Applicazioni biotecnologiche in systems biology

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1 Applicazioni biotecnologiche in systems biology Lezione #6 Dr. Marco Galardini AA 2012/2013

2 Gene regulation analysis Lezione #6 Dr. Marco Galardini AA 2012/2013

3 Regolazione genica Elementi molecolari e di sequenza

4 Relazione Genotipo - Fenotipo Quale parte del genotipo è correlabile col fenotipo? Presenza/assenza di geni Presenza/assenza di un regolatore e/o del motivo di binding Presenza/assenza di interazione fra proteine Regolazione non convenzionale : asrna, metilazione, Un gene -> un fenotipo Un genoma -> molti fenotipi

5 Regolazione genica Aggiunta di una componente dinamica al sistema cellulare Risposta agli stimoli esterni Risparmio di energia Espressione al momento giusto Assenza di interferenza fra prodotti proteici Espansione delle capacita dell organismo Paradosso C-value / G-value Negli organismi complessi la differenza la fa la regolazione

6 Regolazione genica La regolazione genica aggiunge complessita Una possibile spiegazione al paradosso del G-value Un numero alto di geni richiede un altissimo numero di regolatori Scarsa efficienza dell organismo

7 A livello molecolare Regolazione in cis L elemento regolativo e prossimo al gene regolato Specifiche sequenze di DNA vengono riconosciute dai TF Interazione con l RNA polimerasi Attivatori Repressori Il legame col dna in prossimita del gene e sufficiente ad alterare l espressione del gene Legame meno evidente negli eucarioti La sequenza riconosciuta dal TF e chiamata motivo

8 A livello molecolare Domini funzionali Separati Indipendenti Domini di legame al DNA e riconoscimento del cognate motif Helix-turn-helix, zinc-finger, leucine-zipper Gli altri domini della proteina indicano il segnale che viene ricnosciuto dal regolatore Modularita dei domini differente comportamento regolativo

9 A livello molecolare Domini di legame al DNA e riconoscimento del cognate motif Helix-turn-helix, zinc-finger, leucine-zipper Gli altri domini della proteina indicano il segnale che viene ricnosciuto dal regolatore Modularita dei domini differente comportamento regolativo

10 Individuazione motivi Come individuare un TF binding motif? Prossimita ad un gene -400 / +100 Sequenza piu variabile rispetto ad un gene Non si applica la traduzione Il legame del TF ha una componente termodinamica Variabilita nella forza del legame Regole meno certe nell individuazione delle sequenze

11 Individuazione motivi Come individuare un TF binding motif? Determinazione dei geni regolati Esperimenti di analisi della trascrizione (microarray, RNAseq, geni reporter, ) Non esiste un metodo per stabilire il motivo a partire dal dominio Allineamento sequenze a monte dei geni regolati Ricerca motivi conservati

12 Sequence logo Contenuto di informazione Posizione nel motivo Come individuare un TF binding motif? Descrive un motivo Alcune posizioni del motivo sono fisse, altre estremamente variabili Spesso i domini di legame al DNA sono dimerici e palindromi

13 Position weigth matrix (PWM) Position specific scoring matrix (PSWM) Come individuare un TF binding motif? Descrive un motivo Indica la frequenza (e quindi la probabilita ) di trovare un certo nucleotide ad ogni posizione Utilizzato per cercare le occorrenze di un motivo all interno di un genoma

14 Position weigth matrix (PWM) Position specific scoring matrix (PSWM)

15 Ricerca motivo A G T C A G T C T T G A T C A A G A T C A A A T G C Bassa similarita Ricerca PWM tramite sliding window Per ogni posizione nucleotidica verifico la similarita con il motivo Calcolo di uno score di similarita per ogni posizione Ottengo uno score per ogni posizione Scarsa similarita : indica il rumore di fondo delle mie sequenze target Alta similarita : score significativamente maggiore del rumore di fondo

16 Ricerca motivo A G T C A G T C T T G A T C A A G A T C A A A T G C Alta similarita Ricerca PWM tramite sliding window Per ogni posizione nucleotidica verifico la similarita con il motivo Calcolo di uno score di similarita per ogni posizione Ottengo uno score per ogni posizione Scarsa similarita : indica il rumore di fondo delle mie sequenze target Alta similarita : score significativamente maggiore del rumore di fondo

