RB CALCOLO DELLE DISTANZE DI MAPPA. In assenza di linkage i fenotipi dovrebbero avere uguale frequenza

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1 CALCOLO DELLE DISTANZE DI MAPPA Gameti Numero progenie BCY 55 BCy 108 Bc h Y 276 Bc h y 7 bcy 16 bcy 275 bc h Y 125 In assenza di linkage i fenotipi dovrebbero avere uguale frequenza Ovviamente in questo caso la condizione di no-linkage non viene rispettata Si tratta quindi di determinare quali siano le combinazioni parentali (se non note) bc h y 46 In assenza di informazioni si può ipotizzare che le combinazioni più frequenti siano appunto quelle parentali Si dovrà poi identificare quali siano i gameti prodotti da una doppia ricombinazione

2 CALCOLO DELLE DISTANZE DI MAPPA Gameti Numero progenie BCY 55 BCy 108 Bc h Y 276 Bc h y 7 bcy 16 bcy 275 bc h Y 125 bc h y 46 Le due forme evidenziate potrebbero essere appunto dei doppi crossing Mettendo insieme questa informazione con la conoscenza dei genotipi parentali si può ipotizzare l ordine dei loci sul cromosoma

3 CALCOLO DELLE DISTANZE DI MAPPA Vediamo un esempio: A b C a B c NO CROSSING A b C a B c A b C x a B c SINGLE CROSSING A B c a b C A b C x a B c SINGLE CROSSING A b c a B C

4 CALCOLO DELLE DISTANZE DI MAPPA A b C x x a B c DOUBLE CROSSING A B C a b c Il locus centrale si ricombina con gli altri due I nostri dati reali mostrano che le combinazioni parentali Bc h Y bcy diventano Bc h y bcy I loci che rimangono insieme sono quindi Bc h bc E quindi il locus intermedio è Y/y Ordine corretto degli alleli sui cromosomi parentali: BYc h byc

5 CALCOLO DELLE DISTANZE DI MAPPA Va ora calcolata la distanza tra loci Si computerà la distanza tra B e Y e quella tra Y e C Si usa il numero di ricombinanti tra loci Le combinazioni parentali per B e Y sono BY e by quindi By e by sono ricombinanti e vanno considerati n. = = 256 (256 / 908) * 100 = 28,19 % La distanza stimata tra questi loci è quindi 28,19 unità di mappa

6 CALCOLO DELLE DISTANZE DI MAPPA Similarmente Per il secondo gruppo di loci Yc h e yc avremo: n. = = 124 (124 / 908) * 100 = 13,66 % La distanza stimata tra questi loci è quindi 13,66 unità di mappa La mappa appare come: 28,19 13,66 B Y c h

7 CALCOLO DELLE DISTANZE DI MAPPA Se si esclude il locus Y il calcolo della distanza tra B e C si può basare su Bc h e bc Avremo in questo caso: n. = = 334 (334 / 908) * 100 = 36,78 % Che non è uguale alla somma di 28, ,66 = 41,85 La discrepanza è dovuta ai doppi crossing over di cui non si è tenuto conto Il calcolo deve quindi comprendere i 23 doppi ricombinanti per due volte dato che la distanza di mappa è basata sul numero di eventi di ricombinazione n. = (16+7) = 380

8 CALCOLO DELLE DISTANZE DI MAPPA (380 / 908) * 100 = 41,85 % Che è uguale alla somma di 28, ,66 = 41, = single crossing tra b e y 101 = single crossing tra y e c 23 = double crossing combinazioni parentali BYc h byc Gameti Numero progenie BYC 55 ByC 108 BYc h 276 Byc h 7 byc 16 byc 275 byc h 125 byc h 46 Se due loci sono più distanti di 50 unità di mappa (50% di ricombinazione) la probabilità di crossing over è così elevata che i geni ai due loci sono sostanzialmente unlinked e quindi segregano indipendentemente

