Organizzazione del Genoma Umano

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1 Organizzazione del Genoma Umano Genoma umano Genoma nucleare Mb geni Genoma mitocondriale 16,6 kb 37 geni ~ 30% ~ 70% Geni e sequenze correlati ai geni DNA extragenico Due geni Per rrna 22 geni Per trna 13 geni che codificano polipeptidi Sequenze uniche o moderatamente ripetute ~ 10% ~ 90% ~ 80% ~ 20% DNA codificante DNA non codificante Sequenze uniche o con un basso numero di copie Da mediamente ad altamente ripetute Pseudogeni Frammenti genici Introni, sequenze non tradotte, ecc. Ripetizioni in tandem o ripetizioni raggruppate Ripetizioni intersperse

2 Le funzioni del mitocondrio Il mitocondrio è in grado di svolgere molteplici funzioni. La più importante tra esse consiste nell'estrarre energia dai substrati organici che gli arrivano per produrre un gradiente ionico cheviene sfruttato per produrre ATP. Gli altri processi in cui il mitocondrio interviene sono: 1) l'apoptosi, 2) regolazione del ciclo cellulare, 3) regolazione dello stato redox della cellula, 4) sintesi dell'eme, 5) sintesi del colesterolo, 6) produzione di calore. La produzione di energia utilizzando i principali prodotti della glicolisi: il piruvato ed il NADH. Essi vengono sfruttati in due processi: il ciclo di Krebs e la fosforilazione ossidativa.

3 CARATTERISTICHE dell mtdna POLIPLASMIA In ogni cellula sono presenti molti mitocondri ed ogni mitocondrio contiene multiple copia del suo genoma (eccetto piastrine e ovulo non fertilizzato) migliaia di copie mtdna / cell. Durante la divisione cellulare i mitocondri vengono distribuiti casualmente alle cellule figlie ETEROPLASMIA In tessuti normali tutte le copie di mtdna sono identiche. Nel caso di una mutazione del mtdna questa può colpire tutte le copie omoplasmia oppure essere presente solo in una percentuale di genomi eteroplasmia. Generalmente i polimorfismi neutrali sono omoplasmici mentre la maggior parte delle mutazioni-malattia sono eteroplasmiche

4 EFFETTO SOGLIA L espressione clinica delle mutazioni del mtdna è determinata dalla relativa proporzione wild type/mutato in un determinato tessuto; è necessario un numero minimo di copie per danneggiare il metabolismo energetico di un determinato organo o tessuto (valore relativo e non assoluto) (SNC, cuore, muscolo, rene e ghiandole esocrine) (bilancio energetico). SEGREGAZIONE MITOTICA Durante la divisione cellulare la proporzione di genomi mutati può variare per deriva nelle cellule figlie, con conseguente cambiamento fenotipico. EREDITÀ MATERNA Virtualmente tutti i mitocondri dello zigote derivano dall oocita e perciò la modalità di trasmissione delle mutazioni mt differisce dalla trasmissione mendeliana classica: madre portatrice trasmissione a tutta la progenie, ma solo le figlie femmine possono trasmettere la mutazione ai loro figli (eredita( eredita matrilineare).

5 - Frequenza 6-7/ nati MALATTIE MITOCONDRIALI - Malattie da mutazioni di geni del genoma mitocondriale Mutazioni puntiformi, delezioni o duplicazioni - Malattie da mutazioni di geni del genoma nucleare che codificano per proteine che vengono trasportate nel mitocondrio (proteine strutturali, proteine deputate all importazione o alla comunicazione tra i due genomi) - Poiche la funzione mitocondriale e necessaria a quasi tutte le cellule e poiche l espressione fenotipica di una mutazione nell mtdna dipende dalla proporzione relativa di mtdna normale e mutante nelle cellule che formano i tessuti, la ridotta penetranza l espressivita variabile e la pleiotropia sono caratteristiche tipiche di un albero genealogico di un disordine mitocondriale

6 Malattie mitocondriali L eredita e matrilineare e nessun maschio affetto trasmette la malattia alla sua progenie mentre la femmina affetta trasmette la malattia a tutti i figli senza distinzione di sesso.

