Protozoi. Generalità sui Protozoi

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1 Azienda Ospedaliero-Universitaria Policlinico di Catania Laboratorio Centralizzato di Analisi Laboratorio di Micologia Università degli Studi di Catania Dipartimento di Scienze Microbiologiche e Scienze Ginecologiche Protozoi Prof.Salvatore Oliveri [email protected] Generalità sui Protozoi Sono organismi unicellulari, eucariotici, eterotrofi con dimensioni che vanno dai 2 ai 70 µ. Possono esistere in forma di trofozoite, metabolicamente attiva, e in forma di cisti, che ha funzione di resistenza e di riproduzione Struttura Protozoi

2 Morfologia Membrana plasmatica Delimita completamente il corpo cellulare. La struttura base è costituita da un mosaico fluido di molecole proteiche avvolte da un doppio strato lipidico Funzioni: Assunzione sostanze nutritive osmosi fagocitosi (particelle solide) pinocitosi (particelle liquide) apertura orale (citostoma) L'escrezione può avvenire per: diffusione esocitosi polo escretorio (citopigio) Morfologia Glicocalice Strato più esterno della membrana plasmatica ricco in carboidrati Funzioni Barriera chimica e meccanica Interazione ospite-parassita Riconoscimento e ancoraggio a particolari strutture Proprietà antigeniche

3 Morfologia Parete cistica Si forma quando un protozoo passa dallo stato di trofozoite (forma vegetativa) allo stato di cisti (forma di resistenza a fattori ambientali sfavorevoli) Protegge vari protozoi parassiti nelle fasi di esposizione dell organismo all ambiente esterno e prende origine dal rafforzamento esterno alla membrana plasmatica determinato dalla secrezione e organizzazione di varie classi di macromolecole (fosfoproteine, lipoproteine, cellulosa, etc.) E. histolytica: trofozoite E. histolytica: cisti Morfologia Citoplasma Contiene vari organuli e strutture Citoscheletro: complesso sistema contenente elementi contrattili (filamenti di actina, miosina e tropomiosina) organizzati in microtubuli. E responsabile del flusso citoplasmatico (funzione ATP dipendente) e del movimento delle amebe. Mitocondri: presenti nei protozoi aerobi, sono simili a quelli dei Metazoi; la maggior parte dei protozoi presenta un solo lungo mitocondrio contenente il cinetoplasto (Emoflagellati), ossia un organello extranucleare a forma di bastoncello ricco di DNA che governa la funzione respiratoria Idrogenosomi: presenti nei protozoi anaerobi Reticolo endoplasmatico: ricco di ribosomi (subunità 60S e 40S) Apparato del Golgi: assente in alcuni protozoi Lisosomi: contengono enzimi litici che si attivano dopo fusione con vescicole endocitotiche (fagolisosomi)

4 Morfologia Nucleo Nucleo Il DNA è organizzato in cromosomi in numero e forma variabile Nucleoli con RNA Possono essere presenti più nuclei I Ciliati possiedono: un micronucleo (funzione riproduttiva) e un macronucleo (funzione trofica). Movimento Ciglia e flagelli Flagellati e Ciliati Possiedono un uguale struttura di base, che origina dal blefaroplasto (centro di attività morfogenetiche) Sono costituiti da un assonema con 9 doppi microtubuli attorno a 2 microtubuli centrali In alcuni stadi di sviluppo il flagello manca (ad es. nelle cisti) I protozoi Flagellati possono avere da 1 (Leishmania) a 8 flagelli (Giardia) I protozoi Ciliati hanno un numero imprecisato di ciglia (più corte, più sottili, orientate in fila) Balantidium coli

5 DINAMICA DEL MOVIMENTO Nelle Amebe: flussi di materiale citoplasmatico (formazione di pseudopodi - movimento ameboide) Movimento ameboide di un trofozoite di Entamoeba histolytica Movimento Nel genere Trichomonas e Trypanosoma presenza di una membrana ondulante Trichomonas Gli Sporozoi presentano movimenti ondulatori o per scorrimento. Importante anche il complesso apicale Trypanosoma Nei protozoi provvisti di pellicola e di un ricco corredo di microtubuli, il citoscheletro gioca un ruolo importante per il movimento

