione del 15

16 genoma mitocondriale. Quindi le malattie monogeniche o mendeliane sono malattie a chiara trasmissione ereditaria, familiare che sono dovute alla mutazione di un singolo gene, sono malattie molto rare se prese individualmente se le mettiamo tutte assieme vengono a formare un gruppo la cui frequenza non è così rilevante e ovviamente sono caratterizzate da alto rischio di ricorrenza familiare e con pattern di ereditarietà facilmente riconoscibile. Numero di queste malattie genetiche si stimano che siano 7-8 mila e di queste malattie mendeliane almeno hanno un difetto biochimico o un difetto genetico riconosciuto, è stato riconosciuto quale è il gene responsabile e quando è noto il gene si può fare una diagnosi molecolare precisa e addirittura fare una diagnosi prenatale. Le malattie cromosomiche sono dovute alla deficienza o all eccesso di interi cromosomi o frammenti di un cromosoma quindi un questo caso non è un singolo gene ma essendo un frammento di cromosoma che può contenere al suo interno ci possono essere molti geni che possono essere alterati sia come numero che come struttura, sono abbastanza rare anche queste però sono più frequenti delle malattie genetiche in particolare se consideriamo alcune malattie come la trisomia 21, la sindrome di Down che presenta una frequenza più alte rispetto alle malattie mendeliane anche queste sono molto frequenti come gruppo. In questo caso la ricorrenza familiare non è così certa come nel caso delle malattie mendeliane e può essere presente o può essere non presente infatti nella maggior parte dei casi non c è ricorrenza familiare. Sono caratterizzati da un punto di vista clinico da ogni malattia cromosomica ha il suo pattern, il suo quadro clinico, ma hanno dei segni comuni che sono presenti in tutti i pazienti e la cui presenza deve far sospettare il medico di una possibile anomalia cromosomica che sono in genere segni abbastanza generali: ritardo mentale, presenza di bassa statura e segni disformici quindi problemi dello sviluppo osseo con caratteri disformici facciali e anche degli arti, una altro segno distintivo delle malattie cromosoniche è l alta frequenza di aborti nell ambito delle famiglie in cui c è ricorrenza di queste malattie. Mentre nel caso delle malattie genetiche singole parliamo di una frequenza che va da qualche individuo su 10mila a 100mila qua la frequenza cumulativa 16

17 di tutte le malattie è di 7 su 1000 neonati quindi è una frequenza un pò più alta. Fra le malattie più frequenti cromosomiche abbiamo la sindrome di down, di klineferter e così via. Le malattie multifattoriali a differenza delle altre sono malattie di alto impatto, sono molto frequenti, sono malattie di alto impatto sociale in cui c è una componente genetica e sono malattie dovute a un coinvolgimento di più geni quindi sono denominate anche poligeniche, sono molto frequenti perché stiamo parlando di malattie ad alto impatto, possono riguardare sia malformazioni congenite ma sono malattie frequenti nell adulto perché sono malattie che esordiscono in età avanzata. La modalità di trasmissione, in questo caso qui ci potrebbe essere familiarità ma non c è una modalità di trasmissione facilmente riconoscibile c è una predisposizione in alcune famiglie al manifestarsi di quella malattia ed è importante l interazione con l ambiente; purtroppo nonostante siano le malattie più frequenti e di alto impatto le basi molecolari nonostante tutta una serie di studi sono ancora sconosciute nella maggior parte dei casi quindi non si sa bene quali sono le cause, le predisposizioni genetiche di queste malattie appunto si parla in questo caso di predisposizione quindi non è un gene responsabile ma sono fattori di predisposizione, in questo caso i fattori di predisposizione possono essere anche gli Snip o Snp o Cnv che sono presenti nella popolazione la cui combinazione o la presenza di più Snip o Cnv nello stesso individuo può predisporre alla comparsa di queste malattie, però il ruolo preciso di questi genotipi specifici che sono alla base di queste malattie ancora non sono noti e parliamo di malattie come il diabete mellito, ipertensione, malattie cardiovascolari, malattie psichiatriche e queste sono le malattie complesse. Le malattie da cellule somatiche sono dovute a mutazione che non colpiscono le cellule germinali, non colpiscono i gameti ma colpiscono i genomi di cellule somatiche che non verranno trasmesse alle discendenza ma colpiscono determinati tessuti e queste malattie sono dovute a mutazioni in qualche caso il primo IT che colpisce le cellule germinali che fornisce una predisposizione ma la vera mutazione somatica è quella che colpisce il secondo allele all interno di una cellula somatica il cosiddetto secondo IT e questo meccanismo è alla base dei vari tipi di cancro per se. nel 17

