CORSO DI LAUREA IN BIOLOGIA GENERALE E APPLICATA Anno Accademico 2006/2007. Corso di: Laboratorio di Biologia II Chimica Biologica

Transcript

1 CORSO DI LAUREA IN BIOLOGIA GENERALE E APPLICATA Anno Accademico 2006/2007 Corso di: Laboratorio di Biologia II Chimica Biologica Dott. Marcello MEROLA Parziale purificazione dell enzima Alcool Deidrogenasi (ADH) di Bacillus stearothermophilus da estratto batterico mediante cromatografia a scambio ionico - Cromatografia a scambio ionico - Elettroforesi su gel di acrilammide in condizioni denaturanti - Saggio di attività enzimatica - Determinazione della concentrazione proteica di un campione di proteina purificata (spettrofotometrica) e di miscele proteiche (colorimetrica) - Calcolo dell Attività Specifica 1

2 CROMATOGRAFIA A SCAMBIO IONICO La resina DEAE-Sepharose è costituita di una matrice di agarosio a cui è covalentemente legato il gruppo dietilamminoetile [-CH 2 -CH 2 -N + H-(CH 2 -CH 3 ) 2, pk~ 8.5] ed è equilibrata in tampone sodio-fosfato 50 mm, ph 7. Il campione da cromatografare, solubilizzato nello stesso tampone, è rappresentato da un estratto di E.Coli indotto per l espressione dell ADH da Bacillus stearothermophilus. L alcool deidrogenasi di Bacillus stearothermophilus (ADH) nativa ha un peso molecolare di 140 kda ed un punto isoelettrico pari a 5. La cromatografia verrà sviluppata al flusso di 0.8 ml/min utilizzando una pompa peristaltica; l eluato verrà raccolto in frazioni di 3.2 ml di volume mediante un collettore automatico. 2

3 METODICA dopo avere rimosso il tampone presente sulla resina, caricare 1 ml di estratto di E.Coli; lavare la resina con 10 ml di tampone sodio-fosfato 50 mm, ph 7; eluire con un gradiente salino di NaCl da 0 M a 0.4 M in tampone sodio-fosfato 50 mm, ph 7 (30 ml di tampone sodio-fosfato 50 mm, ph 7, e 30 ml di tampone sodio-fosfato 50 mm, ph 7, NaCl 0.4 M); eluire con 30 ml di tampone sodio-fosfato 50 mm, ph 7, NaCl 0.5 M; leggere i valori di assorbanza a 280 nm delle singole frazioni eluite dalla colonna e riportare in grafico i dati ottenuti. Frazioni A 280 nm Frazioni A 280 nm

4 Separazione elettroforetica di proteine su gel di poliacrilammide in SDS L elettroforesi si basa sulla proprietà di una molecola dotata di carica netta di muoversi in un campo elettrico µ=q/f µ è la mobilità elettroforetica, q è la carica dello ione, f è il coefficiente frizionale che dipende dalla grandezza, dalla forma e dallo stato di solvatazione dello ione e dalla viscosità della soluzione. In Biochimica, le tecniche elettroforetiche di gran lunga più utilizzate si servono di una matrice di supporto porosa che agisce come un setaccio molecolare. Tale matrice ritarda o ostruisce il movimento delle molecole in misura proporzionale alla grandezza delle molecole stesse. A seconda della grandezza delle molecole da analizzare è possibile variare la grandezza dei pori della matrice così che nessuna specie sia impedita nella migrazione ma ciascuna ritardata in misura proporzionale alla sua dimensione. In tal modo si ottiene una separazione delle differenti specie presenti in un campione. 4