9 Ricapitoliamo. Il calcolo delle distanze è fondamentale per posizionare i nostri marcatori sul genoma!!! Gli esperimenti come quello visto prima non sempre sono realizzabili La possibilità di avere dei CROSSING OVER non visti sussiste sempre

10 Due geni che mappano sullo stesso cromosoma si dicono SINTENICI Due geni sintenici segregherebbero sempre assieme se non esistesse il crossing-over nella prima divisione meiotica L evento di crossing-over da luogo alla formazione di gameti RICOMBINANTI

11 Il crossing-over separerà raramente loci che si trovano molto vicini sullo stesso cromosoma, in quanto un solo evento di crossing-over localizzato esattamente nel piccolo spazio tra i due loci creerà dei ricombinanti Più due loci sono distanti, più e probabile che un evento di crossing-over li separi Si definisce un valore detto frazione di ricombinazione, misura della distanza di due loci

12 Determinare la frequenza con cui due loci ricombinano fra loro alla meiosi = TETHA ( se due loci sono su cromosomi diversi segregano indipendentemente. La probabilità che vengano ereditati insieme è del 1/2 = 50% Se due loci sono vicini fra loro sullo stesso cromosoma saranno ereditati insieme più frequentemente < 50% Tanto più sono vicini, tanto più piccola è la probabilità che avvenga un crossing-over LA FREQUENZA DI RICOMBINAZIONE () E UNA MISURA DELLA DISTANZA GENETICA

13 LE COSE SONO UN PO PIU COMPLICATE. Dopo una certa distanza fisica la frazione di ricombinazione non rispecchia più la distanza genetica per l esistenza di doppi crossing-over Loci che distano su una mappa 40 cm hanno una ricombinazione molto inferiore al 40%, in quanto la frazione di ricombinazione non supera mai lo 0,5 La frazione di ricombinazione sarà uguale a 0,5 non solo per loci non sintenici, ma anche per loci sintenici molto distanti fra loro

14 Studiando quindi le meiosi o comunque le ricombinazioni avvenute è necessario tener conto di questi eventi non visibili LE FUNZIONI DI MAPPA definiscono le relazioni tra funzione di ricombinazione e distanza genetica

15 DISTANZA TRA GENI O LOCI Abbiamo visto che la distanza tra geni si definisce: DISTANZA DI MAPPA (d) d è funzione della frequenza di ricombinazione La relazione che lega queste due quantità è detta funzione di mappa La più semplice funzione di mappa è d= Questa funzione assume una completa interferenza ( = 1) Se si verifica un crossing-over in un cromosoma questo evento interferisce totalmente con la possibilità che se ne verifichi un altro

16 DISTANZA TRA GENI O LOCI In realtà sono possibili più crossing over sullo stesso cromosoma dobbiamo utilizzare una funzione di mappa più complessa dobbiamo considerare come la probabilità che in un dato intervallo si verifichi un numero dispari di crossing-over (se infatti ne avviene un numero pari non osserveremo alcuna ricombinazione) di conseguenza (1 ) è la probabilità che si verifichi un numero pari (zero incluso) di crossing over

17 Esempio: AB = 0,20 BC = 0,15 A B C Supponiamo di tipizzare un individuo ABC/abc: Aplotipi trasmissibili Aplotipi visibili tipizzando solo i loci A e C ABC e abc AC e ac Parentali ABc e abc Ac e ac Ricombinanti Abc e abc Ac e ac Ricombinanti AbC e abc AC e ac Parentali In realtà i parentali nascondono insieme ai veri parentali anche i doppi ricombinanti (AbC e abc)

18 1 AC 1 AB 1 BC AB BC La prob. che non si verifichi nessun crossing over (o un numero pari) tra A e C è uguale alla probabilità che non si verifichi alcun crossing over (o un numero pari di questi) tra A e B e tra B e C simultaneamente. A questa probabilità va aggiunta quella che si verifichi simultaneamente un crossing over (o un numero dispari di questi) tra A e B e tra B e C. Dalla formula precedente e riassumendo: AC AB BC 2AB BC

