TRASMISSIONE MENDELIANA

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1 TRASMISSIONE MENDELIANA

2 OMIM TRASMISSIONE MENDELIANA Sino ad ora sono stati catalogati più di 5000 fenotipi umani, ereditati in maniera mendeliana. Più del 50% sono caratteri autosomici dominanti, il 36% sono autosomici recessivi e meno del 10% sono X-linked. Dei 5000 caratteri, circa 4000 sono associati a malattie. Di circa 600 di questi sono state identificate una o più mutazioni responsabili della malattia. NCBI: Natl Center of Biotechnology Information

3 Le malattie mendeliane sono causate dalla mutazione di un singolo gene che ha un notevole effetto sul fenotipo e sono ereditate in modo semplice simile o identico a quello descritto da Mendel. TRASMISSIONE MENDELIANA Le malattie mendeliane sono: 1. autosomiche: se i geni coinvolti si trovano su una delle 22 coppie di cromosomi autosomi. 2. X-linked: se i geni coinvolti si trovano sul cromosoma X Malattie dominanti: si manifestano negli eterozigoti (una copia di un allele normale) Malattie recessive: si manifestano in individui omozigoti per l allele mutato (doppia dose del gene anormale).

4 PCR: Polymerase Chain Reaction

5 PCR: Polymerase Chain Reaction

6 Ricerca di sequenze virali, batteriche ecc. PCR: applicazioni transilluminatore

7 primer radioattivo sintesi di DNA in presenza di dideossinucleotidi che terminano la catena Il sequenziamento secondo Sanger Elettroforesi autoradiografia Migrazione dei frammenti Sequenza del filamento complementare 2,3 dideossinucleotide

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10 Mappatura e sequenziamento di genomi completi: il genoma umano Sequenziamento automatico del DNA Filamento singolo di DNA Primer fluorescenti diversi con ciascun dideossinucleotide ddg dda ddc ddt Mescolamento dei prodotti Elettroforesi Fotomoltiplicatore Migrazione dei frammenti Raggio laser Fluorescenza Computer

11 Il sequenziamento automatico del DNA

12 Miscela di molecole a doppio filamento di DNA cellulare totale Ibridazione di acidi nucleici Denaturazione a 95 C Separazione dei filamenti Si usa per rivelare sequenze specifiche di acidi nucleici accoppiandoli alle basi di filamenti complementari di DNA o RNA. Aggiunta di una sonda radioattiva di DNA complementare ad una sequenza specifica di DNA cellulare Rinaturazione a 65 C Ibridazione della sonda radioattiva con sequenze complementari presenti nel DNA cellulari

13 La marcatura radioattiva delle sonde La sonda è uno specifico frammento di DNA, a sequenza nota, che si utilizza per individuare un frammento di DNA o gene di interesse in un pool di DNA totale. La sonda per essere utile allo scopo deve essere marcata ad esempio con il fosforo radioattivo P 32. Le sonde possono essere: corte (20-30 oligonucleotidi) oppure lunghe (es. 2-3 kb) La marcature delle due sonde avviene metodi diversi

14 La marcatura radioattiva delle sonde: sonde corte 22 oligo 5 - ACTTAGTAAGGCTTGGAACCTC g 32 ATP = A ap bp g 32 P + enzima: polinucleotide chinasi = 5 - g 32 P ACTTAGTAAGGCTTGGAACCTC - 3 La sonda è marcata

15 La marcatura radioattiva delle sonde: sonde lunghe La nick translation

16 Ibridazione di acidi nucleici Il DNA è digerito con una endonucleasi di restrizione Utilizzando una sonda marcata con radioattivo è possibile individuare DNA o geni di interesse in un pool di DNA totale attraverso l ibridazione. Migrazione I frammenti di restrizione di dimensione diverse sono separati mediante elettroforesi su gel. Carta assorbente Filtro Gel Spugna Soluzione salina Il DNA viene denaturato e trasferito su di un filtro mediante passaggio di una soluzione attraverso il gel Frammenti di DNA Filtro Il filtro viene ibridato ad una sonda radioattiva, che si lega a sequenze complementari di DNA La sonda legata al filtro è rivelata in autoradiografia Lastra autoradiografica

17 Identifica delezioni nella sequenza 1 2 C C 1 2 EcoRI EcoRI EcoRI EcoRI EcoRI EcoRI

18 Gli enzimi di restrizione Tabella. Alcuni enzimi di restrizione e i loro siti di taglio sul DNA Enzima Batterio Sito di taglio AluI Arthrobacter luteus 5 -A-G-C-T-3 3 -T-C-G-A-5 BamHI Bacillus amyloliquefaciens H 5 -G-G-A-T-C-C-3 3 -C-C-T-A-G-G-5 EcoRI Escherichia coli RY13 5 -G-A-A-C-C-T-3 3 -C-T-T-G-G-A-5 EcoRII Escherichia coli RY13 5 -C-C-T-G-G-3 3 -G-G-A-C-C-5 HaeIII Aemophilus aegyptius 5 -G-G-C-C-3 3 -C-C-G-G-5 HindIII Aemophilus influenzae b 5 -A-A-G-C-T-T-3 3 -T-T-C-G-A-A-5 PstI Providencia stuartii 5 -C-T-G-C-A-G-3 3 -G-A-C-G-T-C-5 SalI Streptomyces albus 5 -G-T-C-G-A-C-3 3 -C-A-G-C-T-G-5