5 L elettroforesi in condizioni denaturanti prevede il trattamento con un detergente ad alte temperature per distruggere la struttura terziaria, e quaternaria in assenza di ponti disulfuro intercatena, delle proteine. Quando il detergente è l SDS (Sodio Deodecil Solfato, CH 3 (CH 2 ) 10 CH 2 -O-SO - 3 ), le proteine vengono interamente ricoperte da questo e le loro cariche mascherate dalla coda idrofobica dell SDS. I complessi SDS-proteina assumeranno carica netta negativa (dovuta alla ionizzazione del solfato) e migrano verso l anodo sotto l azione di un campo elettrico. Per le proprietà di setaccio molecolare del gel, le proteine a minor peso molecolare si muovono più velocemente mentre quelle a maggior peso molecolare migrano più lentamente. L elettroforesi in condizioni denaturanti e riducenti prevede un ultriore trattamento con un agente riducente (2-Mercaptoetanolo, HS-CH 2 - CH 2 -OH) i ponti disolfuro tra residui di Cisteina. Le proteine dopo separazione possono essere visualizzate mediante l uso di un colorante specifico (Coomassie Blue) che forma un complesso colorato in blu. Dopo trattamento del gel con la soluzione di Coomassie, si evidenzieranno una serie di bande corrispondenti al numero di proteine presenti nel campione la cui distanza dall origine di migrazione è funzione del peso molecolare di ciascuna proteina. La slab-gel-elettroforesi (strati di gel di 1 mm di spessore e di dimensioni 7 x 5 cm) è rapida ( 1 hr), sensibile (meno di 1μg di proteina) e permette di distinguere proteine che differiscono di circa il 2% in massa (es kda). Sistema Elettroforetico. gel di poliacrilammide al 10% (lower), al 4% (upper); tampone di corsa tampone Tris-glicina ph 8.3; soluzione denaturante per campioni: Tris-HCl 0.5 M ph 6.8, SDS 4%, glicerolo 10%, Blu di Bromofenolo 1%. soluzione denaturante e riducente per campioni: Tris.HCl 0.5 M ph 6,8, SDS 4%, glicerolo 10%, 2-mercaptoetanolo 1%, Blu di Bromofenolo 1%. soluzione colorazione gel: Preparato contenente Blu di Coomassie. soluzione per la decolorazione del gel: H 2 O distillata. 5

6 campioni: 1. Estratto di E.Coli 2. Estratto di E.Coli indotto per la produzione di ADH 3. ADH (eluita da DEAE-Sepharose) in condizioni denaturanti 4. ADH purificata in condizioni denaturanti 5. ADH purificata in condizioni denaturanti e riducenti 6. Miscela di proteine di peso molecolare noto: Miosina 220 kda BSA 100 kda GDH 60 kda LDH 45 kda Anidrasi carbonica 30 kda Inibitore tripsina 20 kda Lisozima 12 kda Aprotinina 8 kda Dopo aver sistemato la lastrine contenenti il gel nell apposito apparecchio ed aver riempito le apposite vaschette con il tampone di corsa, i campioni vengono stratificati nei diversi pozzetti, utilizzando il pipettatore automatico. Collegati gli elettrodi all alimentatore di corrente (200 V), si fa avvenire la corsa elettroforetica sino a quando il tracciante (Blu di Bromofenolo) raggiunge l estremità del gel. Ad elettroforesi terminata, smontato l apparecchio il gel viene liberato dalle lastrine e immerso nella soluzione di colorante per circa 20 minuti e poi nella soluzione di decolorante. Calcolare la migrazione elettroforetica (cm) dei marcatori di peso molecolare e allestire la retta mettendo in grafico il logaritmo del peso molecolare (ordinate) in funzione della migrazione (ascisse); calcolare il peso molecolare dell ADH in condizioni denaturanti (campione 4) e in condizioni denaturanti e riducenti (campione 5). Considerando che il peso molecolare dell ADH è di 140 kda, valutare se l ADH è una proteina dotate di struttura quaternaria stabilizzata anche da ponti disolfuro intercatena. 6

