Nucleotidi, Acidi Nucleici, Cromatina. Marco Nardini Dipartimento di Scienze Biomolecolari e Biotecnologie Università di Milano

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1 Nucleotidi, Acidi Nucleici, Cromatina Marco Nardini Dipartimento di Scienze Biomolecolari e Biotecnologie Università di Milano

2 Nucleotidi

3 - 8 tipi di nucleotidi comuni Struttura nucleotidi - base azotata legata ad uno zucchero unito al almeno un gruppo fosforico Basi azotate Purine: Adenina (A) Guanina (G) Pirimidine: Citosina (C) Uracile (U) Timina (T) molecole planari, aromatiche, eterocicliche, derivati dalla purina e dalla pirimidina* * (ma non sintetizzate in vivo da questi composti)

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5 Zuccheri (pentosio) 1) Ribonucleotidi ribosio Struttura nucleotidi 2) Deossiribonucleotidi 2 -deossiribosio (ribosio privato del gruppo ossidrilico in 2 ) Gruppo fosforico può legarsi al pentosio in posizione 3 e 5 3 -nucleotide, 5 -nucleotide

6 Struttura nucleotidi - in assenza del gruppo fosforico il composto si dice nucleoside Es: 5 -nucleotide nucleoside-5 -fosfato - Adenina, Guanina, Citosina in ribonucleotidi e deossiribonucleotidi - Uracile solo in ribonucleotidi - Timina solo in deossiribonucleotidi 8 tipi di nucleotidi comuni A, G, C, U A, G, C, T

7 Derivati nucleotidici ATP, FAD, NAD(P) +, CoA, acidi nucleici (RNA, DNA) ATP (Adenosina trifosfato) - trasportatore/trasmettitore di energia (in tutti gli organismi) - energia resa disponibile quando uno o due dei suoi gruppi fosforici sono trasferiti ad un altra molecola - concentrazione cellulare abbastanza modesta (~5mM), ma utilizzo giornaliero medio umano pari al peso corporeo

8 Adenosina trifosfato - adenosina = adenina + ribosio - 3 gruppi fosforici ( PO 3 2- ) - 1 legame fosfoestere - 2 legami fosfoanidridici (pirofosforili) Derivati nucleotidici importanza biologica ATP correlata con la elevata quantità di energia libera (-30.5 kj/mol) rilasciata dalla rottura dei legami fosfoanidridici trasferimento gruppo fosforico ad altro composto Idrolisi dell ATP (nel caso in cui l accettore sia H 2 O) ATP + H 2 O ADP + P i P i = PO 3 2- ATP + H 2 O AMP + PP i PP i = P 2 O 7 4- (pirofosfato) di solito nella maggior parte delle reazioni l accettore è H 2 O

9 Derivati nucleotidici - oltre a donare un gruppo fosforico, in molte reazioni metaboliche un nucleotide può donare anche altri costituenti Es: sintesi amido nelle piante - aggiunta unità glucosio donate da ADP-glucosio FAD e NAD + coenzimi nucleotidici Flavina Adenina Dinucleotide FAD Nicotinamide Adenina Dinucleotide NAD + (1) subiscono riduzione reversibile in modo da accettare elettroni e (2) passarli ad altri trasportatori ed essere rigenerati

10 Derivati nucleotidici FAD (Flavina Adenina Dinucleotide) - adenosina legata mediante 2 gruppo fosforici alla riboflavina (vitamina B2: sintetizzata da molti organismi ma non dall uomo dieta) - sistema eterociclico della riboflavina può essere ridotto reversibilmente

11 Derivati nucleotidici FAD (3 stati redox) - riduzione per trasferimento di uno o due e - - FADH (radicale stabile detto semichinone) sistema ad anelli coniugati assorbe luce a λ = 450 nm (giallo) giallo intenso -FADH 2 (forma totalmente ridotta o idrochinone) assorbe luce a λ = 570 nm (blu) giallo pallido }isoallossazina

12 Derivati nucleotidici NAD + (Nicotinamide Adenina Dinucleotide) - adenosina legata mediante 2 gruppo fosforici a un ribosio ed alla nicotinamide -NADP + (versione fosforilata del NAD + ): gruppo fosforico legato al ribosio dell adenosina in posizione 2 - sulla nicotinamide (derivato della vitamina niacina) è presente il sito di riduzione reversibile (il C4 dell anello piridinico è il centro reattivo) - N quaternario agisce come trappola di elettroni