19 Tecnologia DNA Ricombinante Enzimi di restrizione

20 ALBERO GENEALOGICO TRASMISSIONE MENDELIANA Coniugazionale Generazionale Fratria

21 TRASMISSIONE MENDELIANA AUTOSOMICA DOMINANTE Trasmissione verticale MATRIMONIO PROTOTIPO I II aa Aa III OGNI INDIVIDUO AFFETTO HA UN GENITORE AFFETTO 2. GLI INDIVIDUI AFFETTI ETEROZIGOTI SE SI UNISCONO IN MATRIMONIO CON INDIVIDUI SANI - OMOZIGOTI RECESSIVI - (condizione più frequente) HANNO IL 50% DI PROBABILITA DI TRASMETTERE LA MALATTIA AL FIGLIO a a A a Aa aa Aa aa 3. MASCHI E FEMMINE EREDITANO CON LA STESSA FREQUENZA LA MALATTIA CONGENITA 50% Aa affetto 50% aa sani

22 TRASMISSIONE MENDELIANA AUTOSOMICA DOMINANTE Trasmissione verticale MATRIMONIO MENO FREQUENTE MA POSSIBILE I II Aa Aa III DUE INDIVIDUI ETEROZIGOTI (meno frequente) CHE HANNO LA MALATTIA HANNO IL 75% DI PROBABILITA DI TRASMETTERE LA MALATTIA AL FIGLIO A a A a AA Aa Aa aa 75% 25% AA affetti gravi 50% Aa affetti 25% aa sani

23 TRASMISSIONE MENDELIANA AUTOSOMICA DOMINANTE Trasmissione verticale MATRIMONIO RARO I II AA Aa III DUE INDIVIDUI, UNO OMOZIGOTE DOMINANTE (raro) E L ALTRO ETEROZIGOTE, ENTRAMBI EFFETTI HANNO IL 100% DI PROBABILITA DI TRASMETTERE LA MALATTIA AI FIGLI A A A a AA Aa AA Aa 100% 50% AA affetti 50% Aa affetti

24 TRASMISSIONE MENDELIANA AUTOSOMICA DOMINANTE Esempi di caratteri a trasmissione autosomica dominante Fossetta sul mento Mascella asburgica o prognatismo Capacità di arrotolare la lingua Capelli lanosi

25 TRASMISSIONE MENDELIANA Capelli lanosi Autosomico dominante

26 MALATTIE AUTOSOMICHE DOMINANTI TRASMISSIONE MENDELIANA

27 Trasmissione: autosomica dominante Frequenza: 1 malato: 500 nati sani IPERCOLESTEROLEMIA FAMILIARE Patogenesi: mancata eliminazione delle LDL a livello epatico che determina un aumento dei livelli di LDL (e quindi colesterolo) in circolo e conseguenti gravi manifestazioni cliniche Causa: gli individui malati sono portatori di mutazioni sul gene che codifica per il recettore delle LDL (cromosoma 19). Il difetto genico si fa risentire soprattutto a livello degli epatociti, preposti all endocitosi e degradazione delle LDL circolanti. Aa AA N:220 mg/dl P: mg/dl P: mg/dl

28 IPERCOLESTEROLEMIA FAMILIARE HOOC RECETTORE LDL Gene: 45 Kb 839 aa NH 2

29 RECETTORE LDL IPERCOLESTEROLEMIA FAMILIARE LDL apolipoproteina core (esteri del colesterolo) La complessazione con l'ldl determina il "clustering" dei recettori che prendono contatto con la clatrina. Quest'interazione è necessaria alla formazione della fossetta rivestita e quindi all'internalizzazione delle LDL recettore per le LDL, riconosce la apolipoproteina presente su LDL fossetta rivestita clatrina vescicola rivestita

30 RECETTORE LDL IPERCOLESTEROLEMIA FAMILIARE recettore per LDL ri-esposto immagazzinamento (sotto forma di esteri del colesterolo) Vescicola rivestita vescicola di ricircolo endosoma sintesi di componenti della membrana cellulare, ormoni steroidei, acidi biliari ACAT Colesterolo libero Aminoacidi (metabolismo) lisosoma Acil-coenzima A-colesterolo aciltransferasi: acil-coa + colesterolo CoA + colesterolo estere

31 RECETTORE LDL IPERCOLESTEROLEMIA FAMILIARE esterificazione (immagazzinamento) del colesterolo enzima ACAT + - disponibilità eccessiva di colesterolo ribosomi apparato del Golgi enzima HMG-Coa reduttasi - RNA RER sintesi endogena del colesterolo DNA sintesi del recettore per le LDL La idrossimetilglutaril-coa reduttasi (o HMG-CoA reduttasi) è un enzima appartenente alla classe delle ossidoreduttasi che risiede nel reticolo endoplasmatico liscio degli epatociti (cellule del fegato)

32 RECETTORE LDL IPERCOLESTEROLEMIA FAMILIARE ' 3' Sequenze promotore trascrizione splicing traduzione Modificazioni posttraduzionali NH 2 HOOC Dominio di legame per LDL (292 aa) Dominio di omologia per l'egf (400 aa) Dominio di glicosilazione (58 aa) Dominio transmembrana (58 aa) Dominio citoplasmatico (50 aa)

