v Vogt, 1842: la morte cellulare è parte del normale sviluppo v Lockshin and Williams, 1965: propongono il termine morte cellulare programmata

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1 Apoptosi

2 v Vogt, 1842: la morte cellulare è parte del normale sviluppo v Lockshin and Williams, 1965: propongono il termine morte cellulare programmata (Programmed Cell Death, PCD) osservando che alcune cellule destinate a morire durante la metamorfosi di anfibi e insetti sembrano essere guidate da un programma intrinseco alla cellula stessa v Kerr, Wyllie and Currie, 1972: introducono il termine apoptosi (dal greco antico: come il cadere delle foglie) per descrivere la morte cellulare associata con una serie di caratteristiche morfologiche comuni e ben definite v Horvitz and Sulston, fine degli anni 70: caratterizazione genetica dei componenti critici che regolano i meccanismi apoptotici utilizzando il nematode C.elegans (premio Nobel per la medicina 2001)

3 Lo studio dell apoptosi in C. elegans v Durante lo sviluppo di C. elegans, si formano 1090 cellule: di queste, 959 resteranno a far parte del verme adulto (postmitoticamente), e 131 vanno incontro ad apoptosi. v Ricerca di mutazioni in cui il pattern di morte cellulare é alterato: identificazione di regolatori apoptotici poi ritrovati anche in mammiferi

4 Ø Ced-3 e ced-4: mutazioni che li inattivano portano alla conservazione di tutte e 131 le cellule condannate a morte Ø Ced-9: mutazioni che inattivano ced-9 portano a morte cellulare estesa a tutte le cellule, livelli aumentati di espressione di ced-9 bloccano l apoptosi.

5 Apoptosi Ø é un suicidio che implica una reazione attiva della cellula Ø può verificarsi sia in seguito a stimoli esterni (agenti chimici, fisici, ormoni, citochine, farmaci) che a stimoli endogeni (turnover cellulare, differenziamento terminale, rimodellamento durante sviluppo e morfogenesi)

6 Evoluzione dell apoptosi v L apoptosi esiste in tutti gli organismi pluricellulari v Organismi monocellulari: presente in forme piú o meno simili anche nei batteri, forse in difesa contro infezioni virali (che a loro volta hanno escogitato numerosi mezzi per inattivare il programma apoptotico endocellulare)

7 Peculiarità del processo apoptotico: Ø una cascata di reazioni si susseguono in un ordine stereotipato al fine di terminare la vita cellulare Ø molte di queste reazioni sono bloccabili in punti ben precisi sia dall esterno (agenti farmacologici o inibitori di natura sintetica) che dall interno (modulazione di geni endogeni) Ø i residui cellulari restano vengono eliminati rapidamente da fagociti, professionali e non, evitando l innesco di una reazione infiammatoria

8 Un problema esistenziale: Perché una cellula dovrebbe suicidarsi?

9 A volte la morte cellulare rappresenta un evento positivo per l organismo 1. L apoptosi é richiesta per un normale sviluppo embrionale 2. L apoptosi é necessaria per la distruzione di cellule che rappresentano una minaccia per l integritá dell organismo

10 Apoptosi, sviluppo embrionale e differenziamento v Metamorfosi: il riassorbimento della coda del girino v Sviluppo: apoptosi delle cellule occupanti lo spazio interdigitali, formazione delle appropriate sinapsi neuronali; v Differenziamento: turnover fisiologico delle cellule mature in tessuti continuamente proliferanti (p.es., cellule intestinali, neutrofili)

11 Apoptosi e difesa dell organismo v Contro cellule infettate da virus (ad opera di linfociti T citotossici); v Contro cellule del sistema immune autoreattive; v Contro cellule in cui si verifica un danno al DNA; v Contro cellule tumorali.

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13 Caratteristiche morfologiche dell apoptosi Ø Diminuzione del volume cellulare (perdita di liquidi intracellulari per processi attivi mediati dalle pompe di membrana) Ø Condensazione e marginalizzazione della cromatina e frammentazione della stessa Ø Formazione di protuberanze (blebs) citoplasmatiche, delimitate da membrana (esposizione di PS) e contenenti frammenti di cromatina condensata e di organelli cellulari -> corpi apoptotici

14 La cellula in apoptosi subisce modificazioni morfologiche e biochimiche che portano alla sua frammentazione e ne favoriscono la fagocitosi

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17 normali apoptotiche

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19 La scale.a di DNA frammentato di una cellula apopto8ca

20 Normal Cell Cell shrinkage away from neighbouring cells Plasma membrane blebbing Cytoplasmic and nuclear condensation Margination of condensed chromatin Nuclear and cellular fragmentation Apoptotic Bodies Phagocytosis

21 Differenze morfologiche fra apoptosi e necrosi Membrane breaks down resulting in an inflammatory response! Edema! Membrane intact until phagocytosed! Pyknosis!