13 Derivati nucleotidici NAD + (Nicotinamide Adenina Dinucleotide) - riduzione per trasferimento di uno ione idruro H: - (trasferimento catalizzato da deidrogenasi) -NAD + e NADP + sono trasportatori di coppie di elettroni - negli organismi aerobici l accettore terminale degli elettroni è O 2 -O 2 può accettare solo elettroni non accoppiati. Gli elettroni devono essere trasferiti ad O 2 uno alla volta gli elettroni rimossi da metaboliti a coppie (come quelli che riducono NAD + ) devono essere poi trasferiti ad altri trasportatori in grado di subire reazioni redox con 2 od 1 elettrone soltanto (es: FAD)

14 CoA (Coenzima A) Derivati nucleotidici - funzione centrale nel metabolismo ma non viene ossidato/ridotto - trasportatore di gruppi acili [CH 3 (CH 2 ) n CO ]. legame al gruppo sulfidrilico della parte mercaptoetilamminica della molecola - adenosina 3 -fosfato legata mediante 2 gruppo fosforici all acido pantotenico (vitamina B 3 ), unito alla β-mercaptoetilammina legame amidico legame tioestere ΔG 0 = kj/mol per l idrolisi del legame tioestere dell acetil-coa reazione più esoergonica dell idrolisi di ATP (-30.5 kj/mol) ponte pirofosforico

15 Acidi nucleici

16 Acidi Nucleici: DNA e RNA 1) l informazione genetica deve essere conservata in una forma di dimensioni ridotte e stabile per lunghi periodi 2) l informazione genetica deve essere decodificata, spesso parecchie volte, al fine di poter essere usata trascrizione, il processo in cui la sequenza nucleotidica nel DNA viene copiata nel RNA, al fine di poter passare al successivo processo della traduzione, e cioè la sintesi delle proteine 3) l informazione contenuta nel DNA o nel RNA deve essere resa accessibile alle proteine e ad altri acidi nucleici 4) La progenie di un organismo deve essere dotata con lo stesso blocco di istruzioni presente nel progenitore il DNA deve andare incontro ad un processo di replicazione

17 Acidi Nucleici: DNA e RNA

18 Struttura Acidi Nucleici RNA, DNA acidi nucleici = polinucleotidi (polimeri di nucleotidi) in cui un gruppo fosforico fa da ponte fra le posizioni 3 e 5 di due unità ribosio vicine - legame fosfodiestere (2 legami esteri con 2 unità ribosio) - gruppi fosforici acidi (a ph fisiologico gli acidi nucleici sono polianioni -estremità5 residuo con posizione C5 non impegnata con altro nucleotide -estremità3 residuo con posizione C3 libera

19 Struttura Acidi Nucleici RNA, DNA - convenzione sequenza scritta a partire dall estremità 5 a 3 - rappresentazione schematica: linea verticale ribosio linea diagonale legame fosfodiestere base rappresentazione ad una lettera tetraribonucleotide: papupcpg o paucg H tetradeossiribonucleotide d(paptpcpg) o d(patcg)

20 Struttura Acidi Nucleici RNA, DNA - le proprietà fisiche del polimero variano rispetto al monomero e dipendono dalle dimensioni (es: carica, solubilità) - il polimero (formato da monomeri non identici) rispetto al monomero contiene una informazione relativa alla sequenza RNA nessuna regola sulla composizione nucleotidica DNA n A = T e n G = C (Regole di Chargaff) natura doppia elica del DNA - composizione in basi del DNA molto variabile tra organismi diversi Es: G + C dal 25% -75% (ma ~costante in specie correlate: es. 39% -46% nei mammiferi)

21 Struttura DNA (Watson-Crick, 1953) basata sulle seguenti considerazioni: - regole di Chargaff - corretta forma tautomerica delle basi negli acidi nucleici (tautumeri = isomeri interconvertibili che differiscono per la posizione degli atomi di H) solo forma chetonica - natura elicoidale della struttura