33 RECETTORE LDL inserzione delezione nonsenso missenso IPERCOLESTEROLEMIA FAMILIARE Sono state finora evidenziate più di 400 mutazioni diverse sul gene che codifica per il recettore delle LDL che a livello fenotipico danno origine ad effetti raggruppabili in 5 classi G>A Cromosoma kb + 18 nt + 4 nt D splicing kb (duplicazione) -1 kb -4 kb -10 nt -5 kb -5 kb -7 kb -20 kb -25 kb

34 RECETTORE LDL IPERCOLESTEROLEMIA FAMILIARE I soggetti affetti da FH in condizioni di omozigosi, rappresentano un modello sperimentale prezioso per lo studio della funzionalità del gene, in quanto permettono di analizzare le alterazioni a carico del recettore LDLR, causate dall allele mutante, in assenza completa degli effetti di fondo prodotti dall allele normale. Questi studi sono effettuati mediante un modello in vitro nel quale si valuta l interazione tra fibroblasti in coltura (ottenuti da biopsie cutanee di soggetti omozigoti per mutazioni perfettamente caratterizzate dal punto di vista molecolare) e LDL marcate. Si è così stabilito che esistono 5 diverse classi di fenotipi difettivi, secondo la fase del meccanismo di funzionamento del recettore LDLR che è compromessa. Precisamente: Classe 1: fenotipo allele nullo Classe 2: fenotipo trasporto difettivo Classe 3: fenotipo legame difettivo Classe 4: fenotipo internalizzazione difettiva Classe 5: fenotipo riciclo difettivo

35 IPERCOLESTEROLEMIA FAMILIARE RECETTORE LDL CLASSE 1: FENOTIPO «ALLELE NULLO» Legame ligando EGF omology O-gli trans citoplasm Mancata sintesi (recettore negativo) DELEZIONE -20 kb No mrna No recettore Mancanza del promotore che impedisce la trascrizione dell'allele mutato (allele nullo) Deficit quantitativo del recettore LDL sulla superficie delle cellule

36 IPERCOLESTEROLEMIA FAMILIARE RECETTORE LDL CLASSE 1: FENOTIPO «ALLELE NULLO» Legame ligando EGF omology O-gli trans citoplasm Mancata sintesi (recettore negativo) NONSENSO Sì mrna No recettore mrna contiene codoni di stop (allele nullo) Deficit quantitativo del recettore LDL sulla superficie delle cellule

37 RECETTORE LDL IPERCOLESTEROLEMIA FAMILIARE O-gli CLASSE 2: FENOTIPO «TRASPORTO DIFETTIVO» b. mancata N- o O-glicosilazione MSSENSO missenso Mutazione missenso nell esone 15 che comporta la mancata modificazione posttraduzionale nel Golgi. La mancata glicosilazione O-linked impedisce ai recettori LDL di raggiungere la membrana citoplasmatica. Oppure mutazioni che non consentono la glicosilazione N-linked nel RER (no trasporto nel Golgi) Alterazione delle modificazioni post-traduzionali HOOC

38 RECETTORE LDL IPERCOLESTEROLEMIA FAMILIARE CLASSE 3: FENOTIPO «LEGAME DIFETTIVO» a. anomala interazione recettore-ligando DUPLICAZIONE kb Duplicazione degli esoni 3-6 che determina la duplicazione del dominio di legame del recettore LDL. Nel RER la proteina è altamente instabile ed è frequentemente degradata o inserita sulle membrane del RER con molta difficoltà. Il recettore è trasportato alla membrana cellulare ma ha poca affinità con LDL (30% del wild type) NH 2 Duplicazione del dominio di legame HOOC

39 RECETTORE LDL IPERCOLESTEROLEMIA FAMILIARE CLASSE 3: FENOTIPO «LEGAME DIFETTIVO» b. anomala interazione recettore-ligando DELEZIONI MISSENSO missenso delezioni Delezioni negli esoni 3, 4 e 7,8 che eliminano rispettivamente i repeats 2, 3, 4, 5, e A e B nel recettore LDL. La mancanza di questi repeats riduce l affinità del recettore con le LDL. Mutazioni missenso negli stessi esoni che eliminano dei reapet. 7 r e p e a t 3 r e p e a t

40 RECETTORE LDL IPERCOLESTEROLEMIA FAMILIARE CLASSE 4: FENOTIPO «INTERNALIZZAZIONE DIFETTIVA» Trans Cit a. Deficit recettoriale MISSENSO Mutazione missenso (Tyr790 in Cys) nella sequenza del dominio citoplasmatico Il recettore ha una lunghezza corretta ma perde la struttura 3D e non può interagire con la clatrina. No internalizzazione Tyr Cys

41 RECETTORE LDL IPERCOLESTEROLEMIA FAMILIARE CLASSE 4: FENOTIPO «INTERNALIZZAZIONE DIFETTIVA» Trans Cit b. Assenza recettoriale NONSENSO Mutazione nonsenso nella sequenza del dominio intracellulare Stop Il recettore non reagisce correttamente con la clatrina e non consente il clustering dei recettori. No internalizzazione