6 Principali Protozoi intestinali dell uomo PHYLUM SARCOMASTIGOPHORA Flagellati Amebe PHYLUM APICOMPLEXA Sporozoi, Coccidi PHYLUM MICROSPORA Microsporidi PHYLUM CILIOPHORA Ciliati Leishmania Protozoo asessuato, dixeno, agente eziologico della leishmaniosi Il ciclo vitale si svolge tra il vettore, il Phlebotomus e un ospite (molte specie animali tra cui l uomo)

7 Leishmania Principali specie di Leishmania di interesse medico Leishmania donovani Leishmania archibaldi Leishmania infantum Leishmania tropica Leishmania major Leishmania aethiopica Leishmania amazonensis Leishmania venezuelensis Leishmania mexicana Leishmania braziliensis etc. Vettore È un dittero ematofago appartenente al genere: Phlebotomus in Europa, Asia Africa Lutzomya nelle Americhe Etologia delle femmine di flebotomo: Pungono solo di notte Sono vettori molto efficaci Hanno il massimo dell infettività tra Agosto e Settembre

8 Nel ciclo si alternano due morfotipi: Amastigote: forma intracellulare, rotondeggiante, aflagellata. Si trova all interno dei macrofagi nell ospite intermedio Promastigote: forma allungata, flagellata. Si trova nel vettore. Entrambi i morfotipi si dividono per scissione semplice Ciclo biologico Leishmania

9 Leishmania-Patologia La leishmaniosi è una reticoloendotelite il cui periodo di incubazione è compreso tra i 3 e gli 8 mesi Sono frequenti infezioni asintomatiche Nell uomo la leishmaniosi si può presentare in tre forme cliniche L.cutanea o Bottone d Oriente L.mucocutanea o Espundia Dai macrofagi il protozoo passa al sistema reticolo endoteliale, midollo osseo, milza e cellule di Kupfer (fegato) L.viscerale o Kala-Azar Trypanosoma Morfotipi caratteristici del genere Trypanosoma sono i tripomastigoti, sempre presenti nell ospite vertebrato, e gli epimastigoti, che si formano nell ospite vettore Vettori: Tryatoma infestans, La trasmissione al vertebrata può avvenire tramite la puntura o mediante contaminazione di pelle e mucose con materiale fecale infetto

10 Trypanosoma Le specie che parassitano l uomo sono: Trypanosoma cruzi (specie americana) Trypanosoma brucei gambiense Trypanosoma brucei rhodesiense Sottospecie africane Sulla base della via di trasmissione il genere Trypanosoma viene suddiviso in due sezioni: Stercoraria e Salivaria Ciclo biologico Trypanosoma

11 Trypanosoma cruzi Agente eziologico della malattia di Chagas o tripanosomosi americana, La via naturale di trasmissione è costituita dalla contaminazione dell individuo con feci di triatomine contenenti tripomastigoti metaciclici Altra via importante di trasmissione di T.cruzi è quella trasfusionale, cosi come aumentano le infezioni contratte a seguito di trapianti di organi infetti. La distribuzione di T.cruzi negli ospiti naturali si estende nel Sud delle Americhe, mentre quella nell uomo è più limitata dal Texas e California, allo Stato di Chubut in Patagonia. Tutti gli Stati dell America centrale e del Sud America sono endemici per la malattia Trypanosoma brucei gabiense e rhodesiense Sono gli agenti eziologico della malattia del sonno o tripanosomosi africana, trasmessi all uomo da ditteri ematofagi del genere Glossina La tripanosomosi africana si estende dal Sud del Sahara al Nord del Kalahari La malattia ha una distribuzione geografica molto irregolare; i focolai di endemia sono sparsi in regioni rurali, in prossimità di corsi d acqua nei paesi illustrati nella figura Schematizzazione del Trypanosoma gabiense

12 Flagellati intestinali Giardia lamblia (G.intestinalis) Chilomastix mesnili Dientamoeba fragilis Trichomonas hominis Enteromonas hominis Retortamonas hominis Amebe intestinali Entamoeba hystolitica Entamoeba dispar Entamoeba hartmanni Entamoeba coli Entamoeba polecki Endolimax nana Iodamoeba buetschlii Blastocystis hominis