22 Struttura DNA struttura ad elica (X) ripetitività di 3.4 Å (fra le basi)

23 Struttura DNA Struttura del DNA B - doppia elica (catene antiparallele destrorse) - 2 scanalature: scanalatura maggiore e minore - scheletro covalente di unità ribosio e gruppi fosforici - gruppi fosforici all esterno (repulsione elettrostatica minimizzata) - basi nella parte interna dell elica - coppie di basi planari (da catene opposte) legate da legami a H (A T, G C) e ~ all asse dell elica appaiamento complementare delle basi Passo dell elica 34 Å, diametro 20 Å, d-basi 3.4 Å, nucl/giro 10

24 Struttura DNA appaiamento complementare delle basi ogni catena di DNA agisce da stampo per la sintesi della catena complementare - ciascuna coppia di basi ha circa la stessa larghezza A T e G C sono intercambiabili senza alterare lo scheletro di unità ribosio e gruppi fosforici (analogamente A T e T A, C G e G C )

25 Struttura DNA - molecole di DNA generalmente di grandi dimensioni (misurata in coppie di basi, bp, o kb) - di solito più un organismo è complesso maggiore è il suo contenuto in DNA - il genoma di un organismo è distribuito in diversi cromosomi, ognuno contenente una molecola di DNA - molti organismi sono diploidi, cioè contengono 2 serie equivalenti di cromosomi, una per ogni genitore il contenuto di DNA specifico (aploide) è quindi la metà del contenuto di DNA totale Es: 46 cromosomi per cellula umana numero aploide 23

26 Struttura DNA - DNA a doppia elica: diverse strutture a seconda della composizione del solvente e della sequenza di basi DNA A, DNA Z DNA A - condizioni di deidratazione cambio conformazionale reversibile del DNA B struttura più larga e meno profonda - elica destrorsa, passo dell elica 34 Å, diametro 26 Å, d-basi 2.9 Å, nucl/giro presenza di un buco assiale (6 Å di diametro) - piani delle basi ruotate di 20 rispetto all asse dell elica profonda scanalatura maggiore, scanalatura minore poco profonda

27 DNA B DNA A

28 Struttura DNA DNA Z - polinucleotidi complementari con che alternano purine a pirimidine ad alta concentrazione di sali assumono conformazione Z es: poli d(gc) poli d(gc), poli d(ac) poli d(gt) - elica sinistrorsa, passo dell elica 44 Å, diametro ~18 Å, d-basi 7.4 Å, nucl/giro 12 - stretta e profonda scanalatura minore, scanalatura maggiore molto poco profonda - il sale stabilizza la struttura Z riducendo la repulsione elettrostatica fra i gruppi fosfati dei filamenti opposti (nell elica Z sono più vicini rispetto all elica B: 8 Å vs 12 Å)

29 DNA B DNA Z

30 Struttura DNA DNA Z funzione biologica ed esistenza in vivo? - esistono domini proteici Zα che legano DNA Z (uno per filamento) interazione ionica e legami-h fra catene laterali polari e basiche e scheletro di unità ribosio e gruppi fosforici (non coinvolte le basi) - complementarità strutturale e di carica fra la superficie proteica e lo DNA Z - sequenze in grado di formare DNA Z presenti spesso in vicinanza dell inizio dei geni conversione reversibile fra DNA Z e DNA B può avere un ruolo nel controllo della trascrizione two ADAR1 Zα domains in complex with Z-DNA

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32 Limitata flessibilità del DNA Struttura DNA - l interconversione fra diverse strutture di DNA non avviene liberamente in vivo inusuali condizioni fisiche (deidratazione o interazione con proteine che legano il DNA) - residui individuali possono differire dalle conformazioni medie - le molecole di DNA B (spesse ~20 Å) possono adottare diversi gradi di curvatura (le variazioni più elevate dalla linearità richiedono il legame di specifiche proteine) - la conformazione dell unità nucleotidica dipende da 7 angoli di torsione di cui uno descrive l orientazione della base rispetto al legame glicosidico (N-C1, angolo χ) - limitati gradi di libertà rotazionali dovuti a constraints interni

33 Limitata flessibilità del DNA Struttura DNA - la rotazione attorno al legame glicosidico (angolo χ) è fortemente ostacolata residui purinici: conformazione sin e anti residui pirimidinici: conformazione anti (unica stabile) (nella forma sin lo zucchero interferisce stericamente con il sostituente sull atomo C2) - negli acidi nucleici a doppia elica le basi sono di solito in forma anti - eccezione: DNA Z residui purinici in forma sin e residui pirimidinici in forma anti ( dinucleotide unità ripetitiva elica Z)