42 RECETTORE LDL IPERCOLESTEROLEMIA FAMILIARE EGF omology CLASSE 5: FENOTIPO «RICICLO DIFETTIVO» missenso Deficit recettoriale DELEZIONI MISSENSO delezioni Mutazioni missenso o delezioni nei repeats della sequenza del dominio di omologia per l EGF Il recettore dopo internalizzazione non ritorna sulla membrana. No riciclaggio 7 r e p e a t 3 r e p e a t

43 IPERCOLESTEROLEMIA FAMILIARE RECETTORE LDL 1. Allele nullo 3. Assenza di legame 5. Assenza di riutilizzazione 2. Trasporto assente 4. Assenza di internalizzazione

44 IPERCOLESTEROLEMIA FAMILIARE RECETTORE LDL D200g (FH Padova-1): la più frequente in Italia. Mutazione missenso esone 4: A:G = D200g= acido aspartico in glicina FH Ferrara-1: Ex 4 c.557 del G

45 RECETTORE LDL IPERCOLESTEROLEMIA FAMILIARE - Classe 1: fenotipo allele nullo Classe 2: fenotipo trasporto difettivo Classe 3: fenotipo legame difettivo Classe 4: fenotipo internalizzazione difettiva Classe 5: fenotipo riciclo difettivo

46 IPERCOLESTEROLEMIA FAMILIARE Il deposito di colesterolo a livello della valvola aortica può provocare una stenosi aortica sintomatica con conseguente infarto del miocardio. I sintomi si sviluppano nella seconda (omozigoti) o terza/quarta decade di vita (etrozigoti). All'età di sessant'anni più dell' 85% degli eterozigoti ha avuto un infarto miocardico.

47 DIAGNOSI IPERCOLESTEROLEMIA FAMILIARE SANGUE: 1. analisi della concentrazione del colesterolo; 2. elettroforesi delle LDL MOLECOLARE: è importante conoscere il tipo di mutazione nell ambito delle etnie (effetto del fondatore). PCR o IBRIDAZIONE IN SOUTHERN BLOT (previa digestione enzimatica del DNA con enzimi di restrizione) DIAGNOSI NEONATALE SANGUE DAL CORDONE OMBELICALE: 1. analisi della concentrazione del colesterolo (risulta doppio o triplo negli eterozigoti e 6-8 volte > negli omozigoti); 2. elettroforesi delle LDL MOLECOLARE: è importante conoscere il tipo di mutazione nell ambito delle etnie (effetto del fondatore). PCR o IBRIDAZIONE IN SOUTHERN BLOT (previa digestione enzimatica del DNA con enzimi di restrizione) DIAGNOSI PRENATALE CELLULE DEL LIQUIDO AMNIOTICO E CARATTERIZZAZIONE MOLECOLARE

48 Trasmissione: autosomica dominante COREA DI HUNTINGTON Descritta da George Huntington nel 1872 còrea (greco) = danza Frequenza: 1 malato: nati sani Patogenesi: malattia neurodegenerativa; manifestazioni cliniche a livello neurologico e motorio. Causa: gli individui malati sono portatori di mutazioni sul gene che codifica per la proteina huntingtina (cromosoma 4). Il difetto genico si fa risentire a livello dei neuroni. Gene HTT o IT-15. Scoperto nel 1993; codifica per l huntingtina (3144aa) CAG repeat glutammine La proteina è necessaria per la sopravvivenza dei neuroni.

49 COREA DI HUNTINGTON gene normale huntingtina normale neurone sano CAG repeat glutammine > 35 CAG repeat poliglutammina gene mutato huntingtina mutata neurone malato

50 HUNTINGTINA COREA DI HUNTINGTON

51 HUNTINGTINA COREA DI HUNTINGTON

52 HUNTINGTINA COREA DI HUNTINGTON BDNF BDNF: brain-derived neurotrophic factor

53 HUNTINGTINA COREA DI HUNTINGTON

54 ANTICIPAZIONE COREA DI HUNTINGTON

55 COREA DI HUNTINGTON DIAGNOSTICA MOLECOLARE PCR SEQUENZIAMENTO AUTOMATICO

56 OSTEOGENESI IMPERFETTA Trasmissione: autosomica dominante Frequenza: 1 malato: nati sani Patogenesi: malattia apparato scheletrico (fragilità ossea). Causa: gli individui malati sono portatori di mutazioni sul gene che codifica per il collagene, tipo 1, alfa 1 (cromosoma 17). Il difetto genico si fa risentire a livello degli osteoblasti. Two RNA of 5,8 kb and 4,8 kb differing by their Ô3 terminus non coding sequence and giving rise to a single 140 kda protein. The COL1A1 gene is 18 kb in size and is composed of 52 exons. Exons 6 to 49 encode the alpha helical domain aa Type I collagen is the most abundant protein in vertebrates and a constituent of the extra cellular matrix in connective tissue of bone, skin, tendon, ligament and dentine. It is mostly produced and secreted by fibroblasts and osteoblasts. Member of the collagen family.