13 Principali Protozoi intestinali dell uomo Flagellati e Amebe In questi due gruppi prevalgono le specie non patogene, espressione di una contaminazione fecaleambientale, quindi idrica e/o alimentare, che favorita da una condizione intestinale anomala, può portare alla colonizzazione. In genere i protozoi non patogeni scompaiono dall organismo ospite in un lasso di tempo più o meno breve senza bisogno di alcun trattamento specifico Giardia intestinalis Diffusione ubiquitaria Distribuzione Nei paesi sviluppati e il più comune patogeno intestinale Nelle aree a scarso livello igienico ha una maggiore prevalenza in particolare Africa, Asia e America latina (200 milioni di persone affette; 500 mila nuovi casi l anno, soprattutto in età pediatrica) Serbatoio di infezione Uomo, cane, gatto e altri mammiferi Modalità di trasmissione Diretta Indiretta Contagio interumano Ingestione di acqua e/o cibi contaminati

14 Presenta un ciclo vitale con una fase di trofozoite ed una di cisti Trofozoiti Hanno due nuclei (10-20µ), con una concavità ventrale, un disco adesivo, assostile e otto flagelli Giardia intestinalis Ciclo Vitale Cisti Sono ovali, a volte rotondeggianti (8-10µ), contengono 4 nuclei, assostile, i corpi parabasali Giardia intestinalis Ciclo Vitale Le cisti una volta ingerite superano l ambiente acido dello stomaco indenni A livello del duodeno ogni cisti matura, libera due trofozoiti che mediante il disco adesivo aderiscono fortemente ai microvilli della mucosa raggiungendo la prima parte del digiuno moltiplicandosi rapidamente I trofozoiti che si staccano dalla parete vengono trasportati lungo l intestino,dove per la progressiva disidratazione della massa fecale tendono ad incistarsi Le cisti vengono escrete con le feci e sono infettive al momento dell emissione Le cisti sopravvivono per oltre tre mesi in acqua e resistono alla normale clorazione di acque potabili

15 Giardia intestinalis Sintomatologia Decorso asintomatico Stato acuto Decorso sintomatico Stato cronico Caratterizzato da vari disturbi intestinali, quali diarrea acquosa, nausea, anoressia ed emissione di gas intestinali. La febbre non è sempre presente. Rara la presenza di muco e sangue nelle feci Durata 3-4 giorni, seguita da completa guarigione A causa, probabilmente della variabilità antigenica di alcuni ceppi che sfuggono alla risposta anticorpale dell individuo infettato,tale infezione può durare da 1 a 2 anni con diarrea intermittenti, senso di stanchezza, anoressia e perdita di peso Giardia intestinalis Sintomatologia Forme intestinali Duodeniti Sindrome pseudoulcerosa duodenale Enterite Sindrome da malassorbimento Colite Proctosigmoidite Appendicite Forme epatobiliari Colecistite Angiocolite Epatite Forme a prevalente sintomatologia extradigestiva Anemiche Febbricolari Allergiche Neurologiche

16 Giardia intestinalis Fattori di patogenicità Ostruzione meccanica prodotta dai trofozoiti che ricoprono a lenzuolo la mucosa intestinale con conseguente blocco dell attività di assorbimento, in particolare dei grassi e delle vitamine liposolubili Irritazione della mucosa intestinale causata dall adesione dei trofozoiti agli enterociti con danno diretto e conseguenti alterazioni funzionali di assorbimento Capacità da parte dei trofozoiti di variare gli antigeni di superficie (VSPs), i che contengono domini leganti metalli, in particolare lo zinco. Tale capacità porterebbe a una competizione per lo zinco a livello intestinale con decremento di attività enzimatiche specifiche e quindi a malassorbimento dei grassi e delle vitamine liposolubili (A e B12) e degli zuccheri Capacità invasive dimostrate in sporadici casi Dientamoeba fragilis Distribuzione Ubiquitaria Trasmissione Feco-orale ( mediante Ascaris o Enterobius) Infezione E maggiormente diffusa nei bambini tra 5 e 9 anni I dati riguardanti la diffusione sono sicuramente sottostimati in quanto solo pochi laboratori ricercano routinariamente questo protozoo (identificato solo nel 5% dei campioni esaminati)