7 EXAMPLES OF MITOCHONDRIAL DISORDERS

8 La consulenza genetica E un processo comunicativo attraverso il quale soggetti affetti da una patologia a base genetica (ereditaria o non ereditaria) oppure i loro familiari vengono informati sulle conseguenze della malattia, sulla modalità di trasmissione e sulle opzioni disponibili per la prevenzione e la cura della malattia.. I tre aspetti di base della consulenza genetica sono: : la diagnosi, il calcolo del rischio,, e la comunicazione

9 Quando? La consulenza genetica può essere effettuata in epoca preconcezionale oppure in fasi successive

10 Indicazioni per la consulenza genetica Malattia ereditaria nota o sospetta Difetti congeniti Ritardo Mentale Età avanzata materna Storia familiare di cancro con insorgenza in età giovanile Aborti ripetuti Esposizione a teratogeni Consanguineità

11 Informazioni da fornire in consulenza genetica Il valore del rischio di ricorrenza L impatto della malattia sul paziente e sulla famiglia Variazioni dell impatto e/o del rischio di una malattia Anticipare possibili scoperte future

12 Rischio genetico Per rischio genetico si intende la possibilità che una condizione patologica a base genetica si presenti in un individuo o in una famiglia. Rischio di ricorrenza la probabilità che una patologia, presente in una famigla si verifichi nuovamente in altri membri della stessa famiglia Rischio di occorrenza la probabilità che una patologia assente in una famiglia possa presentarsi in un individuo o nella sua discendenza

13 Calcolo del rischio Il calcolo del rischio deve basarsi sull accertamento della modalità di trasmissione della malattia, sulla posizione nell albero genealogico dell individuo interessato e sui dati strumentali e di laboratorio disponibili. Viene confrontato con quello della popolazione generale tenendo presente l origine e l etnia di appartenenza

14 Rischio per malattie mendeliane quando la malattia è monogenica.. Il rischio deve tenere conto di penetranza incompleta, espressività variabile, epoca d esordiod esordio, consanguineità, eventuale appartenenza a gruppo etnico Rischio per malattie non mendeliane mitocondriali e multifattoriali molto variabili necessaria valutazione specialistica dei singoli casi Rischio per anomalie cromosomiche è più alto in coppie che hanno gia avuto progenie con patologie cromosomiche. Importante età dei genitori Rischio empirico indica il rischio di ricorrenza di patologie che possono avere una base genetica,, ma di cui non sono stati ancora chiariti i meccanismi molecolari

15 Rischio generico riproduttivo Il rischio generico riproduttivo per una coppia per la quale l anamnesi l personale e familiare estesa ai consanguinei di I e II grado abbia escluso un incremento del rischio rispetto a quello della popolazione generale è del 3-5%. Quindi il valore del 3-5% corrisponde all incidenza incidenza, nella popolazione generale dei difetti congeniti conseguenti ad anomalie genetiche (ereditarie e non) e anomalie non genetiche (cause ambientali).

16 Strumenti del genetista Raccolta accurata della Storia familiare (costruzione dell albero genealogico) Esame obiettivo (dismorfologia:: Area della genetica clinica che si occupa della diagnosi e del trattamento delle malformazioni congenite ) Test genetici Screening genetici

17 Test di screening in genetica Test di screening dovrebbero essere economici, applicabili su larga scala ed in grado di selezionare in modo efficace una sottopopolazione su cui eseguire test diagnostici specifici.. In genetica clinica sono spesso di due tipi: Finalizzato all identificazione in fase precoce di individui affetti da una malattia genetica per i quali un intervento medico precoce reca benefici sia per i pazienti che per la famiglia Mirato a identificare gli individui a rischio di trasmettere una malattia genetica

18 Test di Screening in genetica Finalizzato all identificazione in fase precoce di individui affetti da una malattia genetica per i quali un intervento medico precoce reca benefici sia per i pazienti che per la famiglia Esempi: Diagnosi prenatale sindrome di Down Screening neonatale fenilchetonuria Screening malattie dell adulto (tumore colon e mammella)

19 Test di Screening in genetica Mirato a identificare gli individui a rischio di trasmettere una malattia genetica Esempi: Ricerca dei portatori della malattia di Tay-Sachs, dell anemia falciforme, delle talassemie, della fibrosi cistica

20 IL test genetico

21 Definizione Per test genetico si intende la determinazione analitica orientata all identificazione di alterazioni correlate a malattie ereditarie.