22 Morphological Differences between Apoptosis and Necrosis Apoptosis vs Necrosis Nuclei Cytoplasmic Organelles Cell Membrane Cell Volume In Tissues Dense Condensation of Chromatin Morphologically Intact Apoptotic Bodies, Blebbing Cells shrink Single Cells Affected Irregular Chromatin Clumping Disrupted Blebbing and Loss of integrity Cells swell Groups of Cells Affected Tissue Response None Inflammation

23 Necrosi vs apoptosi Distruzione causata da una bomba (Nagasaki, 1945) Demolizione di un rudere

24 Che cosa succede quando l apoptosi non funziona?

25 Il KO per Apaf- 1 arresta lo sviluppo embrionale

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27 Mancanza di apoptosi interdigitale

28 Mancanza di alvazione della caspasi 3

29 Diminuita apoptosi in vitro di cellule Apaf- 1 - /-

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31 Ruolo dell apoptosi nella tumorigenesi Aumento della sopravvivenza cellulare e riduzione dell apoptosi nell oncogenesi mutatazione di geni oncosoppressori p53 (50% dei tumori umani ) Iperespressione di Bcl-2 in alcune leucemie and linfomi B. Perdita di espressione del fattore attivante l apoptosi (Apaf-1) nel melanoma

32 Malattie Associate a deregolazione dell Apoptosi Aumento Apoptosi AIDS Malattie Neurodegenerative malattia di Alzeheimer, Morbo di Parkinson, Malattia di Huntington Inhibizione Apoptosi Cancro linfoma Follicolare carcinomi con mutazione di p53 Malattie Autoimmuni Lupus erytematoso Sistemico Infectioni Virali Herpesvirus, poxvirus, adenovirus

33 Ruolo dell apoptosi nelle Malattie Neurodegenerative Apoptosi fisiologica durante lo sviluppo embrionale del cervello innescata dall assenza di fattori di crescita Tossicità di aggregati di proteine con anomalie strutturali possono innescare apoptosi nella malattia di Alzeheimer, nel morbo di Parkinson, nella malattia di Huntington (Caspasi 9 attivata nel cervello degli alzheimeriani) amyloid-β Aggregati -Huntington IC Ca 2+ Oxidative stress Neuronal Receptors FADD/ Caspase 8 Apoptosis Apoptosis

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36 Le fasi del programma apoptotico 1. Decisione se iniziare o meno la procedura di suicidio cellulare 2. Passaggio del punto di non ritorno ( commitment ) 3. L esecuzione

37 Via intrinseca Via estrinseca

38 La decisione ed il passaggio del punto di non ritorno v Proteine regolatorie hanno il compito di integrare i segnali pro- ed anti-apoptotici, e a seconda delle circostanze intra- ed extra-cellulari avviare o meno l esecuzione 1. Adattatori, in grado di trasdurre direttamente segnali apoptotici agli esecutori 2. Regolatori della funzionalitá mitocondriale (membri della famiglia Bcl-2)

39 Il mitocondrio Ø Fasi precoci -> mantenimento della funzionalità mitocondriale Ø Rilascio di proteine normalmente residenti all interno del mitocondrio (citocromo c, Smac, HtrA2/Omi, AIF) Ø Caduta del potenziale di membrana mitocondriale e perdita della permeabilità della stessa (caspasimediata) Ø Collassamento e/o fissione dei mitocondri

40 Il citocromo c Ø normalmente risiede nello spazio fra la membrana interna ed esterna mitocondriale e funziona nel pathway respiratorio mitocondriale Ø viene rilasciato dai mitocondri nel cytosol dopo stimoli apoptotici Ø forma un complesso con Apaf-1 (l omologo di Ced-4) e procaspasi 9 (inattiva) in presenza di ATP -> apoptosoma, che porta ad autoattivazione della procaspasi 9 -> innesco della fase di esecuzione Ø il rilascio precede i cambiamenti morfologici, è un fenomeno del tipo tutto-o-nulla ed è rapidissimo e sincrono (meno di 5 minuti) Ø varie ipotesi per la via d uscita: Bax-channels, megacanale mitocondriale (o PTP, permeability transition pore)