7 COLORIMETRIA E SPETTROFOTOMETRIA Dosaggio dell attività enzimatica della alcool Deidrogenasi (ADH) L ADH catalizza l ossidazione di alcooli primari in presenza del coenzima NAD +, ad un ph optimum di 8.0. ADH CH 3 -CH 2 -OH + NAD + O=CH-CH 3 + NADH +H + La quantità di NADH che si forma durante la reazione è calcolabile per via spettrofotometrica e permette la misura esatta della quantità di enzima presente nel campione (metodica indiretta). Ciò è possibile perché nello spettro di assorbimento del NADH appare un picco a 340 nm assente nel NAD+, dal cui valore è ricavabile la quantità di prodotto che si forma ai tempi iniziali della reazione. NAD Assorbanza NADH lunghezza d'onda (nm) La formazione del prodotto si misura ai tempi iniziali della reazione sia perché la velocità di una reazione è funzione della concentrazione di substrato sia perché la formazione dei prodotti promuove anche la reazione inversa (la riduzione dell aldeide con conseguente consumo di NADH). La variazione di assorbanza a 340 nm (variazione del rapporto forma ossidata e ridotta NAD + /NADH) per unità di tempo è misura dell attività enzimatica (vedi punto 5 pagina successiva) ed è, in generale, una reazione indicatrice molto usata in spettrofotometria per applicazioni cliniche. 7

8 Procedura per il saggio di attività dell alcool deidrogenasi (ADH): Miscela di reazione: 2 mm NAD +, 20 mm Etanolo in tampone sodio-fosfato M, ph 8.0. Mescolare 5 ml di tampone Sodio Fosfato 0.1 M ph 8.0, 4 ml di etanolo 0.1 M, 0.8 ml di NAD + 50 mm e portare a 20 ml con H 2 O; Allestire i saggi di attività utilizzando 1 ml di miscela di reazione in una cuvetta. Dopo aver azzerato l apparecchio a 340nm contro questa miscela, registrare l incremento di assorbanza a 340 nm in 30 secondi dopo aggiunta di 4 μl di estratto di E.Coli. Ripetere la procedura per le frazioni di eluato da analizzare (cioè quelle corrispondenti ad un picco di assorbanza a 280nm) utilizzandone 50 μl per ognuna di esse. É possibile determinare la concentrazione di una sostanza pura direttamente dal assorbanza (A) misurata grazie alla legge di Lambert-Beer: A = є c l dove l =1 (lunghezza del cammino ottico generalmente di 1 cm) c è la concentrazione della sostanza ed є è il coefficiente di estinzione mg/ml ecc.). espresso in unità di concentrazione (moli/litro, Per il N ADH il valore di є M (Coefficiente di Estinzione molare, moli/litro) è di O.D.* a 340 nm. Altrimenti detto, una soluzione che legge 6,2 OD a 340 nm ha una concentrazioen di 1mM, una che legge 0,062 OD 340 = 10 μm e così via. (*OD Optical Densities = Unità di misura dell Assorbanza). Calcolare le µmoli di NADH formate in 1 ml di miscela di reazione (da cui ricavare le Unità Enzimatiche). Questo valore si ottiene dividendo l incremento di assorbanza per minuto (ΔA/min) per il coefficiente di estinzione millimolare (mmoli/litro = µmoli/ml) dell NADH (є mm a 340 nm = 6. 2). 8

9 Definizione di Unità enzimatica: Una unità enzimatica è la quantità di enzima che converte in prodotto una µmole di substrato per minuto a 65 C nelle condizioni ottimali per il saggio Calcolare le unità di attività enzimatica contenute nel volume dei campioni usato per il saggio di attività. Infine calcolare le unità di attività enzimatica per millilitro (U.E./ml) di ogni campione saggiato, tenendo conto di quanti µl di ciascun campione (estratto e frazioni della colonna) sono stati utilizzati per il saggio. Esempio: ΔA/min = 0.4 OD incremento per minuto (0.2 in 30 sec) registrato utilizzando 100 μl di un campione di enzima 0.4/6.2 = 0,064 mm, ossia 0,064 μmoli/ml di NADH prodotto 0,064 μmoli/minuto = 0,064 Unità in 100 μl 0, 64 Unità/ml di ADH 9