19 DISTANZA TRA GENI O LOCI AC AB BC 2AB BC La formula implica che la probabilità di un doppio crossing over dipenda dal semplice prodotto della probabilità degli eventi, considerati quindi indipendenti. Si assume quindi una totale mancanza di interferenza = 0 Generalizzando: AC AB BC 2 1 AB BC Nell esempio precedente assumendo = 0 avremo: AC = 0,20 + 0,15 2(0,20*0,15) = 0,29 a differenza di AC = 0,35 assumendo = 1 Con valori di piccoli (inferiori a 0,1) l assunto di una completa interferenza può non essere molto lontano dalla realtà e la funzione di mappa d = è ragionevolmente precisa.

20 Sull assunto dell interferenza nulla è costruita la funzione di mappa di Haldane Haldane ha dimostrato che seguendo la distribuzione di Poisson si ottiene: d e da cui d 1 ln Idealmente come abbiamo ricordato la distanza di mappa dovrebbe essere additiva (A-B)+(B-C)=(A-C) Nell esempio: AB = 0,20 d = 0, BC = 0,15 d = 0, AC = 0,29 d = 0,433750

21 DISTANZA TRA GENI O LOCI Poisson adatta eventi rari in spazi o tempi grandi Nel nostro caso il numero dei punti dove può avvenire un crossing over è molto grande 100 cm = n (dimensione del campione) La probabilità che avvenga nell intervallo di 1 cm è molto piccola = 0,01 = 1% La media della distribuzione è = np = n = 100 * 0,01 = 1 Ossia 1 crossing over in 100 cm In un intervallo di 1 cm esaminando molte meiosi, avremo eventi diversi con probabilità descritte da: P(x) = x * e - / x! costante

22 P(x) = x * e - / x! Evento x e - x! 1 Totale (n di X over) P(x pari) P(x dispari) 0 0, , , , , , , , , , , , , , , ,3E , ,1E , ,0E , ,0E-07 Totale 0,5677 0,4323 1

23 Distanza di mappa (numero atteso di crossing over) RB Relazione tra theta e distanza di mappa 2,50 2,00 Haldane 1,50 1,00 0,50 Morgan 0,00 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0,45 0,5 Frequenza di ricombinazione (theta) 0,43 Sommando tutte le meiosi in cui è avvenuto un numero dispari di crossing over (ossia quelle che ci fanno vedere l avvenuta ricombinazione) ne conteremo circa il 43% Quindi quando = 0,43 d = 1 (Morgan)

24 DISTANZA TRA GENI O LOCI N.B. la distanza di 1 cm corrisponde ad un numero di paia di basi molto variabile da specie a specie (da 10 kb a 1000 kb). Anche tra i sessi le distanze variano molto: mammiferi femmine maggiore distanza di mappa Vi sono altre funzioni di mappa tra cui quella di Kosambi che assumono valori di interferenza compresi tra 0 e 1 Kosambi suppone quindi che i crossing over non siano infiniti cm 1 4 ln cM e 4cM 2 e Sotto i 10 cm qualunque formula fornisce il risultato corretto 1 1

25 DISTANZA TRA GENI O LOCI Qual è la probabilità che un marcatore sia vicino ad un gene di interesse? d = distanza da un marcatore L = lunghezza del genoma P vicino P non vicino 1 marcatore p= 2d/L p=(1 2d/L) m marcatori p=(1 2d/L) m Quindi la probabilità che sia vicino ad almeno 1 marcatore è: p 1 1 2d L m

26 DISTANZA TRA GENI O LOCI Lunghezza del genoma mammiferi ~ 3000 cm ESERCIZIO L = 3000 m = 50 d = 20 p =?? Ragionando al contrario 0,488 m ln 1 p 2d ln 1 L Volendo una probabilità del 95% con i dati di prima ci vogliono ~ 223 marcatori Se vogliamo d = 5 con p = 0,95 ci vorranno ~ 900 marcatori