ANALISI MICROBIOLOGICHE DELLE ACQUE PER USO UMANO Riferimenti Normativi e Terreni di Coltura

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1 numero 13 maggio 2009 ANALISI MICROBIOLOGICHE DELLE ACQUE PER USO UMANO Riferimenti Normativi e Terreni di Coltura Il Decreto Legislativo n. 31 del 2 febbraio 2001, con le successive integrazioni e modifiche, dà tutti i riferimenti per le metodiche analitiche da seguire nell analisi microbiologica delle acque per uso umano (acque imbottigliate ed acque potabili in genere). Questa norma recepisce la Direttiva Europea in materia, che utilizza come base i metodi di indagine proposti dagli organismi standard internazionali, stabilendo le procedure per il campionamento e l analisi delle acque. 1. CAMPIONAMENTO Il campionamento viene effettuato in flaconi sterili della capacità di almeno 500 ml. Se le acque raccolte sono clorate, va neutralizzato il cloro presente (che avrebbe effetto battericida) utilizzando il sodio tiosolfato penta idrato. Facendo riferimento alla ISO , è perciò previsto che i flaconi contengano tale sostanza al 10% nella quantità di 1 ml per litro d acqua (quindi 100 mg/l). Va aggiunto che secondo la norma ISO/FDIS 19458:2007 (standard francese NTF 90 40) il quantitativo di sodio tiosolfato richiesto è pari invece a 20 mg/l. Il volume di campionamento richiesto per ogni parametro da valutare è pari a 100 ml. Per le acque imbottigliate, il volume richiesto è di 250 ml. 2. PARAMETRI L analisi di routine delle acque prevede che si vadano a monitorare sia i microrganismi patogeni che quelli particolarmente resistenti, valutando in particolare i seguenti parametri: -Escherichia Coli: rappresenta l indicatore primario di contaminazione fecale e deve essere obbligatoriamente assente; -Enterococchi fecali: sono considerati indicatori di contaminazione fecale e come tali devono essere obbligatoriamente assenti; -Coliformi a 37 C: indicatori di qualità e di efficienza del trattamento dell acqua; devono essere obbligatoriamente assenti; 1/5

2 -Pseudomonas aeruginosa: indicatore di qualità valutato solo per le acque imbottigliate, nelle quali deve essere obbligatoriamente assente; -Clostridium perfringens, spore incluse: da valutare solo in caso di acque superficiali, nelle quali devono essere obbligatoriamente assenti; -Conta totale a 22 C e a 36 C: indicatore di qualità e di efficienza di trattamento, mette in evidenza gruppi eterogenei di microrganismi mesofili e psicrofili. Per le acque imbottigliate sono stabiliti dei valori di parametro differenziati a 22 C (100 CFU/ml) e a 36 C (20 CFU/ml). 3. METODI DI ANALISI 3.1 Metodica con membrana filtrante La procedura con membrana filtrante prevede che il campione di acqua venga filtrato sterilmente attraverso una membrana di esteri di cellulosa, grigliata, con diametro di 47 mm e pori di 45 µm. Le caratteristiche di queste membrane sono stabilite dalla norma ISO 7704:1985. La membrana viene quindi trasferita per le successive analisi su terreno agarizzato specifico a seconda del parametro da valutare. 3.2 Metodica per inclusione La Conta totale a 22 e a 36 C prevede non il metodo con membrana filtrante ma il metodo per inclusione. In questo caso, viene generalmente considerato un campione di 1 ml (comunque mai superiore ai 2 ml). Tale volume viene seminato sul fondo di capsule Petri vuote, successivamente (entro 15 minuti) viene aggiunto l apposito terreno liquefatto alla temperatura di 45 ± 1 C, lasciando poi solidificare. 4. ESCHERICHIA COLI La procedura fa riferimento alla ISO :2000 ed è qui di seguito sintetizzata: -membrana su Tergitol 7 + TTC agar con sviluppo di colonie gialle con parte centrale aranciata -conferma con prova dell indolo (positiva) incubando in Tryptophan culture Broth a 44 ± 1 C per ore ed aggiungendo Reattivo di Kovacs. 2/5