10 Determinazione della concentrazione proteica Dosaggio della Albumina Serica Bovina (BSA) purificata: metodo diretto 1 Misurare l assorbanza della soluzione di BSA a 280 nm 2 Utilizzando la legge di Lambert-Beer (A= ε C l) calcolare la concentrazione (C) in base al coefficiente di estinzione della BSA espresso in mg/ml BSA: ε mg/ml a 280 nm = 0.67 OD 3 Una volta conosciuta la concentrazione della propria soluzione di BSA, calcolare a quanti μl equivalgono 2,5, 5, 7,5 e 10 μg di BSA Dosaggio della concentrazione proteica in una miscela: metodo indiretto Quando la soluzione è una miscela di proteine diverse, non è possibile applicare la spettrofotometria diretta per determinarne la concentrazione. Le varie specie proteiche avranno, infatti, ciascuna coefficienti di estinzione diversi. In questo caso si procede per via indiretta tramite metodo colorimetrico descritto in seguito. In questa procedura, la BSA rappresenta la proteina di riferimento in quanto è stato possibile determinarne la concentrazione esatta per via spettrofotometrica. Tale proteina è la Albumica Serica Bovina (BSA) Reazione Colorimetrica di Bradford In soluzione acida, il colorante triarilmetano (Coomassie Blu) si lega alle proteine sviluppando una colorazione blu. L intensità della colorazione, determinata a 595 nm, è direttamente proporzionale (in un definito intervallo) alla concentrazione proteica. La retta di taratura del saggio si costruisce facendo reagire il reattivo di Bradford (Coomassie Blu in soluzione acida) con quantità crescenti (2,5-5 7,5-10 μg) di una soluzione di BSA a concentrazione nota.. Mescolare 800 μl di soluzione contenente proteine (vedere schema) con 200 μl del reattivo di Bradford. Mescolare e leggere l assorbanza della soluzione a 595 nm 10

11 Tubo Campione H 2 O Reattivo OD 595nm μg 1 Bianco 800 μl 200 μl BSA 2.5 μg = μl μl 200 μl 2,5 3 BSA 5 μg = μl μl 200 μl 5,0 4 BSA 7,5 μg = μl μl 200 μl 7,5 5 BSA 10 μg = μl μl 200 μl 10,0 6 Estratto 2,5 μl 797,5 μl 200 μl 7 Estratto 8 μl 792 μl 200 μl 8 Frazione n 20 μl 780 μl 200 μl 9 Frazione n 100 μl 700 μl 200 μl Sottrarre a ogni lettura (tubi 2-8) l assorbanza del bianco; costruire la retta di taratura ponendo in grafico i valori di assorbanza (ordinate) registrati contro i relativi μg di BSA (ascisse); determinare la quantità di proteine presenti nell estratto di E.Coli (tubi 5-6), calcolando sulla retta di taratura a quanti μg di proteina corrispondono le letture ottenute: 2,5 μl estratto =. μg 8 μl estratto =.μg quindi determinare la concentrazione proteica in mg/ml facendo una media aritmetica dei due valori ottenuti determinare la quantità di proteine presenti in 20 e 100 μl della frazione attiva della colonna, calcolando sulla retta di taratura a quanti μg di proteina corrispondono le letture ottenute: 20 μl frazione n =. μg 100 μl frazione n. =. μg quindi determinare la concentrazione proteica in mg/ml facendo una media aritmetica dei due valori ottenuti. 11

12 Calcolo dell Attività specifica L attività specifica (A.S.) si definisce come il numero di unità enzimatiche (U.E.) per ml normalizzato per la concentrazione proteica sempre espressa in mg per ml di soluzione. Essa è il reale indice di efficienza durante il procedimento di purificazione di un enzima. A.S. = U.E./ml mg/ml (proteine) Si può quindi riempire la tabella di purificazione in basso e verificare se si è effettivamente proceduto ad una purificazione dell enzima ADH. Unità ADH/ml Proteine mg/ml ATTIVITA SPECIFICA Resa ESTRATTO FRAZIONE n 12