17 Dientamoeba fragilis Trophozoite Cecum and colon Multiply asexually by binary fission 5-12 µm in diameter Amebalike, no flagella 1-2 nuclei (10-80% have 2 nuclei) Dientamoeba fragilis Life cycle Trophozoites in the cecum and the large intestine. Multiples asexually by binary fission(5-12 µm) Method of Infection Uncertain, but probably hand/mouth transfer from infective individuals or from fecally-contaminated sources Diagnostic and Infective stage. Binucleated trophozoites passed in feces

18 Dientamoeba fragilis Pathology and symptoms Asymptomatic Irritation of mucosa: mild diarrhea, anorexia, some abdominal pain Entamoeba histolytica Entamoeba histolytica è stata recentemente classificata in due specie distinte ma morfologicamente identiche: Entamoeba histolytica (Shaudinn,1903;emend.Walker,1911) Entamoeba dispar (Brumpt,1925) Reeves e Bischoff utilizzando una tecnica per la determinazione elettroforetica degli enzimi differenziarono: Forme tipiche Temperatura di crescita: C Forme atipiche Temperatura di crescita: inferiore a 30 C

19 Alla fine degli anni 70, Sargeaunt e coll. sviluppando la tecnica elettroforetica differenziarono i ceppi di E. histolytica in due gruppi zimodemici distinti Invasivo patogeno Non invasivo non patogeno Ceppi isolati da pazienti con patologia invasiva Ceppi isolati da alcuni portatori asintomatici Ceppi isolati da portatori asintomatici Tecniche di biologia molecolare (RFLP) hanno mostrato che la digestione endonucleasica di frammenti amplificati di DNA fornisce frammenti diversi in forme patogene e non patogene. La classificazione in base ai frammenti di restrizione corrisponde sia a quella clinica che a quella ottenuta con i patterns isoenzimatici: E.histolytica : patogena E.dispar: non patogena Entamoeba histolytica Ciclo Vitale Bocca Esofago Stomaco Duodeno, ileo Cieco Crasso Infezione per ingestione di cisti con cibo e acqua Excistamento nel duodeno e formazione di amebe uninucleate Installazione nel cieco della forma attiva: il trofozoite Riproduzione per scissione binaria del trofozoite Incistamento con la formazione di cisti plurinucleate con una parete che contiene una componente chitinosa Dispersione con le feci

20 Entamoeba histolytica Epidemiologia E diffusa in tutto il mondo, anche se la morbilità e la mortalità sono più alte in America centrale e meridionale in Africa e nel subcontinente asiatico Stime effettuate sulla mortalità indicano che nel mondo possano esserci dai ai decessi l anno. Rappresenta quindi la seconda causa di morte dopo la malaria Il 10% di individui infettati da E. hystolitica sviluppa sintomi clinici di amebiasi invasiva Entamoeba hystolitica Sintomatologia Decorso asintomatico Decorso sintomatico Retto colite acuta Dolori addominali accompagnati da diarrea acuta e/o cronica Colite cronica non dissenterica Ameboma Dissenteria amebica con possibile formazione di ulcere,aree di necrosi,ascessi batterici secondari e di Amebomi(ovvero formazioni pseudotumorali),perfora zioni intestinali

21 Entamoeba hystolitica Meccanismi di patogenicità Effetto delle proteinasi della cisteina prodotta dal protozoo che favoriscono la: Degradazione delle IgA di superficie Distruzione delle IgG immuni Resistenza alla lisi mediata dal complemento Ruolo delle galattosio e N-acetyl D-Galattosamina lectine che permettono Adesione del protozoo alla superficie delle cellule Produzione di peptidi litici Conseguente invasione Phylum Apicomplexa Sono protozoi parassiti, sprovvisti di ciglia, ma caratterizzati dalla presenza di un microporo e del complesso apicale necessario per la penetrazione nella cellula ospite Complesso Apicale Conoide di natura microtubulare Vescicole provviste di dotti (rhoptries) che liberano enzimi litici all apice del complesso Conoide Rhoptries

