Metodologie di ricerca per lo studio del sistema nervoso

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1 Metodologie di ricerca per lo studio del sistema nervoso 1) Identificare le regioni cerebrali implicate in ciascuna componente 2) Analizzare come sono connesse le regioni cerebrali coinvolte

2 3. Metodi comportamentali 2. Mappatura delle aree e delle loro funzioni 1. Singola cellula

3 SCOPERTA DEL NEURONE Jan Evangelista Purkinje ( ) Camillo Golg SNC rete diffusa ( ) Entrambi Nobel 1906 Santiago Ramòn y Cajal neuroni ( )

4 Jan Evangelista Purkinje Sostenitore filosofia della natura Le cellule da lui osservate erano quindi piccole anime pensanti 1837 Lo scienziato deve essere anche un artista creativo.. Il microscopio deve promuovere qualità immaginative e trascendere la realtà visiva

5 1873 Reazione nera di Golgi

6 Franz Joseph Gall (1800) Frenologia: Studio suddivisioni cervello in base a funzione e indici anatomici (es. forma del cranio)

7 Unità funzionale del SNC Neurone rete

8 1. Singola cellula Tecniche di colorazione e marcatura dei neuroni Apprendimento e memoria

9 Tecniche di determinazione della funzione: Elettrofisiologia Stimolo Registrazione Apprendimento e memoria, basi molecolari: LTP

10 LTP

11 Misurare l attività di un singolo canale

12 pipetta da patch a contatto di una cellula

13 Configurazione del patch

14 2a. Aree del cervello e connessioni: mappatura delle connessioni Tecniche di colorazione e marcatura dei neuroni Bulbo olfattivo: corpi cellulari (sotto) e sinapsi (sopra) Corteccia cerebellare: corpi cellulari (B) e sinapsi (G) Corteccia Nucleo genicolato somatosensitiva, laterale, marcatura marcatore attività anterograda sinaptica Proiezioni gangli Sistema nervoso Assoni motori (G) radici dorsali verso autonomo, iniezione e sinapsi midollo spinale, intracellulare enzima neuromuscolari marcatore marcatore (R), GFP proteins enzimatico Neuroni sensitivi olfattivi nel naso marcati con colorante vitale nel bulbo olfattivo

15 indicatori fluorescenti Fluoroforo coniugato a un anticorpo Indicatori sensibili alla concentrazione di ioni Indicatori di voltaggio Proteine fluorescenti

16 Marcatura retrograda o anterograda Assoni efferenti (anterograda): iniezione di sostanze radioattive (amino acidi) lectine (PHA-L) o fluoresceinate Assoni afferenti (retrograda): fluorogold

17 Perossidasi del Rafano (1971) Un enzima che in presenza del substrato produce un prodotto colorato o fluorescente. Se iniettato vicino alle terminazioni assoniche entra nel Neurone per endocitosi e per trasporto assonale retrogrado Raggiunge il corpo cellulare e i dendridi

18 2b. Aree del cervello e connessioni: Individuazione delle funzioni Tecniche di ablazione e stereotassi Ablazione o lesione di una determinata area del cervello ed analisi comportamentale dell individuo risultante Limiti: interpretazione dei risultati Pseudo rabbia da decorticazione Che scompare isolando anche L ipotalamo

19 Metodi di lesione -Lesioni da aspirazione: per strutture corticali -Lesioni da radiofrequenze: tramite calore prodotto. Per strutture sottocorticali -Resezione chirurgica -Blocco criogeno: lesione reversibile -Lesioni chimiche selettive: Acido cainico, acido ibotenico: assorbiti in prossimita della pipetta 6-idrossidopamina: assorbita da neuroni noradrenergici e dopaminergici (induzione di Parkinson)

20 Nell uomo? Lesioni Lesioni dovute ad incidenti: analisi post-mortem Gage: distruzione della corteccia frontale sopraorbicolare Senza inibizioni, infantile, irresponsabile, indifferente alle reazioni degli altri e delle conseguenze Ablazioni in seguito a tumori, epilessia o ictus L ippocampo e la memoria

21 Tecniche di Registrazione: elettrodi interni L elettrodo viene inserito nella regione desiderata e registra l attività di un gruppo di neuroni in risposta ad appropriati stimoli

22 Con elettrodi esterni Elettroencefalogramma (EEG) Due elettrodi collegati ad un amplificatore elettronico vengono posizionati nell area di interesse sul cuoio capelluto. Consente di rilevare l attività elettrica complessiva di tutti i neuroni compresi tra due elettrodi applicati Per convenzione, nell EEG eccitazione e rappresentata con deflessione NEGATIVA

23 L elettroencefalogramma 1-30 Hz microV

24 EEG Onde delta 0,5-4 Hz (sonno ) Onde theta 4-7 Hz (sonno) Onde alfa 8-13 Hz (sveglio rilassato) Onde beta Hz (attività mentale)

25 EEG misura Potenziali spontanei Potenziali evocati Morte clinica

26 Morte cerebrale valutata con EEG Onde cerebrali inferiori ai 2microVolt per 30 min No potenziali evocati

27 Epilessia Vantaggi: elevata risoluzione temporale basso costo Svantaggi: bassa risoluzione spaziale non adatta per registrazioni di risposte a brevi stimoli (Variante: potenziali evocati) Studi del sonno Stadio 1 del sonno Veglia alfa beta Theta REM Attività delta