22 Modi per effettuare un test genetico Un test genetico può essere effettuato: 1) Attraverso l analisi l diretta del DNA o RNA (Test Diretto) 2) Attraverso l analisi l di marcatori genetici co-ereditati con il gene che causa la malattia (Test Indiretto o per Linkage) 3) Attraverso l analisi l di metaboliti (Test Biochimico) 4) Attraverso l esame l dei cromosomi (Test Citogenetico)

23 Principali classi di mutazioni

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25 L innovazione tecnologica: il Gene-chip Frammenti di PCR contenenti gli esoni DMD sono spottati in triplicato su ogni array (alto-sinistra: esoni 1-24, alto destra esoni 25-48, bassosinistra esoni 49-72, basso-destra esoni Parte superiore = controllo sano. Parte inferiore = paziente DMD con delezione esoni 3-20

26 Recent developments of sequencing technologies Oggi, e possibile ottenere la sequenza completa di un genoma umano in circa 2 settimane e, a breve, a costi relativamente bassi ( $?)

27 Recent developments of sequencing technologies and medicine

28 Test Biochimico Con il test biochimico si analizza la quantita di un prodotto a valle del gene (non si guarda direttamente al gene o al cromosoma) Es Phenylketonuria. Malattia metabolica ereditaria If untreated, leads to mental retardation, seizures Affects 1 in 20,000 newborns Missing enzyme: Phenylalanine Hydroxylase Measure amount of Phenylalanine in baby s blood

29 Test citogenetico Cariotipo (a risoluzione normale ed ad alta risoluzione) Florescent in situ hybridization (Fish) Array CGH

30 Anomalie cromosomiche Sono responsabili del 50% degli aborti del 1 st trimestre di gravidanza 5% dei bambini/feti nati morti sono presenti in circa 0.5-1% su 200 nascite - Trisomia 21 - Sindrome di Down syndrome - Sindrome dell X Fragile Anomalie cromosomiche cellule somatiche sono presenti nei tumori

31 Anomalie cromosomiche Numeriche Riguardano cellule con un numero improprio di cromosomi normali Definiamo la ploidia. Euploidia multiplo esatto di N (N numero di cromosomi di un gamete normale). Diploidia 2N, triploidia 3N, tetraploidia 4N Aneuploidia- Monosomie, Trisomie Strutturali Riguardano cellule con uno o piu cromosomi anormali contenenti riarrangiamenti strutturali (delezioni, inserzioni, duplicazioni, inversioni, traslocazioni bilaciate e sbilanciate, cromosomi ad anello)

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33 Fluorescence in situ hybridization FISH

34 Locus-specific probes. Esempio Prader- Willi Diagnosi mediante FISH di una delezione interstiziale nella sindrome di PraderWilli utilizzando una sonda specifica per la regione critica sul cromosoma 15. Ch 15 centromere (green) Ch 15 PWS critical region (red)

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36 Tipi di test genetico Test diagnostico Test predittivo Test di carrier Test prematrimoniale Test prenatale Test genetici ausiliari

37 Test diagnostico E usato per confermare o escludere un disordine conosciuto o sospetto in un individuo sintomatico.? Malato

38 Test predittivo E offerto ad individui asintomatici con storia familiare di una malattia genetica. I test predittivi sono di due tipi: presintomatici (l eventuale sviluppo di sintomi è certo se la mutazione viene riscontrata; es Corea di Huntington) predisposizionali (l eventuale sviluppo dei sintomi è probabile ma non certo se la mutazione viene identificata; es. carcinoma della mammella) Portatore Sano Malato Portatore Sano?

39 Test di carrier E praticato al fine di identificare individui che hanno una mutazione genetica causa di malattie ereditarie recessive (autosomiche( o X linked). I carrier non hanno i sintomi della malattia. Il test è offerto a individui che hanno membri della famiglia affetti, membri della famiglia carrier o appartengono a comunità genetiche con una alta presenza di quella mutazione. Portatore Sano Portatore Sano Malato?

40 Diagnosi prematrimoniale Portatore Sano Portatore Sano?

41 Test prenatale Portatore Sano Viene eseguito durante la Portatore Sano gravidanza per determinare lo stato di salute di un feto. Il test genetico prenatale viene offerto quando c èc? un aumentato rischio di avere un bambino affetto a causa di storia familiare, età materna, analisi ecografica,, analisi biochimiche. I test si effettuano di routine attraverso amniocentesi e analisi dei villi coriali (CVS). Procedure più specializzate includono la Malato biopsia placentale,, il prelievo di sangue fetale e la biopsia cutanea fetale.

42 Test genetico preimpianto Il test preimpianto è effettuato su embrioni precoci (4-10 cellule) dopo fertilizzazione in vitro al fine di diminuire la possibilità che il feto soffra di una malattia genetica. Esso è generalmente offerto a coppie con una alta possibilità di avere un figlio con una malattia grave. Questo tipo di test si pone come alternativa alla diagnosi prenatale e al conseguente (a volte) aborto terapeutico.