22 Phylum Apicomplexa Riproduzione Vanno incontro ad un complesso ciclo di sviluppo con alternanza di fasi riproduttive asessuate e sessuate che di solito richiedono due ospiti differenti Asessuata: per esempio Scissione binaria (Es. Endoduogenia nel Toxoplasma) Scissione multipla (Es. Schizogonia nel Plasmodium) Sessuata: per esempio Singamia : due protozoi assumono la funzione di gameti (micro- e macrogameti) zigote cisti cisti matura (con sporozoiti) Phylum Apicomplexa Ordine Eimeriida Cryptosporidium parvum Cyclospora cayetanensis Isospora belli Sarcocystis hominis Sarcocystis suihominis Sarcocystis lindemanni Toxoplasma gondii

23 Cryptosporidium parvum Nei soggetti immunocompetenti con diarrea la prevalenza è compresa tra 2,1% nei paesi industrializzati e 6,1% in quelli in via di sviluppo. In pazienti asintomatici la prevalenza varia tra 0,2 e 1,5% In pazienti HIV positivi si ha una prevalenza compresa tra il 24 e il 24% in soggetti con diarrea è tra lo 0 e il 5% in quelli senza diarrea Nei paesi sviluppati è causa importante di casi sporadici di diarrea, di epidemie nosocomiali e della diarrea del viaggiatore Cryptosporidium Vie di trasmissione L uomo può infettarsi per: Contagio interumano Contatto con bovini, cani, gatti

24 Cryptosporidium parvum Ciclo Vitale Cryptosporidium Sintomatologia Feci diarroiche con muco,sangue e leucociti Perdita di peso Dolori addominali crampiformi Nausea, vomito, anoressia,febbre non elevata La durata e la gravità dei sintomi dipendono dallo stato immunitario del paziente Immunocompetente Infezione si autolimita a 3-12 gg Paziente con AIDS La diarrea si cronicizza, la perdita di liquidi diventa imponente potendo raggiungere fino a 17 litri/die con conseguente exitus

25 Cyclospora cayetanensis Diffusione E diffusa in tutto il mondo infatti sono stati riportati casi di infezione da regioni comprendenti America, Caraibi, Europa Orientale, Sud continente Indiano, Sud Africa e Sud Est-Asiatico Distribuzione e Trasmissione Stagionale con maggiore diffusione nei mesi caldo umidi; può essere trasmessa per via idrica o tramite alimenti di origine vegetale Non vi sono animali che fungono da serbatoio di infezione, anche se organismi simili a Cyclospora sono stati osservati in anatre, galline, cani e primati Cyclospora cayetanensis Ciclo Vitale Non è ancora completamente conosciuto

26 Cyclospora cayetanensis Sintomatologia Feci viscose di colore marrone chiaro-verde con assenza di sangue remissione dei sintomi dopo alcuni giorni Attacchi diarroici Immunocompetente Immunodepressi La sintomatologia può durare fino a 15 settimane nel caso di mancato trattamento La sintomatologia può protrarsi fino a 4 mesi Cyclospora cayetanensis Patogenesi Non è ancora completamente chiarita Gli enterociti infettati rilasciano citochine che attivano e richiamano i fagociti dal torrente circolatorio I fagociti rilasciano Istamina e Prostaglandine, che aumentano la secrezione intestinale di cloro e acqua inibendo l assorbimento L aumentata secrezione e il diminuito assorbimento sono anche causate direttamente dalla distruzione degli enterociti

27 Toxoplasma gondii Protozoo dixeno del phylum Apicomplexa, classe Sporozoi, sottoclasse Coccidi Il tachizoite (forma replicativa endocellulare) ha le seguenti strutture caratteristiche: conoide, anello polare, rhoptries, un mitocondrio, un microporo Il suo ciclo si svolge tra vari ospiti intermedi e un ospite definitivo (non indispensabile) Ospiti intermedi: UOMO e molti animali a sangue caldo (bovini, suini, ovini, galline etc) CICLO ASESSUATO Ospite definitivo: GATTO CICLO ASESSUATO E SESSUATO Ciclo biologico Toxoplasma

