Corso di Laurea in Farmacia Insegnamento di BIOCHIMICA. Angela Chambery Lezione 20

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1 Corso di Laurea in Farmacia Insegnamento di BIOCHIMICA Angela Chambery Lezione 20

2 Geni e cromosomi Concetti chiave: Il DNA superavvolto può essere descritto in termini di numero di legami, avvolgimenti e numero di contorsioni. Le topoisomerasiscindono uno (tipo I) o entrambi (tipo II) i filamenti di DNA per aggiungere o rimuovere superavvolgimenti. Il DNA eucarioticoèsuperavvolto negativamente attorno a un nucleo centrale di proteine istoniche per formare un nucleosoma. I nucleosomi sono avvolti in strutture cromatiniche maggiormente ordinate.

3 Batteriofago T2 e cellula di E. coli circondati dal loro DNA Il DNA è stato liberato lisando il batteriofago (a sinistra) ed E. coli (a destra) liberando il loro DNA. Normalmente il DNA è impaccato nella testa del fago ed all interno delle cellule.

4 Lunghezza del cromosoma di E.coli(1,7 mm) paragonata alla lunghezza di una tipica cellula di E. coli(2µm) Le molecole di DNA sono molto piùlunghe delle cellule che le contengono

5 Lunghezza del DNA genomico umano La lunghezza complessiva del DNA genomico di una cellula umana è circa 2 m. Un corpo umano adulto contiene circa cellule, e quindi la lunghezza totale del DNA corrisponde a circa 2 x km. Circonferenza della terra=4 x 10 4 km Distanza tra la Terra e il Sole = 1,5 x 10 8 km Il DNA cellulare è fortemente compattato per trovare spazio all interno della cellula.

6 Superavvolgimento del DNA Superavvolgimentosignifica letteralmente avvolgimento di qualcosa che ègiàavvolto. Il cordone del telefono è un tipico filo avvolto la cui torsione determina un superavvolgimento.

7 Superavvolgimento del DNA Il DNA è avvolto in forma di una doppia elica nella quale entrambe le catene avvolte ruotano intorno ad un asse. Un ulteriore ripiegamento o una torsione di tale asse su se stesso determinano una nuova elica (superelica). Il DNA a superelica di solito èchiamato superavvolto. Se non vi è alcun ripiegamento dell asse del DNA su se stesso, si dice che il DNA è in uno stato rilassato. La compattazione del DNA comporta un superavvolgimento così come la replicazione o la trascrizionedel DNA, che richiedono una temporanea separazione delle eliche.

8 Superavvolgimento del DNA In una molecola circolare chiusa che corrisponde perfettamente alla struttura B del DNA (10,5 coppie di basi per giro d elica) il DNA sarà rilassato. Il superavvolgimento avviene quando il DNA è sottoposto a una sorta di deformazione strutturale. I DNA circolari chiusi raramente sono rilassati e il grado di superavvolgimento è ben definito e caratteristico di ogni DNA derivato da un determinato tipo cellulare. Il grado di deformazione è regolato dalla cellula. In quasi tutti i casi la deformazione è il risultato di un disavvolgimento. Il DNA presenta cioèun numero di giri di elica minore di quanto ci si attenderebbe per la struttura B.

9 Superavvolgimento del DNA Il disavvolgimentodel DNA in vivorende piùfacile separare le catene fra loro dando facile accesso all informazione contenuta al loro interno. Lo stato parzialmente disavvolto può essere mantenuto solo se il DNA èin forma circolare chiusa o se èstabilizzato da interazioni con proteine in modo tale che le catene non siano libere di ruotare su se stesse. Se si verifica un interruzione in una delle due catene di un DNA circolare parzialmente disavvolto, in quel punto la rotazione libera provocherà un ritorno spontaneo allo stato rilassato.

10 Superavvolgimento del DNA Il Segmento di DNA di 84 bp nella sua forma rilassata con 8 giri d elica (10,5 coppie di basi per giro), all interno di una molecola circolare chiusa. Deformazione conseguente alla rimozione di un giro d elica. Vi saranno 12 coppie di basi per giro (84/7), e la molecola è termodinamicamente svantaggiata. La deformazione potrebbe essere riequilibrata tramite l avvolgimento dell asse del DNA su se stesso a formare un superavvolgimento oppure tramite la parziale separazione delle due catene a una distanza di circa 10 bp. La deformazione provocata dal disavvolgimento è generalmente risolta dal superavvolgimento piuttosto che dalla separazione delle catene, perché l avvolgimento dell asse del DNA richiede meno energia della rottura dei legami idrogeno che tengono unite le due catene.

11 Superavvolgimento del DNA DNA a doppia elica in forma B, costituito da 260 coppie di basi.poichéil numero di residui nucleotidici per giro dell elica in una molecola di DNA non sottoposta a tensione èdi 10,5, questa molecola di DNA lineare presenta 25 giri. Se si uniscono le estremità di questa molecola si ottiene una molecola circolare rilassata.