17 Ricerca motivo Numero di hit Score Ricerca PWM tramite sliding window Ottengo uno score per ogni posizione Scarsa similarita : indica il rumore di fondo delle mie sequenze target Alta similarita : score significativamente maggiore del rumore di fondo

18 Contenuto informativo Differenza fra procarioti ed eucarioti

19 Contenuto informativo Differenza fra procarioti ed eucarioti

20 Contenuto informativo Che caratteristiche deve avere un motivo per distinguersi dal rumore di fondo? Analisi del contenuto di informazione del motivo e del genoma Dipendenza dalla dimensione e contenuto di basi del motivo Dipendenza dalla dimensione e contenuto di basi del genoma

21 Contenuto informativo Che caratteristiche deve avere un motivo per distinguersi dal rumore di fondo? Batteri: 10 6 possibili siti di legame Eucarioti: 10 9 possibili siti di legame Contenuto minimo di informazione di un motivo

22 Contenuto informativo Contenuto di informazione di un motivo Dipendenza dalla frequenza delle varie basi nel genoma Sostanzialmente dal contenuto in GC

23 Contenuto informativo

24 Contenuto informativo Genoma 1: Alto contenuto in GC Alto contenuto informativo Genoma 2: Basso contenuto in GC Basso contenuto informativo

25 Contenuto minimo di informazione di un dominio

26 Che caratteristiche deve avere un motivo per distinguersi dal rumore di fondo? Nei batteri la maggior parte dei motivi di legame e facilmente distinguibile dal background Pochi siti di legame sono necessari ad assicurare il legame del TF Negli eucarioti i motivi non sono distinguibili dal rumore di fondo Molti motivi in cluster sono necessari a garantire effetti regolativi

27 Reti logiche I sistemi cellulari come molecular computing machines Oppure molecular lego

28 Reti logiche Requisiti di un sistema regolativo: 1.Stimolo 2.Trasmissione al target 3.Risposta 4.Reset del sistema

29 Reti logiche Trasduzione del segnale: Un singolo stimolo può indurre una o più risposte Una singola risposta può essere controllata da un singolo segnale o influenzata da molti segnali Ciascuna risposta può essere stimolatoria o inibitoria La trasmissione del segnale può smorzare o amplificare gli stimoli

30 Reti logiche Caratteristiche di una rete regolativa: Tende ad essere unidirezionale Ha un componente logico Produce un pattern dinamico

31 Reti logiche Representation of a promoter as a logic gate Hunziker A et al. PNAS 2010;107:

32 Reti logiche Si possono fare analogie con i circuiti integrati per quanto riguardo il processamento del segnale. Importanti differenze: Bassa velocita di trasmissione del segnale Nei batteri la velocita di regolazione e proporzionale al tempo di generazione Bassa sincronicita Bassa interconnessione I regolatori globali sono pochi Basso numero di nodi Similarita Proprieta ON/OFF del segnale Espressione basale ( 1nM) Attivazione espressione ( 1μM)

33 Reti logiche La regolazione puo essere approssimata come una funzione proporzionale alla concentrazione del TF e della sua forza di legame al promotore Piu regolatori possono interagire assieme Ognuno risponde al proprio stimolo Fattori importanti per determinare l effetto dell interazione La forza di legame di ciascun regolatore (misurabile tramite cistanti di dissociazione) L interazione fisica (sterica) fra i regolatori e la RNA polimerasi Dipendente dalla distanza reciproca dei siti di legame Dipendente dalla distanza dei promotori dalla RNA polimerasi

34 Reti logiche Operatori logici Legame forte Legame debole Interazione cooperativa Il modo con cui i due regolatori interagiscono fra loro determina il modo con cui viene processato il segnale ed espresso o meno il gene target Il posizionamento relativo dei promotori e importante Il DNA e a doppia elica!

35 Reti logiche Operatori logici Lo stesso regolatore puo agire da attivatore o repressore La differenza sta nella posizione del motivo E l interazione con altri regolatori Concetti importanti in synthetic biology Possibile costruire un gene che reagisce a determinati stimoli sfruttando i regolatori gia esistenti

36 Reti logiche Operatori logici Cascate regolative La somma delle varie logiche determina pattern di espressione particolari Difficolta di predizione Alta dinamicita e modularita del sistema