43 Screening neonatale Esso identifica individui che hanno un aumentata possibilità di avere una specifica malattia genetica il cui trattamento può essere cominciato il prima possibile Gli screening neonatali sono di solito regolati da leggi nazionali e regionali, eseguiti alla nascita di routine a meno che ci sia uno specifico rifiuto da parte dei genitori

44 Test genetici ausiliari Test di paternità Test di zigosità Banca del DNA

45 Test di paternità In questo tipo di test vengono comparate sequenze di DNA di un adulto e di un bambino per stimare la probabilità che i due abbiano rapporti di parentela. La maggioranza delle richieste di questa analisi è di tipo sociale, ma alcune volte, lo stabilire la paternità, si rende necessario per l interpretazione l dei dati familiari

46 Test di Zigosità Il test di zigosità compara le sequenze di DNA di individui provenienti da una gestazione multipla (gemelli, triplette, ecc,) al fine di stabilire se sono monozigoti (identici) o dizigoti (fratelli). L indicazione medica risiede nei trapianti d organi d (fratelli monozigoti sono i donatori migliori) e nella suscettibilità a malattie (se un fratello monozigote è affetto l altro l è ad altissimo rischio)

47 Banca del DNA Questo è un servizio accessorio che può risultare utile. Esso consiste nella estrazione del DNA da cellule e dalla sua conservazione per test futuri. Il DNA è stabile per anni. Questo servizio può essere richiesto da: 1) Malati allo stadio terminale di una malattia, in cui si sospetti una componente genetica. In questi casi il test diagnostico potrebbe non essere utile al paziente, ma la conservazione dell informazione sul suo genoma potrebbe essere essenziale per l analisil dei suoi congiunti 2) Individui affetti da malattie per le quali non è ancora disponibile un test genetico 3) Persone che non vogliono sottoporsi attualmente al test, ma che si riservano di farlo in futuro Cellule GENETIC BANK DNA Infor mazio ni Genet iche

48 Benefici del Test Genetico Diagnosi Riduzione di test inutili Intervento medico appropriato (prevenzione complicazioni,, management del paziente, trattamento piu specifico e personalizzato) Informed decisions Scelte riproduttive. Evitare alla famiglia altri casi devastanti di malattie genetiche Reproductive choices

49 Rischi del test genetico Risk of miscarriage Psychological impact Family relations Insurance issues/concerns Privacy

50 La Diagnosi prenatale L obiettivo della diagnosi prenatale delle malattie genetiche è quello di offrire ai futuri genitori una diagnosi di certezza sul fatto che la malattia genetica in questione sia presente meno nel feto quando il rischio di una malattia genetica sia effettivamente elevato. Questo non equivale alla certezza di avere figli sani. La diagnosi prenatale permette di convertire il rischio per una specifica malattia in una certezza; non è in grado di coprire tutti i possibili difetti congeniti o tutte le malattie genetiche.

51 Invasive: La Diagnosi prenatale: Amniocentesi tecniche Prelievo villi coriali Cordocentesi Non invasive: Ecografia

52 Amniocentesi Prelievo di una piccola quantità (di solito 20ml) di liquido amniotico Viene eseguita di solito alla 16a settimana.. Le cellule presenti nel liquido amniotico possono essere utilizzate con l ibridazione in situ in Fluorescenza (FISH) o con le tecniche di citogenetica classica,, con tecniche biochimiche o con l analisi molecolare del DNA Disegno che illustra un amniocentesi.

53 Prelievo dei villi coriali (CVS) Prelievo di una quantità di corion frondosum che successivamente si trasformerà in placenta. I villi del corion fetale si separano poi dal tessuto materno. Viene eseguita di solito tra la 9a e la 12a settimana.. Le cellule possono essere utilizzate tal quale oppure coltivate e poi utilizzate con l ibridazione in situ in Fluorescenza (FISH), con le Tecniche di citogenetica classica,, con tecniche biochimiche o con l analisi molecolare del DNA La tecnica del prelievo transcervicale dei villi coriali.

54 Caratteristiche delle procedure di diagnosi prenatale

55 Cordocentesi Prelievo di sangue fetale, viene effettuato dalla 18a settimana in poi sotto guida ecografica attraverso un ago inserito nel cordone ombelicale. Viene effettuato per la ricerca di: isoimmunizzazione secondaria ad incompatibilità RH, per alterazioni ematologiche del feto o infezioni, oppure per eseguire rapidamente un cariotipo in presenza di anomalie congenite visibili all ecografia ecografia.