34 Limitata flessibilità del DNA Struttura DNA - la flessibilità dell anello di ribosio è limitata - l anello del ribofuranosio non è piatto perchè se lo fosse i sostituenti sarebbero eclissati - 4 atomi dell anello sono coplanari, il quinto (C2 o C3 ) è fuori dal piano di diversi 0.1 Å conformazioni del ribosio C2 -endo e C3 -endo - il ripiegamento del ribosio governa l orientamento relativo dei gruppi fosforici sul ribosio DNA B C2 -endo DNA A C3 -endo DNA Z residui purinici C3 -endo residui pirimidinici C2 -endo

35 Limitata flessibilità del DNA Struttura DNA - lo scheletro zucchero-fosfato ha costrizioni conformazionali (angoli α e ζ) - interazioni non-covalenti tra anello di ribosio e gruppi fosforici - interferenze steriche tra residui vicini (nei polinucleotidi) le catene costituite da unità zucchero-fosfato nelle doppie eliche sono rigide ed i loro angoli sono privi di tensioni

36 Forze che stabilizzano la struttura degli acidi nucleici complessità strutturale del DNA inferiore a quello delle proteine Denaturazione riscaldamento DNA duplex si separano le 2 catene complementari che assumono conformazioni casuali diminuzione drastica della viscosità della soluzione aumento del 40% dell assorbimento di luce ultravioletta (a causa della rottura delle interazioni elettroniche tra basi vicine)

37 Forze che stabilizzano la struttura degli acidi nucleici Denaturazione - brusco incremento nell assorbimento della luce (di solito a 260 nm) in un ristretto intervallo di T la denaturazione del DNA è un fenomeno cooperativo in cui il collasso di una parte della struttura destabilizza la parte rimanente - l aumento dell assorbanza è noto come effetto ipercromico - l assorbimento relativo è il rapporto tra l assorbimento della luce a 260 nm a T indicata rispetto a quello a T = 25 C

38 Forze che stabilizzano la struttura degli acidi nucleici - T m = temperatura di fusione la stabilità della doppia elica di DNA dipende dalla natura del solvente, dal tipo e concentrazione degli ioni T m aumenta linearmente con la quantità molare di coppie di basi G C (ma questo non solo perché G C contengono un legame H in più di A T) Tm temperatura a cui si raggiunge la metà dell aumento dell assorbimento totale della luce UV

39 Forze che stabilizzano la struttura degli acidi nucleici Rinaturazione raffreddamento DNA duplex - se rapidamente sotto T m parziale riappaiamento casuale delle basi - se a ~ 25 C sotto T m (condizione di riassociazione o annealing) energia termica sufficiente per rinaturazione completa - allo stesso modo le catene complementari di DNA ed RNA possono formare doppie eliche ibride (ibridizzazione) che sono solo di poco meno stabili delle doppie eliche di DNA

40 Forze che stabilizzano la struttura degli acidi nucleici Stabilizzazione: appaiamento delle basi - è la colla che tiene uniti gli acidi nucleici a doppia elica - nelle strutture del DNA sono presenti solo appaiamenti Watson-Crick tale geometria è la più stabile perché hanno una affinità maggiore rispetto a quella di altri appaiamenti - sono noti anche altri tipi di appaiamenti, particolarmente per RNA es: geometria di Hoogsteen l atomo N7 dell adenina si comporta come accettore di legame a H invece di N1 appaiamento Hoogsteen tra adenina e timina appaiamento Watson-Crick

41 Forze che stabilizzano la struttura degli acidi nucleici Stabilizzazione: impilamento delle basi - i legami a H sono alla base delle interazioni di appaiamento delle basi (specificità di appaiamento nel DNA) - i legami a H contribuiscono poco alla stabilità (in condizioni di denaturazione sono rimpiazzati da legami H con molecole di H 2 O) altri tipi di forze - organizzazione impilate delle strutture planari delle basi puriniche e pirimidiniche (interazioni di van der Waals) -le energie di impilamento variano con il contenuto delle basi: (interazioni tra le basi G e C impilate più resistenti di quelle fra le basi A e T maggior stabilità termica DNA ad alto contenuto G + C) energia di impilamento di una doppia elica è sequenza dipendente