57 OSTEOGENESI IMPERFETTA

58 OSTEOGENESI IMPERFETTA Collagene: Proteina a struttura quaternaria Col1alfa1 sul cromosoma 17 Col1alfa2 sul cromosoma 7

59 Sintesi del collagene OSTEOGENESI IMPERFETTA

60 2 fenotipi patologici OSTEOGENESI IMPERFETTA OI tipo 1: allele null. Le mutazioni sono diverse: delezioni e inserzioni in più esoni, mutazioni nonsenso e di splicing; viene prodotto il 50% in meno di collagene. Compatibile con la vita. Gli individui affetti hanno fragilità ossea e sono suscettibili a fratture multiple delle ossa lunga delle gambe, dello sterno e delle ossa piccole delle mani e piedi. In 50% dei casi perdita di udito a partire dalla seconda decade di vita. Sclera blu. OI tipo 2: allele mutato. E una malattia molto grave che porta alla morte nelle prime settimane o mesi di vita (ancora prima della nascita numerose fratture delle ossa in tutto il corpo). Il difetto dipende da mutazioni puntiformi de novo (sostituzioni di glicine) o riarrangiamenti negli alleli alfa1 o alfa2. Le mutazioni in COOH più gravi che in NH2. Le fibre non si assemblano correttamente e vengono degradate, oppure se si assemblano non funzionano correttamente Allele null: delezioni, inserzioni, mutazioni splicing, nonsenso Allele mutato: mutazioni puntiformi, riarrangiamenti

61 OSTEOGENESI IMPERFETTA OI1 OI2

62 MALATTIE AUTOSOMICHE RECESSIVE TRASMISSIONE MENDELIANA 1. Le malattie autosomiche recessive sono caratterizzate da manifestazioni cliniche soltanto negli individui omozigoti per il gene mutante. 2. Il pedigree tipico è orizzontale in quanto gli individui affetti tendono a rimanere limitati ad una singola fratria e la malattia non si presenta nelle generazioni successive. 3. I maschi e le femmine sono affetti con uguale probabilità.

63 GAMETI MATERNI GAMETI MATERNI Ereditarietà autosomica recessiva altre possibili combinazioni A. NORMALE AFFETTO B. ETEROZIGOTE AFFETTO GENITORI MEIOSI GAMETI Portatori eterozigoti obbligati ETEROZIGOTE GAMETI PATERNI FECONDAZIONE PROLE ETEROZIGOTI AFFETTI GAMETI PATERNI Tutti A = NORMALE, a = MUTANTE A = NORMALE, a = MUTANTE

64 GAMETI MATERNI Fibrosi cistica, Anemia falciforme, Talassemie, Ereditarietà autosomica recessiva ETEROZIGOTI GENITORI MEIOSI GAMETI FECONDAZIONE PROLE NORMALE AFFETTA ETEROZIGOTI GAMETI PATERNI A = NORMALE, a = MUTANTE

65 MALATTIE AUTOSOMICHE RECESSIVE TRASMISSIONE MENDELIANA

66 La fibrosi cistica è un carattere recessivo 1/2.000 La fibrosi cistica (CF, Cystic Fibrosis) (MIM/OMIM ) è una patologia genetica disabilitante e letale che si eredita come carattere autosomico recessivo; colpisce le ghiandole esocrine (mucose muco- e sierose-enzimi della digestione- e del sudore). Se le ghiandole del sudore non funzionano bene rilasciano una quantità eccessiva di sale. La malattia viene spesso diagnosticata analizzando la quantità di sale nel sudore. In base ad alcune leggende popolari, le nutrici un tempo leccavano la fronte dei neonati: se il sudore aveva un sapore troppo salato, predicevano che il bambino sarebbe morto prematuramente di congestione polmonare. La malattia ha effetti ad ampio spettro perché le ghiandole colpite svolgono alcune importanti funzioni vitali. La CF comporta la produzione di un muco spesso, che ostruisce i dotti che portano gli enzimi della digestione dal pancreas all intestino tenue, riducendo gli effetti della digestione. Come conseguenza, i bambini colpiti spesso soffrono di malnutrizione, nonostante un aumento di appetito e di quantità di cibo consumato. Col progredire della malattia, si formano delle cisti nel pancreas e la ghiandola degenera in una struttura fibrosa, che dà il nome alla malattia. Dal momento che il muco spesso provocato dalla CF blocca anche le vie aeree dei polmoni, la maggior parte dei pazienti colpiti da fibrosi cistica sviluppa patologie ostruttive dei polmoni e infezioni, che portano a morte prematura. Quasi tutti i casi di CF si registrano in figli di genitori fenotipicamente normali, eterozigoti. ghiandola sudoripara ovaio utero (il muco blocca l ingresso dell utero) cervice Ha una frequenza molto alta: 1/2000 Diversa incidenza tra le popolazioni: 1/25 portatori sani tra gli americani; 1/46 ispanici; 1/65 afroamericani; 1/150 asiatici. Molto grave, molto debilitante, invalidante e porta alla morte. parotide polmone fegato pancreas cistifellea intestino deferente testicolo (il muco blocca i dotti che portano lo sperma, e solo circa il 2-3% dei maschi colpiti è fertile).

67 Il prodotto del gene CF è una proteina che si inserisce nella membrana plasmatica di alcune cellule ghiandolari. La proteina è chiamata regolatore della conduttanza transmembrana della fibrosi cistica o CFTR. Il CFTR regola il flusso di ioni cloro attraverso la membrana plasmatica della cellula. FIBROSI CISTICA pb 1480 aa Gene CFTR:

68 FIBROSI CISTICA Negli individui affetti da CF la proteina CFTR è assente o difettosa. Dal momento che i fluidi si muovono attraverso le membrane del plasma in risposta a movimenti degli ioni, una proteina CFTR difettosa comporta una diminuzione dei fluidi che devono aggiungersi alla secrezione delle ghiandole. Le secrezioni ispessite provocano i sintomi caratteristici della CF. Esone 10 Mutazione delta F508: delezione 70% dei casi Una delezione CTT nell esone 10 causa la perdita di una fenilalanina nella posizione 508 della proteina. La isoleucina nella posizione 507 rimane inalterata perché ATC e ATT entrambi codificano per una isoleucina.