28 Registrazioni: elettrodi esterni potenziali evocati (SEP) Variazione di EEG in relazione a stimolo sensoriale Sincronizzati con la stimolazione sensoriale Non evidenti da EEG=> AVERAGING: estrazione SEP (segnale) da EEG (rumore) Stimolazione sensoriale visiva,acustica, meccanica, gustativa e olfattiva

29 Picchi positivi e negativi generati da diverse strutture neurali Picchi precoci: Strutture sottocorticali Picchi intermedi: Corteccia sensoriale primaria Picchi tardivi ( ms) sono i potenziali correlati ad attivita cognitive superiori (memoria, attenzione) Utili per valutare lo stato funzionale di sistemi sensoriali Diagnosi precoce di malattie: -es. in sclerosi multipla si ha demielinizzazione=>diminuzione di velocita di conduzione=> aumento latenza in potenziali evocati ERP potenziali legati all evento (suono)

30 Brain-computer interface Con 96 elettrodi un paziente tetraplegico può muovere un cursore di un computer o aprire e chiudere una mano robotica

31 Visualizzazione del cervello Tomografia a emissione di positroni PET Risonanza magnetica RM

32 Risonanza magnetica nucleare Si basa sulle proprietà magnetiche degli atomi,dovute al fatto che le cariche elettriche in movimento generano un campo magnetico. Questo ad esempio accade nei protoni che si stima siano circa 70-80% degli atomi che costituiscono gli organismi

33 Un campo magnetico esterno provoca l llineamento dei nuclei

34 Risonanza magnetica funzionale La risposta emodinamica di un tessuto può essere visualizzata sfruttando le proprietà magnetiche del ferro contenuto nell emoglobina e le loro variazioni dipendenti dallo stato di ossigenazione

35 Risonanza magnetica funzionale L emoglobina ossigenata non altera significativamente il campo magnetico locale L emoglobina deossigenata è paramagnetica a causa dei 4 elettroni disaccoppiati del ferro e è in grado di perturbare il campo magnetico locale

36 Cambia il rapporto tra Hb ossigenata e deossigenata

37 Immagini di risonanza magnetica funzionale

38 Vantaggi: non richiede uso radioattivo buona risoluzione temporale immagini del cervello con risoluzione spaziale elevata Svantaggi: Costo

39 Tomografia ad emissione di positroni Iniezione nel circolo sanguigno di (PET) una sostanza radioattiva che viene assunta nelle diverse aree del cervello a seconda dell attività. Ad attività maggiore corrisponde radioattività maggiore. Il computer produce una immagine a codice cromatico Consente di misurare: attività metabolica (Glucosio) flusso sanguigno captazione di ossigeno attività di recettori (neurotrasmettitore)

40 Scansioni PET del cervello in attività

41 Vantaggi: Risoluzione spaziale ottima Evidenzia la funzione delle strutture, visualizzandone il livello di attività Svantaggi: Bassa risoluzione temporale No immagini del tessuto nervoso (deve essere associata a MRI) Apparecchiatura costosa, deve prevedere nelle vicinanze un ciclotrone

42

43 OPTICAL IMAGING Registrazione di attivita di popolazione di neuroni Uso di traccianti sensibili al voltaggio: rispondono a variazioni di potenziale con variazioni dello spettro di fluorescenza o assorbimento Ottima risoluzione spaziale e temporale

44 Risoluzione dell EEG e di tecniche di visualizzazione Tecnica EEG Risoluzione Risoluzione temporale spaziale 1 msec mm PET 45 sec 4 mm MRI 3-5 sec mm

45 3. Tecniche comportamentali Hanno come obbiettivo il prodotto del funzionamento del cervello, vale a dire i comportamenti individuali Test psicologici valutano la funzione emotiva, cognitiva o intellettiva Apprendimento motorio Seguire i margini della figura allo specchio

46 Wisconsin card sorting test test di funzionalità lobi frontali Sono utilizzate 128 carte contenenti da 1 a 4 figure identiche di un singolo colore Le figure sono: stelle,croci, triangoli cerchi Rosso, giallo, blu e verde

47 Wisconsin test

48 Wisconsin test Colore Forma Numero

49 Somministrazione del test: Quelle che ha davanti sono 4 carte guida, metta le carte del mazzo sotto le carte guida dove pensa sia opportuno Io le dirò se è giusto o sbagliato Il criterio (colore, forma, numero) non viene anticipato e cambia Dopo 10 risposte esatte si cambia criterio Particolare rilevanza ha l Errore perseverativo

50 Negli animali: Test comportamentali

51 Il concetto di mente Prodotto dell attività encefalica Proprietà emergente dell attività encefalica Idrogeno e ossigeno hanno caratteristiche del tutto diverse Dall H2O Le molecole (prive di via) che costituiscono un organismo Si organizzano a formare un essere vivente Nei sistemi complessi emergono caratteristiche imprevedibili