18 cancro della mammella c è una forma familiare di cancro della mammella che è dovuto a mutazione del gene Brca1 e queste sono mutazioni in eterozigosi, queste mutazioni nel tessuto mammario sono accompagnati a un seconda mutazione che dà luogo al cancro. Il ruolo della genetica in medica può essere diagnostico, può essere una diagnosi sia prenatale che postnatale, quindi nell individuo postnatale può essere addirittura pre-sintomatica quindi si può fare una diagnosi con i sintomi della malattia sono già chiari ma possono essere fatti anche in fase preclinica, può essere una diagnosi di predisposizione possiamo fare uno screening di popolazione. La genetica può essere importante nella prevenzione tramite la consulenza genetica e la possibile interruzione di gravidanza. Poi la genetica può svolgere un ruolo in terapia non solo usando i classici strumenti della terapia disponibili per tutte le malattie ma può svolgere un ruolo anche utilizzando delle particolari modalità terapeutiche che sono specifiche delle malattie genetiche come la terapia genica. La genetica può aiutare altre branche della medicina tramite la produzione di farmaci che possono essere ottenute con tecniche di genetica molecolare e DNA ricombinanti anche per malattie non genetiche di cui però la genetica costituisce uno strumento. La genetica può svolgere un ruolo importante nelle malattie infettive perché può riconoscere tramite metodiche molecolare la presenza di un dato microrganismo dato che si conoscono tutti i genomi di quasi tutti gli organismi principali che hanno un ruolo patogenetico in varie malattie genetiche, può fare una diagnosi di certezza molecolare. Il locus è una posizione specifica su un cromosoma spesso nella genetica medica per locus ci riferiamo a un gene quindi locus è sinonimo di gene in molti casi, quindi regione particolare sul genoma o gene. Ogni locus a livello di un autosoma, gli autosomi sono le 22 coppie di cromosomi non sessuali ogni individuo presenterà due copie dello stesso cromosoma e quindi per un certo locus avremo due forme alternative che verranno chiamati Alleli e ogni individuo rappresenterà un allele materno e uno paterno per ciascun locus fatta eccezione per il maschio che avrà un cromosoma X e Y e quindi per la maggior parte del cromosoma X e del cromosoma Y non avrà un allele ma avrà una sola copia. Questi 18