69 MALATTIE AUTOSOMICHE RECESSIVE

70 MALATTIE AUTOSOMICHE RECESSIVE

71 MALATTIE AUTOSOMICHE RECESSIVE Terza, quarta settimana: sacco vitellino e fegato rispettivamente Inizio secondo trimestre: milza Fine secondo trimestre: ossa Adulta: alfa/beta 97/98% - HbA1 alfa/delta 2/3% - HbA2 alfa/gamma <1% - HbF (beta) alfa (beta) (alfa)

72 MALATTIE AUTOSOMICHE RECESSIVE

73 MALATTIE AUTOSOMICHE RECESSIVE

74 ANEMIA FALCIFORME: 1: 500 (afroamericani) MALATTIE AUTOSOMICHE RECESSIVE Sickle=falce HbS L'anemia falciforme è una malattia ereditaria, che si esprime in forma conclamata solo negli omozigoti, vale a dire nei figli che ricevono il gene anomalo da entrambi i genitori. Negli omozigoti la Hb-S é la sola forma di emoglobina presente negli eritrociti. Gli omozigoti non vivono generalmente oltre l'età di 25 anni.

75 MALATTIE AUTOSOMICHE RECESSIVE ANEMIA FALCIFORME Effetto pleiotropico

76 MALATTIE AUTOSOMICHE RECESSIVE ANEMIA FALCIFORME ESONE 1, CODONE 6

77 ANEMIA FALCIFORME MALATTIE AUTOSOMICHE RECESSIVE

78 MALATTIE AUTOSOMICHE RECESSIVE ANEMIA FALCIFORME MstII MstII HbA 364 pb 201 pb 90 pb 74 pb HbS 291 pb 74 pb

79 MALATTIE AUTOSOMICHE RECESSIVE ANEMIA FALCIFORME CTC transizione TTC: mrna=aag=lisina Malattia da emoglobina C: anemia lieve, l emoglobina precipita solo quando è in alte concentrazioni

80 ANEMIA FALCIFORME MALATTIE AUTOSOMICHE RECESSIVE Dominanza incompleta Gli eterozigoti, cioè i figli che ricevono il gene anomalo da uno solo dei genitori, posseggono il 50% di Hb-S ed il 50% di Hb-A. In essi l'anemia falciforme è asintomatica, salvo crisi sporadiche che possono verificarsi in condizioni di bassa tensione di O2 (montagna, sott acqua, anestesia): maschio falciforme (sickle cell trait).

81 ANEMIA FALCIFORME MALATTIE AUTOSOMICHE RECESSIVE

82 MALATTIE AUTOSOMICHE RECESSIVE TALASSEMIA Comuni in tutto il mondo; ma soprattutto mediterraneo e sud est asiatico (20-30% affetti) Talassa=mare Mediterraneo)

83 Malattie monofattoriali: ereditarietà autosomica recessiva. Talassemie Sono un gruppo si malattie ereditarie determinate da anomalie nell emoglobina, nelle quali il fenotipo deriva da un alterazione del rapporto reciproco tra globine alfa e beta. La sintesi di una delle globine può essere ridotta o anche assente, causando la formazione di molecole di emoglobina aberranti con uno squilibrio tra le subunità. Questo tipo di molecole non lega l ossigeno efficientemente e determina effetti gravi se non addirittura fatali. Le talassemie sono comuni in diverse aree del mondo, soprattutto nel Mediterraneo e nel Sud Ovest asiatico, dove il 20-30% della popolazione risulta affetta. Il nome talassemia deriva dal greco thalassa, ovvero mare, quindi il nome della malattia enfatizza una condizione caratteristica di individui del bacino del Mediterraneo.

84 Malattie monofattoriali: ereditarietà autosomica recessiva. Talassemie Le talassemie sono anomalie ereditarie della produzione di emoglobina in cui il problema principale è un difetto quantitativo della alfa-globina (alfa Talassemia) o della beta-globina (beta Talassemie). Come nel caso dell anemia falciforme la distribuzione della Talassemia coincide con quella della malaria. L alfa Talassemia è caratterizzata da un difetto relativo di sintesi delle catene alfa-globiniche, con normale produzione di catene beta. Se alcune catene alfa possono ancora essere prodotte, si formerà una piccola quantità di tetrameri normali, ma ci sarà un forte eccesso di catene beta. In queste circostanze beta è in grado di formare omotetrameri (beta 4 ). Questa emoglobina detta emoglobina H (HbH), può essere visualizzata sotto forma di corpi inclusi all interno dei globuli rossi degli individui affetti da alfa-talassemia. La HbH ha una capacità marcatamente ridotta di trasportare ossigeno. La conseguenza di questo eccesso di catene beta e del difetto di catene alfa è che i globuli rossi hanno dimensioni e numero ridotti, con conseguente anemia. Nella beta-talassemia c è un difetto delle catene beta. In queste circostanze l alfa globina è in eccesso forma degli omotetrameri che precipitano in aggregati moto insolubili. Gli eritrociti vengono distrutti precocemente distruzione nel midollo osseo e milza. tetrameri ab ba Normale alfa-tal beta-tal ab ba ab ba ab ba b bb bb bb bb b ab ba aa aa aa aa a a aa aa globuli rossi Corpi inclusi di beta 4 (HbH) Precipitazione di alfa 4 (molto insolubile)