42 Forze che stabilizzano la struttura degli acidi nucleici Stabilizzazione: impilamento delle basi

43 Forze che stabilizzano la struttura degli acidi nucleici Stabilizzazione: interazioni ioniche - la stabilità delle strutture degli acidi nucleici dipende dalle interazioni elettrostatiche dei loro gruppi fosforici carichi Esempio: la T m del DNA duplex aumenta con la concentrazione di ioni Na + (schermatura elettrostatica dei gruppi fosforici anionici) Litio e potassio (cationi monovalenti) simili effetti non specifici Cationi divalenti (Mg 2+, Mn 2+ e Co 2+ ) si legano specificamente ai gruppi fosforici più efficaci di quelli monovalenti nello schermare i gruppi fosforici - gli enzimi che mediano reazioni con acidi nucleici e nucleotidi quasi sempre richiedono Mg 2+ come cofattore -gli ioni Mg 2+ contribuiscono a stabilizzare le complesse strutture assunte da molti tipi di RNA

44 Struttura dei cromosomi eucariotici - le molecole di DNA sono in genere enormi es: genoma umano 23 cromosomi, 3.2 miliardi di bp lunghezza di profilo = lunghezza fra le estremità della molecola distesa ciascuna bp contribuisce per 3.4 Å lunghezza di profilo ~ 1 m Come può essere analizzata e decodificata una così grande quantità di informazione genetica in un tempo ragionevole mentre è conservata in una piccola frazione del volume cellulare? - il DNA duplex subisce facilmente danni quando fuori dall ambiente protettivo cellulare (a causa della sua forma allungata e per la sua rigidità) degradazione da taglio mediante agitazione, rimescolamento o pipettamento di una soluzione di DNA (sono comuni tecniche per preparare frammenti di DNA)

45 Struttura dei cromosomi eucariotici genoma dei procarioti - singola molecola di DNA circolare, impacchettata in associazione a proteina molto basiche genoma degli eucarioti - DNA condensato e impacchettato in cromosomi cromosoma - complesso di una molecola lineare di DNA e di proteine, noto come cromatina (metà della massa è costituita da proteine) - entità dinamica la cui forma si modifica durante le fasi del ciclo cellulare forma più condensata durante la metafase della divisione cellulare forma meno condensata durante trascrizione e replicazione del DNA - cromosomi umani: lunghezza di profilo variabile tra cm ma nella forma più condensata sono lunghi solo μm

46 Istoni Struttura dei cromosomi eucariotici - cromatina: metà della massa è costituita da proteine, la maggior parte delle quali sono istoni - 5 classi principali: H1, H2A, H2B, H3, H4 (23 kd, 14 kd, 13.8 kd, 15.3 kd, 11.3 kd) - alta percentuale (20-30%) di residui Arg e Lys possono legare i gruppi fosforici (carichi -) del DNA mediante interazioni elettrostatiche - alta stabilità evolutiva (sequenze fra le più conservate fra quelle note) strutture adattate a funzioni così critiche da essere intolleranti a qualsiasi variazione (solo H1 è più variabile) - modificazioni chimiche (metilazione, acetilazione, fosforilazione su specifici residui Arg, His, Lys, Ser, Thr) (i) molte sono reversibili, (ii) tendono a diminuire la carica positiva e (iii) variano considerevolmente da specie a specie

47 Struttura dei cromosomi eucariotici Nucleosomi - la cromatina contiene ~ un ugual numero di H2A, H2B, H3, H4 ma solo la metà di H1 - struttura a collana con particelle (nucleosomi) di ~100 Å di diametro legate da DNA apparentemente nudo - digestione con nucleasi di micrococco (idrolizzano DNA a doppia catena) rompono il DNA soltanto tra le particelle le particelle proteggono il DNA (particelle legate a ~200 bp di DNA) nel 1974 Kornberg propose che i nucleosomi fossero formati da ottameri (H2A) 2 (H2B) 2 (H3) 2 (H4) 2 associati a un segmento di DNA lungo circa 200 bp e che H1 si legasse al nucleosoma in altro modo