3 La stessa ISO indica anche la seguente procedura alternativa, rapida: -membrana su Tryptone Soy agar -incubazione a 36 ± 1 C per 4-5 ore -membrana su Tryptone Bile Soy agar -incubazione a 44 ± 1 C per ore -conferma con prova dell indolo (positiva) 5. ENTEROCOCCHI FECALI La procedura fa riferimento alla ISO :2000 ed è qui di seguito sintetizzata: -membrana su Slanetz-Bartley agar -incubazione a 36 ± 1 C per ore con sviluppo di colonie dal rosa al rosso scuro e marrone -conferma con prova dell idrolisi dell esculina (positiva): trasferimento della membrana su Bile aesculine azide agar e incubazione a 44 ± 1 C per 2 ore con sviluppo di colorazione neromarrone. 6. COLIFORMI A 37 C La procedura fa riferimento alla ISO :1990 ed è qui di seguito sintetizzata: -membrana su m-endo agar LES con sviluppo di colonie rosse con riflesso metallico -conferma facoltativa con prova della fermentazione del lattosio in Brodo Lattosato al bromocresolo, con incubazione a 36 ± 1 C per ore (positiva) La ISO :2000 propone anche la seguente metodica, comune ad Escherichia Coli: -membrana su Tergitol 7 + TTC agar con sviluppo di colonie gialle con parte centrale aranciata 3/5

4 7. PSEUDOMONAS AERUGINOSA La procedura fa riferimento alla ISO 16266:2006 ed è qui di seguito sintetizzata: -membrana su Pseudomonas CN agar -incubazione a 36 ± 2 C per 44 ± 4 ore -colonie verdi-blu: confermate come P. aeruginosa -colonie fluorescenti non verdi-blu: da sottoporre a conferma: -subcultura su Nutrient Agar -incubazione a 36 ± 2 C per 22±2 ore -conferma con prova della produzione di ammonio da acetamide (positiva), incubando in Acetamide Broth a 36 ± 2 C per 22 ± 2 ore ed aggiungendo il reattivo di Nessler -colonie marroni-rossastre: da sottoporre a conferma: -subcultura su Nutrient Agar -incubazione a 36 ± 2 C per 22±2 ore -conferma con prova della citocromo ossidasi (positiva) -conferma con verifica fluorescenza su Pseudomonas King B Agar dopo incubazione a 36 ± 2 C fino a 5 giorni -conferma con prova produzione di ammonio da acetamide in Acetamide Broth (incubazione a 36 ± 2 C per 22 ± 2 ore) e reattivo di Nessler 8. CLOSTRIDIUM PERFRINGENS La procedura non fa riferimento ad alcuna ISO ed è qui di seguito sintetizzata: -membrana su m-cp agar -incubazione a 44 ± 1 C per ore in anaerobiosi, con sviluppo di colonie dal giallo opaco -conferma con esposizione per sec a vapori di idrossido di ammonio (positiva): colonie rosa-rosse 9. CONTA TOTALE A 22 e a 36 C La procedura fa riferimento alla ISO 6222:2001 ed è qui di seguito sintetizzata: -inclusione del campione in capsule petri con Yeast Extract Agar -incubazione di una capsula petri a 36 ± 1 C per ore -incubazione di una capsula petri a 22 ± 1 C per ore -conta delle colonie 4/5

5 Terreni di coltura per analisi delle acque, tutti i prodotti nel catalogo Kairosafe Escherichia Coli 2249A Tergitol 7 + TTC Agar 10 piastre 60 mm Tryptone Soy Agar 20 piastre 90 mm Tryptophan Culture Broth 10 provette da 3 ml Tryptone Soy Agar 10 piastre 60 mm Tryptone Bile Soy Agar 10 piastre 60 mm Enterococchi Fecali 2298 M-Enterococcus Slanetz-Bartley 10 piastre 60 mm 2232 Bile aesculine azide agar 10 piastre 60 mm Coliformi a 37 C 2284 M-Endo Agar LES 10 piastre 60 mm Tryptone Soy Agar 20 piastre 90 mm Brodo Lattosato al bromocresolo 10 provette 10 ml 2249A Tergitol 7 + TTC Agar 10 piastre 60 mm Pseudomonas aeruginosa 127 Pseudomonas CN Agar 10 piastre 60 mm Nutrient Agar 20 piastre 90 mm Nutrient Agar 4 flaconi da 100 ml Acetamide Broth 10 provette da 5 ml Pseudomonas King B Agar 10 provette da 5 ml Clostridium perfringens 2255 m-cp agar 10 piastre 60 mm Conta totale a 22 e a 36 C Yeast Extract agar (Water PCA) 4 flaconi da 100 ml Yeast Extract Agar (Water PCA) 10 provette 15 ml I terreni di coltura sono disponibili anche in altri formati, incluso quello disidratato, con i supplementi necessari Per informazioni e richieste: KAIROSafe S.r.l. Sistiana, 41/D Duino Aurisina (TS) Tel/fax: info@kairosafe.it web: 5/5