85 Malattie monofattoriali: ereditarietà autosomica recessiva. Talassemie Ci sono due tipi di Talassemie: 1. Talassemia alfa, in cui la sintesi della globina alfa è ridotta o assente; 2. Talassemia beta, che riguarda la sintesi ridotta o assente della globina beta. In entrambi i casi vi possono essere cause differenti e benché queste condizioni siano ereditabili come caratteri autosomici recessivi, entrambe le forme di talassemia danno effetti fenotipici in eterozigosi.

86 TALASSEMIA alfa MALATTIE AUTOSOMICHE RECESSIVE

87 TALASSEMIA alfa MALATTIE AUTOSOMICHE RECESSIVE

88 Malattie monofattoriali: ereditarietà autosomica recessiva. Beta-talassemie Nelle beta Talassemie si riscontra un deficit delle catene beta. Minor Tal-minor asintomatici Sintomatica, anemia significativa ma non richiede trasfusioni Major Trasfusione dipendenti Morbo di Cooley (precipitazione tetrameri)

89 MALATTIE AUTOSOMICHE RECESSIVE TALASSEMIA beta Mutazione comune in Sardegna e Sicilia T39 (codone 39) CAG glutammina con TAG stop: talassemia beta 0 Solo 10% prodotta con mutazione nel promotore Almeno 100 mutazioni Le mutazioni nella frazione COOH sono meno dannose

90 MALATTIE AUTOSOMICHE RECESSIVE TALASSEMIA beta Nel mediterraneo e in Italia la più frequente: Tal beta+ Mutazione puntiforme introne 1

91 TALASSEMIA beta MALATTIE AUTOSOMICHE RECESSIVE

92 TRASMISSIONE X-LINKED IL CROMOSOMA Y: 70 geni IL CROMOSOMA X: 1200 geni I maschi sono emizogoti

93 IL CROMOSOMA X LAYONIZZAZIONE

94 IL CROMOSOMA X LYONIZZAZIONE L ipotesi di Lyon stabilisce che nelle cellule somatiche: a) L inattivazione del cromosoma X si verifica precocemente durante la vita embrionale (stadio di blastocisti avanzata, nell uomo). b) L inattivazione è casuale. c) L inattivazione dell X è completa. d) L inattivazione è permanente e si propaga clonalmente.

95 LYONIZZAZIONE IL CROMOSOMA X XIST= X Inactivation Specific Transcript RNA= 15 kb

96 Il fenomeno della lyonizzazione Eccezioni all ipotesi di Lyon a) Sebbene l inattivazione sia solitamente casuale, un cromosoma X strutturalmente anomalo, ad es. delezione, viene inattivato preferenzialmente. b) Sebbene l inattivazione della X sia estensiva, tuttavia non è completa; sono noti almeno 16 umani che sfuggono all inattivazione. Allele A= codifica l enzima che converte eumelanina in feomelanina (rosso) Allele a= manca enzima (nero)

97 Mosaicismo e chimere I mosaici posseggono due o più linee cellulari geneticamente differenti, che derivano da un unico zigote. La mutazione genetica indicata può essere una mutazione genica, una mutazione cromosomica numerica o strutturale o, nel caso particolare della lyonizzazione, l inattivazione dell X. Una chimera deriva da due zigoti, che solitamente sono entrambi normali, ma geneticamente differenti.

98 Mosaicismo dell occhio Mosaicismo della pelle

99 Ereditarietà X-linked Le malattie X-linked sono provocate da geni mutati sul cromosoma X. I geni mutati X-linked sono completamente espressi nei maschi che hanno un solo cromosoma X e sono quindi emizigoti per i geni X-linked (eredità diaginica). Una malattia prodotta da un gene mutato X-linked può essere o non essere espressa clinicamente nelle femmine eterozigoti (fenomeno della lyonizzazione). Le malattie che raramente hanno una espressione clinica nelle femmine eterozigoti sono X-linked recessive, mentre le eterozigoti per malattie X- linked dominanti solitamente sono affette in modo lieve e variabile dei maschi Non esistono malattie legate all Y I geni legati all Y codificano caratteri non essenziali o funzioni strettamente maschili, ed è improbabile che loro difetti causino alterazioni patologiche, a parte l infertilità maschile. Trasmissione olandrica dei caratteri.