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44 apoptosoma Apaf-1 WD-40 Repeats CARD CED-4 datp dadp Apaf-1 unfolding * cytochrome c Pro-caspase-3/-7 Pr o L S * * * * Active caspase-3/-7 S L CARD CARD L S Pro-caspase-9 Active caspase-9

45 v Smac/Diablo v HtrA2/Omi Altre proteine rilasciate dal mitocondrio v AIF: proteina dello spazio intermembrana -> nucleo -> cambiamenti nella morfologia nucleare associati all apoptosi (caspasi-indipendente) Coinvolto nell apoptosi solo in seguito a particolari stimoli (necessario per la cavitazione nei primi stadi embrionali) v EndoG: proteina dello spazio intermembrana -> nucleo -> cambiamenti nella morfologia nucleare associati all apoptosi

46 CITOPLASMA NUCLEO ICAD ICAD CAD CAD Frammentazione DNA caspasi- 3 EndoG HMW + oligonuclosomi AIF Condensazione croma8na +HMW

47 Regolazione mitocondriale da parte della Bcl2 family membri pro-apoptotici si legano al PTP > apertura > rilascio del citocromo c membri anti-apoptotici si legano al PTP apertura BH3-only inducono la oligomerizzazione di Bax o Bak sul mitocondrio > canale > rilascio del citocromo c membri anti-apoptotici oligomerizzazione e formazione del canale

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49 La rimozione dei cadaveri

50 Pathways anti-apoptotici

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52 Altre forme di morte cellulare Necroptosi, entosi

53 La necroptosi Innescata da s8moli che più frequentemente inducono apoptosi: legame di un ligando ai death receptors (processo quindi regolato) Non richiede fuoriuscita di citocromo C, nè alvazione di caspasi nè coinvolge Bcl2 family La membrana cellulare perde permeabilità, non c è frammentazione nucleosomale del DNA, c è perdita di funzionalità mitocondriale tul fenomeni simili alla morte per necrosi

54 Possibili meccanismi molecolari Danno cellulare che alva s8moli pro- apopto8ci (p.es. alvazione dei death receptors) cellula che avvia il processo apopto8co Contemporaneamente, il danno cellulare porta a disfunzione mitocondriale e perdita del pool di ATP l apoptosi non può procedere, e quindi la cellula prosegue il suo cammino verso la morte per necrosi

55 L adesione cellulare può portare alla inges8one di una cellula da parte della vicina

56 Cara.eris8che dell entosi L adesione intercellulare (mediata da caderine ed altre molecole) è regolata dall interazione delle cellule epiteliali con la matrice extracellulare, che orienta e limita le interazioni cellula- cellula In par8colari condizioni in cui le cellule epiteliali non aderiscono alla matrice extracellulare, ci può essere un processo estremo di adesione che porta all inges8one cellulare Nelle prime fasi, il processo è reversibile e la cellula ingerita è vitale La cellula ingerita ( entocita ) viene quindi degradata per fusione con i lisosomi dell ospite Un meccanismo di protezione an1- metasta1co?

57 Tra la vita e la morte L Autofagia

58 Cara.eris8che Autophagy is a response to nutrient stress to maintain adequate internal levels of nutrients (self- cannibaliza8on). Role in cell death is best revealed if apoptosis is disabled (bax/bak- /-, caspase inhibitors, Bcl- xl++). In nutrient- poor condi8ons (or equivalent effects on mtor signaling), autophagy maintains survival. In nutrient- rich condi8ons, autophagy promotes cell death in response to other types of stress.

59 Sopravvivenza o morte cellulare? Nella maggior parte delle circostanze, l autofagia cos8tuisce un meccanismo di ada.amento allo stress Le modalità con cui l autofagia si trasforma in un processo di morte cellulare non sono chiare anche dopo estensiva auto- cannibalizzazione in assenza di fa.ori di crescita, le cellule possono recuperare se trasportate in condizioni adeguate Non ci sono evidenze che geni coinvol8 nel processo di autofagia siano implica8 in processi di morte cellulare fisiologica (es. sviluppo embrionale) nematodi KO per bec- 1, ortologo di ATG6/beclina 1 e topi KO per la beclina 1 hanno un numero maggiore di cellule apopto8che

60 Autophagy/xenophagy Autophagy eat oneself Xenophagy eat foreign mager Highly conserved and regulated process that maintains cellular homeostasis and protects cells against starvakon and microbe invasion