19 alleli possono costituire una Aplotipo e per aplotipo si intende la successione di allele vicini su un certo locus di un cromosoma. Polimorfismo è una variabilità allelica che è presente in più del 1% della popolazione anche se oggi con i nuovi studi genomici questa frequenza tenderà ad abbassarsi. Un Omozigote viene descritto come un individuo che presenta alleli identitici a un certo locus, lo abbiamo visto anche per gli Snip quindi se a un certo locus un individuo presenta due alleli identici sarà omozigote per quel locus viceversa se i due alleli saranno diversi l individuo sarà eterozigote. Un altro concetto importante è il Carattere di Dominanza, si intende dominante quel carattere genetico che si manifesta nel fenotipo anche in stato di eterozigote invece il Carattere Recessivo è quel carattere genetico che si manifesta in una malattia, in un fenotipo, in una forma clinica solo nello stato di omozigote; invece l eterozigote composto è assimilabile al discorso dell omozigote e si intende eterozigote composto un individuo che porta due mutazioni diverse a uno stesso locus quindi due mutazioni che entrami sono eterozigoti che però una colpisce una copia e l altra colpisce l altra copia quindi alla fine è come se fosse un discorso di omozigosi, omozigosi è la stessa mutazione presente in duplice copia ma in questo caso è due mutazioni diverse allo stesso locus. Le malattie monogeniche possono trasmettersi come forme autosomiche legate al X e possono essere a loro volta dominanti e recessive, questi sono i simboli per costruire gli alberi familiari, quindi il soggetto di sesso maschile è indicato con un quadrato il soggetto di sesso femminile con un circolo, il soggetto affetto è indicato con un quadrato o un circolo completamente ripieni, gli eterozigoti possono essere indicati con una metà, i portatori con un puntino all interno e il soggetto con la freccia indica il soggetto che viene all osservazione. Le malattie autosomiche dominanti sono malattie monogeniche in cui il fenotipo si manifesta in individui eterozigoti per la mutazione e se intendiamo con N l allele normale e A l allele affetto il genotipo di questo individuo sarà NA, il fenotipo degli eterozigoti è indistinguibile da quello degli eterozigoti affetti quindi la presenza di una o due copie non modifica nella maggior parte il fenotipo quindi è sufficiente una copia della mutazione per avere il genotipo e 19

20 questo fenotipo non è influenzato dalla presenza di una duplice variazione, quindi questo è il genotipo dei soggetti affetti quindi o una singola copia o una duplice copia dell allele mutato quindi il soggetto normale è quello che non presenterà assolutamente la mutazione; questo è un es. di una famiglia con una trasmissione autosomica dominante ed è caratterizzata da alcune caratteristiche, essendo autosomica interesserà gli autosomi e non i cromosomi sessuali e quindi non ci sarà nessuna distinzione di sesso sia a livello dei soggetti affetti che nella trasmissione, quindi la malattia è presente in soggetti di sesso maschile e femminile in uguale proporzioni e sia i maschi che le femmine sono in grado di trasmettere la malattia sia ai figli maschi che alle figlie femmine quindi non c è nessuna dipendenza dal sesso. La malattia si osserva in tutte le generazioni quindi si parla di trasmissione verticale e quindi non ci sono salti di generazione. Ancora, il genitore affetto può trasmette la malattia al 50% dei figli quindi per ogni gravidanza ci sarà il 50% della probabilità che il figlio nasca affetto al contrario se partiamo dall individuo affetto, l individuo affetto deve avere almeno uno dei genitori che è affetto dalla stessa malattia, ma con qualche eccezione. Se la penetranza del carattere è completa al 100% i figli di genitori non affetti non sono a rischio; se entrambe i genitori sono affetti da una malattia autosomica dominante allora il 75% dei figli sarà affetto, è facile fare il conto con questo quadrato di Punnet in cui si indicano i due alleli per genitori e poi si calcola la probabilità del genotipo dei figli. Nel caso di una persona che è omozigote per un carattere dominante tutti i figli saranno affetti. Una delle prime eccezioni è il caso in cui ci sia una nuova mutazione, se noi osserviamo una famiglia in cui solamente alcune generazioni presentano la malattia questa può essere dovuto al fatto che si determina una nuova mutazione in uno degli individui quindi al di sopra non si verifica la malattia perché quella mutazione non era presente. Un paio di es di malattie autosomiche dominanti una delle malattia classiche è la Acondroplasia che è una forma di nanismo disarmonico in cui gli individui si presentano con arti corti sproporzionati rispetto e con una facies caratteristica, è una frequenza tipica di una malattia mendeliana quindi 1/15 mila o 1/40 mila nati, è una malattia autosomica dominante e una cosa che 20