12 Superavvolgimento del DNA Se si srotola la doppia elica lineare di due giri prima di riunire le estremità.....si ottiene un DNA circolare con due possibili conformazioni alternative: Il DNA può ripiegarsi in una struttura contenente 23 giri di elica B e un anello srotolato, oppure può adottare una struttura superavvolta con 25 giri di elica B e due giri di superavvolgimento destrorso(superelica negativa).

13 Superavvolgimento del DNA Una molecola di DNA superavvolto èpiùcompattadi una molecola di DNA rilassato con la stessa lunghezza. Una molecola di DNA superavvolto si muove più rapidamente del DNA rilassato e del DNA lineare quando è sottoposta a centrifugazione oppure a elettroforesi.

14 Superavvolgimento del DNA La nostra comprensione della conformazione del DNA èfacilitata da concetti derivati dalla topologia, una branca della matematica che si occupa delle proprietà strutturali che non variano anche in presenza di deformazioni come lo stiramento e la curvatura. Una proprietà topologica fondamentale di una molecola di DNA circolare è il suo numero di legame(linking number, Lk). Se due catene sono legate come in (a) esse sono effettivamente unite da ciò che può essere definito un legame topologico. Anche se le catene sono separate per rottura di tutte le interazioni che le tengono insieme, tale legame topologico le manterrebbe ancora unite.

15 Superavvolgimento del DNA Se si considera una delle catene circolari come la delimitazione di una superficie immaginaria, il numero di legame èdefinito come il numero di volte che la seconda catena buca questa superficie. Lk negativo per eliche avvolte in senso levogiro Lk positivo per eliche avvolte in senso destrogiro Il numero di legame corrisponde anche al numero di volte in cui una catena di DNA si avvolge in direzione destrorsa intorno all asse dell elica, quando l asse èvincolato a giacere su un piano.

16 Il concetto di numero di legame applicato a molecole di DNA circolare chiuso Per una molecola di DNA circolare chiusa in stato rilassato, Lk è il numero di basi diviso per il numero di coppie di basi per giro (10,5). Perché una molecola di DNA circolare abbia una proprietà topologica come il numero di legame, è necessario che nessuna delle due catene presenti interruzioni. Se una delle catene è rotta, è possibile in linea di principio disavvolgere le eliche e separarle completamente (Lk è indefinito). Se, prima della chiusura, una doppia elica è srotolata, è possibile descrivere il disavvolgimento parziale del DNA in termini di cambiamento del numero di legame ( Lk)

17 Superavvolgimento positivo e negativo Il superavvolgimento causato dal parziale disavvolgimento è detto superavvolgimento negativo. Quando il DNA è iperavvolto, il superavvolgimento che ne risulta è detto positivo. Due forme di DNA circolare che differiscono solo per il numero di legame sono detti topoisomeri. I topoisomeri del DNA possono trasformarsi l uno nell altro solo tagliando una o entrambe le catene del DNA e poi ricongiungendole tra loro.

18 Torsione e avvolgimento Il numero di legame può essere scomposto in due componenti strutturali: avvolgimento (writhe, Wr) e torsione(twist, Tw) Lk= Tw+ Wr La torsione definisce un ripiegamento locale e può essere definita come una misura dell arrotolamento a elica dei filamenti del DNA l uno attorno all altro. L avvolgimento rappresenta una misura dei giri dell asse della doppia elica, o superavvolgimento.

19 Equivalenza topologica Modificazioni topologiche del numero di legame sono solitamente accompagnate da cambiamenti geometrici sia di avvolgimento sia di torsione.

20 DNA cruciforme Il parziale disavvolgimento del DNA può indurre la formazione di strutture cruciformi

21 Topoisomerasi Gli enzimi che determinano l aumento o la diminuzione del grado di disavvolgimento del DNA sono chiamati topoisomerasi, e la proprietà del DNA su cui agiscono è il numero di legame. Le topoisomerasihanno un ruolo determinante in processi quali la replicazionee l impacchettamento del DNA.

22 Topoisomerasi Le topoisomerasi di tipo I agiscono rompendo transitoriamente una delle catene del DNA, ruotando un estremità intorno alla catena integra e riunendo le estremità interrotte. Modificano Lkcon incrementi o riduzioni di 1. Le topoisomerasi di tipo II (DNA girasi in E. coli) rompono entrambe le catene del DNA e modificano Lk con incrementi o riduzioni di 2. Topoisomerasi II Topoisomerasi I

23 Modificazioni del numero di legame catalizzate da topoisomerasi Una popolazione di DNA plasmidici identici con lo stesso numero di legame migra come una banda discreta in elettroforesi. Le molecole di DNA superavvolto sono più compatte e in un elettroforesi su gel migrano più rapidamente delle corrispondenti molecole rilassate.