61 3 Stages IniKaKon: nutrient starvakon, growth factor- mediated starvakon ExecuKon MaturaKon Nature reviews microbiology :301

62 Autophagic process Cytoplasmic organelles and porkons of cytoplasm sequestered in double membrane- bound vacuoles Source of membrane mulkfactorial (ribosome- free ER?) Fuse with lysosomes Science :990 Nature reviews microbiology :301

64 Lum et al., 2005

65 IniKaKon:Signaling pathways Trimeric G proteins Growth receptors PI3K (classes I & III) protein phosphatases mtor

66 ExecuKon Requires covalent- conjugakon pathways Requires Atg3, Atg7, Atg10 Homologs of ubiquiknylakon proteins Modifies pathway components but does not target them for degradakon ProducKon of PIP3 via hvps34 (class III PI3K) Inhibited by wortmanin, 3- Methyladenine Promotes proteolysis- >produckon of amino acids Complex formed between hvps34, Atg14, & Atg6 (Beclin- 1) which is necessary for downstream recruitment and localizakon of Atg5 & Atg12 Covalent linkage of Atg5 and Atg12 on pre- autophagosomal membrane Protease cleavage of Atg8 (MAP1 Light chain 3 (LC3), followed by covalent lipidakon to phosphakdylethanolamine and translocakon to autophagosome membrane

67 Fusion Autophagosomes fuse with endosomes Acquire characteriskcs of lysosomes LAMP1 & 2 Accessible to DAMP Cathepsins, acid phosphatases Vesicle fusion mediated by Rabs (Rab24)

68 Involved in many processes ATG6/Beclin 1: tumour suppressor gene Deleted in sporadic breast, ovarian, prostate CA Dauer formakon in C. elegans ATG5 & ATG7: Dictyostelium nitrogen starvakon Prevent premature senescence Host defense against pathogen invasion

69 Autofagia ed omeostasi cellulare L autofagia è coinvolta nella eliminazione di proteine danneggiate che se accumulate possono portare alla formazione di aggrega8 Eliminazione di organelli malfunzionan8 Mentre l eliminazione di proteine può essere svolta anche da altri sistemi (proteasoma), l autofagia è l unico processo cellulare che può portare alla degradazione di interi organelli (mitocondri, perossisomi, ecc.)

70 Autofagia e malale neurodegenera8ve Autofagosomi si accumulano nel cervello dei pazien8 affel da diverse malale degenera8ve inizialmente, l autofagia ritenuta come un meccanismo patogene8co e scatenante la morte cellulare a.ualmente, almeno nei modelli animali è chiaro che l autofagia rappresenta un meccanismo di difesa e l accumulo di autofagosomi una risposta fisiologica e di tenta8vo di clearance delle componen8 cellulari danneggiate

71 Microbes & autophagy Diverse strategies Host defense Bacterial manipulate it to survive intracellularly Nature reviews microbiology :301

72 Autofagia e cancro La dimostrazione che il gene per la beclina è perso in diversi tumori e quindi è un candidato oncosoppressore ha portato ad ipo8zzare che l autofagia sia un meccanismo prevalentemente di difesa contro i tumori L autofagia però può anche promuovere la sopravvivenza delle cellule tumorali in condizioni di stress (mancanza di nutrien8, tra.amen8 farmacologici)

73 Modelli animali di studio del rapporto fra autofagia e cancro Solo una copia di bec- 1 (beclina) è persa nei tumori mammari Topi bec- 1 +/- : diminuita autofagia, aumento della frequenza di diversi 8pi di tumori Due altri gene oncosoppressori (PTEN e p53) s8molano l autofagia inibendo la funzione di TOR

74 Autofagia ed invecchiamento Il digiuno intermi.ente promuove la longevità La dieta (restrizione calorica) è un indu.ore di autofagia in tu.e le specie La aumentata longevità indo.a da restrizion calorica non viene mantenuta se vi è inalvazione dell autofagia modelli animali semplici (verme, moscerino) Vi è una diminuita espressione dei geni autofagici con l aumentare dell età

75 ALvazione dell autofagia aumenta la longevità nei mammiferi Gli animali sono sta8 tra.a8 con rapamicina inibitore di mtor e quindi alvatore dell autofagia- a par8re da 600 giorni di età (adulta- inizio della vecchiaia). I topi sopravvivono Più a lungo dopo tra.amento (meccanismi molecolari ancora da definire).