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57 Ecografia L ecografia è uno strumento di routine per valutare l etàl gestazionale,, per controllare la crescita fetale e per identificare gravidanze gemellari. Viene utilizzata per determinare il sesso del feto intorno alla 18-20a settimana di gestazione. L ecografia è fondamentale per diagnosticare le malformazioni anatomiche che sono spesso trasmesse in forma poligenica o multifattoriale,, ma non è in grado di identificare specifici difetti biochimici o molecolari

58 Quante malattie? Numero di malattie cui è applicabile un test genetico 524 GeneReviews 596 Laboratories testing for 2246 Diseases 1980 Clinical 266 Research 12/29/2010

59 Come si trova un laboratorio che effettua analisi genetiche per una determinata malattia genetica? Gene Tests Laboratory Directory ( European Directory of DNA Laboratories (EDDNAL) ( orpha.net/

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61 Cosa rende il test genetico differente dalle altre diagnosi? Fattore Tempo Fattore Terapia Fattore Individuo

62 Fattore Tempo Nella maggioranza dei casi una diagnosi strumentale o di laboratorio indica uno stato patologico presente o che si svilupperà di li a poco I test genetici possono predire patologie che si svilupperanno dopo molti anni. Una diagnosi molecolare prenatale di corea di Huntington effettuata OGGI, si riferisce ad un individuo che svilupperebbe la malattia tra anni Quali sono i reali benefici per un minore (o per la sua famiglia) di venire a conoscenza di una situazione patologica che si verificherà solo quando egli diventerà adulto? Diritto a sapere o diritto a non sapere?

63 Fattore Terapia Un test diagnostico è seguito generalmente da una terapia Per la maggioranza delle patologie di cui si può fare un test genetico non esiste, attualmente, una terapia. Il test genetico quindi tende maggiormente ad influenzare le prese di decisione del paziente (scelte riproduttive, di gestione familiare ecc) che le prese di decisione del medico.

64 Fattore Individuo La maggior parte degli interventi diagnostici non genetici è orientata ad un singolo individuo Nei test genetici la ricaduta diagnostica è anche su altri componenti del nucleo familiare

65 Fattore Individuo :: domande I genitori possono richiedere un test preclinico per un figlio minore? Una persona (anche un parente) ha il diritto di divulgare informazioni genetiche relative ad un'altra persona? Qualcuno ha il diritto, in alcuni casi, di chiedere la riservatezza sulle informazioni relative al proprio genoma? Se sì, quando?

66 Alcuni predizioni facili L innovazione tecnologica renderà il test genetico sempre più semplice e meno costoso Dalla diagnosi genetica di malattie monogeniche rare si passerà sempre più alla diagnosi di predisposizione per malattie multifattoriali frequenti

67 Scenari futuri: prospettive Considerata la natura multifattoriale delle malattie la cui componente genetica potrà essere identificata dai test, è ragionevole pensare che la tendenza terapeutica possa essere orientata alla modificazione dei comportamenti e degli stili di vita

68 Scenari futuri: il lavoro Per lavori particolarmente delicati, hanno i datori di lavoro il diritto di conoscere la predisposizione genetica dei loro occupati a sviluppare malattie la cui manifestazione potrebbe mettere a rischio la sicurezza o la vita di altre persone? Hanno i datori di lavoro il diritto di conoscere la predisposizione genetica dei loro occupati a sviluppare malattie scatenate dall esposizione a fattori presente nell ambiente di lavoro (agenti chimici, fisici, agenti che determinano stress psicofisico)?

69 Burlington Northern Santa Fe Railway Co Railroad will pay after genetic testing Workers were screened without their knowledge Friday, May 10, 2002 Burlington Northern Santa Fe Railway Co. will pay $2.2 million to 36 employees the railroad sought to genetically test in secret, settling the first federal challenge involving such testing and privacy. The Fort Worth, Texas-based railroad was accused in February 2001 of violating the Americans with Disabilities Act by testing or attempting to genetically test workers without their knowledge after they had submitted work-related injury claims. The gene used in the test was discovered and patented by Dr. Phillip Chance at the University of Washington. He told the Seattle Post- Intelligencer in an interview last year that he "never dreamed" it would be used to covertly test workers for carpal tunnel syndrome, as the railroad was accused of doing.