MISURA DELLA [Ca 2+ ] INTRACELLULARE IN VIVO

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1 MISURA DELLA [Ca 2+ ] INTRACELLULARE IN VIVO Per misurare la [Ca 2+ ] intracellulare ([Ca 2+ ] i ) si usano molecole fluorescenti:queste, colpite da un raggio di luce di una certa λ, emettono luce con λ maggiore. Qui sotto sono riportati il coloro (percezione visiva), la lunghezza d'onda λ, l'energia associata e la citotossicità. La luce UV (ultravioletta) non è percepibile dall'occhio. COLORE, λ, ENERGIA E CITOTOSSICITÀ Colore λ (nm) Energia (ev) Citotossicità UV Massima BLU VERDE ROSSO Minima IL MICROSCOPIO A FLUORESCENZA In Fig.1 è riportato lo schema di un microscopio a fluorescenza convenzionale. Fig. 1: rappresentazione schematica del microscopio a fluorescenza

2 Il filtro di eccitamento seleziona una certa λ. Per es., il filtro verde blocca tutta la luce tranne la luce verde; questa, tramite l'obiettivo, colpisce molecole fluorescenti sensibili al verde, che emettono luce con λ maggiori. Filtro verde cellula λ maggiori. Se sono interessato ad una particolare λ in emissione, per es. il rosso, metto un filtro rosso in emissione. Filtro verde cellula filtro rosso ciò che si vede è la luce rossa emessa dalle molecole fluorescenti Al fine di impedire che la luce di eccitamento influenzi la luce di emissione, viene usato uno specchio dicroico. Questo riflette la luce fino ad una certa λ ed è trasparente (fa passare) la luce con λ superiore. Per esempio (Fig. 2), lo specchio dicroico è costruito in modo tale da riflettere la luce verde (530 nm), che va ad illuminare la cellula. La luca emessa dalle molecole fluorescenti presenti nella cellula, con λ superiore, attraversa lo specchio dicroico e viene diretta al rilevatore (l'occhio, la telecamera, il fotomoltiplicatore). Rivelatore Si eccita nel verde e si valuta la luce emessa, per esempio nel rosso. 530 nm (verde) Obiettivo Fig. 2: rappresentazione schematica del percorso della luce in un microscopio a fluorescenza convenzionale.

3 COLORANTI PER IL CA 2+ Per misurare la [Ca 2+ ] i, si usano molecole fluorescenti F che cambiano le proprietà fluorescenti a seconda che siano o meno legate al Ca 2+. In genera, il legame è reversibile per cui le molecole fluorescenti F sono in equilibrio con il Ca 2+ F + Ca 2+ F-Ca 2+ Aumentando la [Ca 2+ ], aumenta la frazione legata al Ca 2+, e cambia in misura maggiore la fluorescenza emessa. Per esempio, se F è poco eccitabile e F-Ca 2+ è fortemente eccitabile, l intensità della luce è proporzionale alla [Ca 2+ ]. Un colorante di questo tipo è detto a singola eccitazione. Per esempio, il fluo 3 viene eccitato a 505 nm e si misura l'emissione a 530 nm. Il Fura-2 (Fig. 3) è una molecola fluorescente largamente utizzata per misurare la [Ca 2+ ] i ;presenta 5 acidi carbossilici, dei quali 4 legati a gruppi aminici ed è un derivato dell'egta e dell'etda (Figg. 4 e 5) Fig. 3. Il Fura-2.

4 Fig. 4. L'acido Etilendiaminotetraacetico (EDTA): un chelante del Ca 2+ e del Mg 2+ Fig. 5. L'EGTA: un chelante del Ca 2+ La valutazione della [Ca 2+ ] i mediante il Fura utilizza un metodo detto raziometrico. Il Fura-2 viene eccitato sequenzialmente a 2 lunghezze d'onda, rispettivamente 340 e 380 nm. L'emissione viene misurata ad una sola λ = 520 nm (nel verde). Man mano che il Fura si lega al Ca 2+ aumenta l intensità della luce emessa quando si eccita a 340 nm, mentre diminuisce l intensità della luce emessa quando si eccita a 380 nm (Fig. 6B e 7).

5 Se I 340 è l' intensità della luce emessa a 520 nm (nel verde), quando si eccita a 340 nm, e I 380 è l' intensità della luce emessa a 520 nm, quando si eccita a 380 nm, quando aumenta la [Ca 2+ ] intracellulare aumenta I 340 e diminuisce I 380. Viene quindi fatto il rapporto I 340 / I 380. Questo aumenterà se [Ca 2+ ] intracellulare aumenta (aumenta il numeratore e diminuisce il denominatore), diminuirà se [Ca 2+ ] intracellulare diminuisce (diminuisce il numeratore ed aumenta il denominatore). Tale metodo è detto raziometrico. Senza entrare nei dettagli, il metodo raziometrico è più sensibile e affidabile dei coloranti a singola eccitazione. A B C Telecamera Fotomoltiplicatore Fotomoltiplicatore Fig. 6. A: curva di affinità del Fura-2 per il Ca 2+. Variazioni della [Ca 2+ ] i sotto 20 nm o sopra 2 µm non producono variazioni nell'emissione di luce. B: il Fura libero ha un massimo di eccitamento a 380 nm, il complesso Fura-Ca 2+ ha un massimo a 340 nm. C: la luce emessa può essere inviata ad una telecamera o ad un fotomoltiplicatore. In Fig. 6A è riportata la curva di affinità del Fura-2 per il Ca 2+. Variazioni della [Ca 2+ ] i sotto 20 nm o sopra 2 µm non producono variazioni nell'emissione di luce.

6 Fig. 7. Emissione a 510 nm per diverse lunghezze d'onda e diverse concentrazioni di Ca 2+ Come far entrare le molecole fluorescenti nelle cellule? Viene sintetizzata un estere della molecola (Fig. 8): questo è elettricamente neutro, non fluorescente e può attraversare la membrana. Una volta entrata nella cellula, le esterasi intracellulari scindono la molecola, che diventa otticamente attiva e, in quanto elettricamente carica, resta confinata nella cellulala. Il metodo dell esterificazionedeesterificazione vale per molte molecole. Le molecole fluorescenti che non possono attraversare la membrana devono essere introdotte con metodi più complicati, per. es. una pipetta da patch. Fig. 8.Estere del Fura-2.