100 Ereditarietà X-linked dominante: es. Ipofosfatemia = bassi livelli di fosfato nel sangue = deformità dello sheletro: rachitismo 1. Gli individui maschi affetti generano solo figlie femmine affette e nessun figlio maschio affetto: 1 X Y X XX XY 2 X XX XY 2. Una femmina eterozigote affetta trasmetterà il carattere a metà dei suoi figli e maschi e femmine ne saranno ugualmente affetti X Y X XX XY X XX XY

101 Ereditarietà X-linked dominante 1 3. Come atteso una femmina omozigote trasmetterà il carattere a tutti i suoi figli 2 X Y X XX XY 3 X XX XY

102 Variazioni del modello di ereditarietà La letalità dei maschi Le condizioni legate all X letali nei maschi Per alcune condizioni dominanti legate all X l assenza dell allele normale è letale prime della nascita. Quindi non nascono maschi affetti e si osserva la malattia solo nelle femmine, che la trasmettono a metà delle loro figlie femmine. 2. Una femmina eterozigote affetta trasmetterà il carattere a metà dei suoi figli e maschi e femmine ne saranno ugualmente affetti X Y X XX XY I maschi affetti vengono abortiti spontaneamente X XX XY

103 Ereditarietà X-linked recessiva

104 GAMETI MATERNI GAMETI MATERNI Ereditarietà X-linked recessiva L ereditarietà X-linked può essere meglio compresa seguendo il cromosoma X. L incrocio meno comune è tra una donna Un secondo incrocio tipico è tra un uomo omozigote e un uomo normale affetto e una donna omozigote normale. A. FEMMINA OMOZIGOTE MASCHIO NORMALE B. FEMMINA NORMALE MASCHIO AFFETTO GENITORI MEIOSI GAMETI FECONDAZIONE PROLE FEMMINA ETEROZIGOTE M. MASCHIO AFFETTO AFFETTO FEMMINA ETEROZIGOTE FEMMINA ETEROZIGOTE MASCHIO NORMALE X A X a X A X a X A GAMETI PATERNI Le femmine trasmettono l X a tutti i figli GAMETI PATERNI I maschi trasmettono l X a tutte le figlie femmine A = NORMALE, a = MUTANTE

105 GAMETI MATERNI Ereditarietà X-linked recessiva L ereditarietà X-linked può essere meglio compresa seguendo il cromosoma X. L incrocio più comune è tra una donna portatrice eterozigote e un uomo normale C. FEMMINA ETEROZIGOTE MASCHIO NORMALE GENITORI MEIOSI GAMETI FECONDAZIONE PROLE F NORMALE M. MASCHIO NORMALE AFFETTO FEMMINA ETEROZIGOTE GAMETI PATERNI Le femmine trasmettono l X al 50% dei figli. Maschi e femmine

106 Daltonismo Cecità al rosso e al verde Ereditarietà X-linked recessiva Europa occidentale: 8% maschi, 0,7% femmine

107 Daltonismo Ereditarietà X-linked recessiva fotopsine

108 Daltonismo Ereditarietà X-linked recessiva

109 Emofilia A Ereditarietà X-linked recessiva

110 Ereditarietà X-linked recessiva Emofilia A Gene mutato: Fattore VIII della coagulazione Manca la conversione del fibrinogeno (solubile) in fibrina (insolubile)

111 Ereditarietà X-linked recessiva Emofilia A VIII

112 Emofilia A Ereditarietà X-linked recessiva

113 Ereditarietà X-linked recessiva Emofilia A 142 pb 99 pb 43 pb

114 Ereditarietà X-linked recessiva Diastrofia muscolare 1/3500 maschi Degenerazione muscolare Esito infausto nell arco dei primi 20 anni Femmine eterozigoti normali (casi in omozigosi)

115 Ereditarietà X-linked recessiva Distrofina Gene distrofina Occupa l 1% del cromosoma X

116 Ereditarietà X-linked recessiva 60% delezioni 30% mutazioni puntiformi 10% duplicazioni intrageniche

117 Ereditarietà X-linked recessiva Fibre muscolari Distrofina Normale Becker Duchenne Fila 1-2: D. Becker Fila 3: Normale File 4-5: D. Duchenne Western blot

118 Ereditarietà X-linked recessiva

119 Ereditarietà mitocondriale matrilineare

120 matrilineare Ereditarietà mitocondriale

121 Ereditarietà mitocondriale

122 Ereditarietà mitocondriale

123 Ereditarietà mitocondriale

124 Ereditarietà mitocondriale

125 Ereditarietà mitocondriale Riarrangiamenti del DNA mitocondriale (delezioni)** Sindrome di Kearns-Sayre (KSS) Oftalmoplegia Esterna Progressiva (PEO) Sindrome di Pearson (anemia sideroblastica e malassorbimento connatali) Mutazioni puntiformi* Neuropatia ottica ereditaria di Leber (LHON) Sindrome di NARP (neuropatia, atassia, retinite pigmentosa) Sindrome MILS (Sindrome di Leigh ereditata per via matrilineare) Encefalopatia mitocondriale con acidosi lattica e strokes (MELAS) Mioclono-epilessia con fibre "ragged-red"(merrf) Miopatia e cardiomiopatia (MIMYCA)

126 Ereditarietà mitocondriale

127 Ereditarietà mitocondriale

128 Ereditarietà mitocondriale

129 Ereditarietà mitocondriale Soltanto le femmine possono trasmettere le malattie mitocondriali e passano la mutazione a tutti i figli di entrambi i sessi. Le malattie mitocondriali sono spesso caratterizzate da miopatie ed encefalopatie (il cuore, i muscoli scheletrici e il sistema nervoso centrale dipendono maggiormente dalla fosforilazione ossidativa). Il pedigree di una famiglia con una encefalopatia mitocondriale. Si osservi la trasmissione materna a tutti i figli maschi che femmine e l assenza della trasmissione per via paterna.