28 Toxoplasma gondii Morfotipi nell ospite intermedio: tachizoite: assunto dai macrofagi, si moltiplica velocemente per endoduogenia, dando origine alle pseudocisti (macrofagi contenenti tachizoiti). E caratteristico della fase acuta dell infezione. cisti tissutali (contenenti bradizoiti): si forma in seguito all intervento dell immunità e altri fattori genetici. In una cisti tissutale possono essere presenti da 2 a centinaia di bradizoiti Bradizoite Elemento a moltiplicazione lenta. E caratteristico della fase latente. Toxoplasma gondii Morfotipi nell ospite definitivo (gatto) Nel gatto si attuano entrambe le fasi riproduttive: asessuata e sessuata I morfotipi presenti sono gli stessi dell ospite intermedio più quelli della fase sessuata (trofozoiti, schizonti, merozoiti, oocisti). OOCISTI Oocisti non sporulata Nelle feci appena emesse non è sporulata, quindi non infettante. In 24-48h fino a 5 gg (dipende da temperatura e aerazione) sporula e diventa infettante. Nella fase infettante si osserva una parete bistratificata e contenente 2 sporocisti a parete monostratificata con 4 sporozoiti ciascuna. Oocisti nelle feci del gatto Oocisti matura

29 Phylum Apicomplexa Ordine Haemosporidida Plasmodium MALARIA Agenti Plasmodium vivax ovale malariae falciparum P. falciparum: forme ring Vettore: Anopheles spp.

30 Malaria Life Cycle Oocyst Sporozoites Zygote Mosquito Salivary Gland Gametocytes Liver stage Red Blood Cell Cycle Epidemiologia Modalità di trasmissione Nelle zone endemiche Femmina del genere Anopheles Trasfusioni Arrivate con un aereo (malaria da aeroporto) Aghi infetti Via transplacentare

31 Principali manifestazioni patologiche Sintomi simil-influenzali (in particolare: febbre) Anemia emolitica, splenomegalia, glomerulonefrite Complicazioni della malaria da P.falcipaum malaria cerebrale, con o senza convulsioni emorragia della retina disfunzioni renali emoglobinuria ipoglicemia edema polmonare collasso circolatorio Phylum Microspora Sono protozoi intracellulari obbligati, parassiti di vertebrati ed invertebrati Sono considerati eucarioti primitivi in quanto mancano di alcuni organelli presenti invece nei protozoi più evoluti Studi recenti sul DNA hanno dimostrato che sono filogeneticamente vicini ai funghi

32 Microsporidi Enterocytozoon bieneusi Encephalitozoon intestinalis Microsporidi Enterocytozoon bieneusi - Encephalitozoon intestinalis Bocca Esofago Stomaco Duodeno, ileo Cieco Crasso Spora matura Infezione per ingestione di spore con cibo e acqua Replicazione endocellulare Distribuzione Trasmissione Ubiquitaria Acqua e alimenti Via inalatoria

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35 Microsporidi Epidemiologia Distribuzione Ubiquitaria Trasmissione Acqua e alimenti Via inalatoria Sintomatologia Immunocompetente Enterite autolimitante Immunodepressi Forme diarroiche persistenti e debilitanti Febbre e vomito, malassorbimento e disseminazione in diversi organi Phylum Ciliophora Ordine Trichostomatida Sono protozoi provvisti di un numero imprecisato di ciglia (più corte, più sottili, orientate in fila) Balantidium coli Possiedono un micronucleo (funzione riproduttiva) e un macronucleo (funzione trofica). La riproduzione avviene per divisione binaria trasversale Si verifica un processo sessuato di coniugazione

36 Balantidium coli Epidemiologia Distribuzione e Trasmissione Ha una distribuzione cosmopolita. Si trova prevalentemente nel cieco di suini. La trasmissione avviene per ingestione di cisti.nell intestino umano raramente formano cisti, poiché vengono espulse con le feci come trofozoiti che sopravvivono nell ambiente esterno per qualche ora. Sintomatologia Può provocare dissenterie, talvolta letali Immunodepressi Raramente colonizza altri organi (polmoni) Trofozoiti 60x40 µm ciglia citostoma grosso macronucleo reniforme micronucleo piccolo Balantidium coli Cisti µm macronucleo micronucleo vacuolo parete cellulare

37 Balantidium coli Ciclo vitale Trofozoiti in large intestine. Multiply asexually by binary fission (60x40 µm) Cisti passes to small intestine; excystation occurs Diagnostic and Infective stage resistant, infective cysts passed in feces. trofozoiti may be more commonly found in soft or fluid feces Method of Infection humans ingest infective cysts; trasmitted by feces, fingers, food, fomites and flies