48 Struttura dei cromosomi eucariotici Particella centrale del nucleosoma - la nucleasi di micrococco degrada la cromatina in singoli nucleosomi contenenti anche H1 e 166 bp. Una ulteriore digestione rimuove un altro frammento di DNA (rimangono 146 bp) che determina il rilascio di H1 formazione della particella centrale del nucleosoma ottamero (H2A) 2 (H2B) 2 (H3) 2 (H4) 2 + DNA lungo circa 146 bp - nucleosomi vicini sono uniti da DNA linker (o DNA di unione) di 55 bp in media (varia tra 8-114bp a seconda di organismi e tessuti) - struttura a simmetria binaria - DNA avvolto attorno all ottamero per 1.6 giri (superelica sinistrorsa)

49 Struttura dei cromosomi eucariotici Particella centrale del nucleosoma - gli istoni H2A, H2B, H3 e H4 hanno sequenze diverse ma struttura 3D (~70 residui) simile: lunga elica centrale affiancata su ogni lato da un ansa e da un elica più corta - eterodimeri H2A-H2B, H3-H4 che legano ciascuno 2.5 giri di DNA duplex che si curva formando un angolo di tetramero (H3-H4) 2 mediante fascio di 4 eliche dei 2 H3 - interazione di (H3-H4) 2 con ciascun H2A-H2B mediante fascio di 4 eliche (2 di H2A e 2 di H4) formazione ottamero metà superiore dell ottamero

50 Struttura dei cromosomi eucariotici superelica DNA - 75% superficie accessibile al solvente - raggio di 42 Å e passo di 24 Å, andamento non uniforme (angoli bruschi seguendo l andamento della struttura del nucleo degli istoni) - variabilità conformazionale nella sua lunghezza (da 9.4 a 10.9 basi per giro rispetto alle 10.4 del DNA in soluzione) interazioni nucleo istonico-dna - legami a H, ponti salini e dipoli delle eliche con gli atomi di O dei gruppi fosforici, interazioni idrofobiche con gli anelli delle unità deossiribosio - inserimento di catena laterale di Arg nella scanalatura minore del DNA in tutte le 14 posizioni in cui il DNA si affaccia sugli istoni - pochi contatti istoni-basi (no specificità in sequenza degli istoni)

51 Struttura dei cromosomi eucariotici Istone H1: ruolo nella condensazione della cromatina - la nucleasi di micrococco degrada la cromatina in singoli nucleosomi contenenti anche H1 e 166 bp, corrispondenti a ~2 giri completi di superelica (estremità vicine) - in presenza di H1 le fibre di cromatina hanno nucleosomi ravvicinati con il DNA che entra ed esce dal nucleosoma dalla stessa parte - in assenza di H1 le fibre di cromatina hanno nucleosomi più dispersi con il DNA che entra ed esce dal nucleosoma da parti opposte modello di Klug: ottamero istonico + H1+ 166bp in presenza di H1 in assenza di H1

52 Cromatina: livelli di organizzazione più elevati - l avvolgimento del DNA sul singolo nucleosoma riduce di 7 volte la lunghezza della molecola (166 bp da 560 Å compresse a 80 Å) - in presenza di concentrazioni saline fisiologiche la cromatina si compatta ulteriormente andamento a zig-zag, filamento di diametro ~30 nm - toroide di 18.9 nucleosomi per giro (~316 Å di passo)

53 Cromatina: livelli di organizzazione più elevati - il filamento di cromatina di ~30 nm è stabilizzato da interazioni che coinvolgono i segmenti N-terminali (molto basici e contenenti siti di acetilazione) di H2B, H3 e H4 che attraversano la superelica di DNA ed interagiscono con nucleosomi vicini es: N-term di H4 con zona carica negativamente del dimero H2A-H2B di un nucleosoma adiacente acetilazione come controllo del livello di strutturazione della cromatina

54 Cromatina: livelli di organizzazione più elevati - nel cromosoma umano in metafase (forma più condensata della cromatina), le fibre di cromatina si proiettano radialmente a partire da una impalcatura centrale formata da proteine fibrose - cromosoma umano ~ bp e ~6 μm di lunghezza 2000 loops radiali - proteine non istoniche (10% proteine cromosomiche) sono coinvolte nella organizzazione della cromatina e nella interconversione da forme più condensate (in metafase) a meno condensate.