24 Superavvolgimento plectonemico In una molecola di DNA con superavvolgimento negativo i superavvolgimenti sono destrogiri. Il DNA superavvolto tende ad essere lungo e stretto piuttosto che compatto e spesso possiede ramificazioni. Questo tipo di superavvolgimento è definito superavvolgimento plectonemico (dal greco pléktos, ritorto, e nèma, filo), ed ètipico del DNA superavvolto in soluzione.

25 Superavvolgimento plectonemico Il superavvolgimento plectonemico non fornisce la compattezza necessaria per l impacchettamento del DNA nella cellula. Una molecola di DNA disavvolta può assumere una seconda forma di superavvolgimento, detto superavvolgimento a solenoide. Invece degli ampi superavvolgimenti destrogiri caratteristici della forma plectonemica, il superavvolgimento a solenoide implica rotazioni levogire piùstrette. Il superavvolgimento a solenoide, di per sè meno stabile ma più compatto, può essere stabilizzato dal legame con proteine ed è la forma presente nella cromatina degli eucarioti.

26 Nucleosomi

27 Nucleosomi La cromatina è costituita da fibre che contengono proteine e DNA in quantità approssimativamente uguali, più una piccola parte di RNA. Il DNA della cromatina interagisce molto strettamente con proteine chiamate istoni, che condensano e ordinano il DNA in unità strutturali dette nucleosomi.

28 Gli istoni sono altamente conservati In tutte le cellule eucariotiche sono presenti le cinque maggiori classi di istoni. Gli istoni hanno masse molecolari comprese tra e e sono molto ricchi degli amminoacidi basici arginina e lisina.

29 Nucleosomi Il nucleo centrale del nucleosoma è costituito da un ottamero di istoni: un tetramero di istoni (H3) 2 (H4) 2 e due dimeri (H2A-H2B) intorno al quale si avvolge il DNA.

30 Nucleosomi L istone H1 stabilizza la struttura del nucleosoma legandosi nella zona dove il DNA linker inizia o termina.

31 Nucleosomi Frammento di DNA (146 coppie di basi) avvolto intorno al nucleosoma con una conformazione a solenoide levogira.

32 Nucleosomi Vista dall alto della struttura del nucleosoma con il DNA legato

33 Nucleosomi La parte centrale proteica del nucleosoma contiene 8 molecole di istone, due copie ciascuna di H2A, H2B, H3 e H4

34 Nucleosomi La struttura del nucleosoma spiega perché il DNA eucariotico è parzialmente disavvolto. Il ripiegamento a solenoide osservato nei nucleosomièuna conformazione assunta dal DNA parzialmente disavvolto(superavvolto negativamente). Lo stretto avvolgimento del DNA attorno agli istoni nelle particelle nucleosomiche richiede la rimozione di circa un giro d elica dal DNA per permettere tali rotazioni serrate. In vitro le topoisomerasi sono necessarie per l assemblaggio della cromatina a partire da istoni e DNA circolare intatto.

35 Nucleosomi Lo stretto avvolgimento del DNA attorno al nucleo istonico richiede una compressione della scanalatura minore in questi punti. Un gruppo di due o tre coppie di basi A=T facilita tale compressione.

36 Nucleosomi I nucleosomi sono compattati in strutture regolari di ordine superiore. L avvolgimento del DNA attorno al nucleo di un nucleosoma lo rende più compatto di circa sette volte. La compattazione completa del DNA in un cromosoma è di circa volte maggiore.

37 Fibre di 30 nm Il compattamento del DNA nella fibra di 30 nm richiede la presenza di una molecola di istone H1 per nucleosoma.

38 Fibre di 30 nm La fibra di 30 nmfornisce al DNA una compattezza di circa 100 volte.

39 Nucleosomi Il successivo livello di ripiegamento no è stato ancora chiarito, ma sembra che alcune regioni del DNA si associno con un impalcatura nucleare. Foto al microscopio elettronico di un cromosoma umano parzialmente srotolato, che mette in evidenza le numerose anse attaccate a una struttura simile ad una impalcatura.

40 Nucleosomi Le regioni associate all impalcatura nucleare sono separate da anse di DNA contenenti probabilmente da a coppie di basi. Il DNA di ciascuna ansa può contenere un gruppo di geni correlati tra loro.

41 Cromosomi eucariotici Modello dei livelli di organizzazione che producono il compattamento del DNA in un cromosoma eucariotico. E.coli ha 1 cromosoma (4.6 milioni di coppie di basi). Ogni cellula umana diploide contiene 23 coppie di i cromosomi (6 miliardi di coppie di basi).

42 Compattamento DNA batterico Il DNA batterico è compattato in una struttura chiamata nucleoide.