INVESTIGARE LA SUSCETTIBILITA GENETICA AL CANCRO Il caso del carcinoma del tratto testa-collo HNSCC

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1 INVESTIGARE LA SUSCETTIBILITA GENETICA AL CANCRO Il caso del carcinoma del tratto testa-collo HNSCC

2 HNSCC Carcinoma a cellule squamose del tratto testa-collo Forma tumorale comune tra le dieci più frequenti nel Mondo da sola causa il 6.5% dei decessi per cancro Aumenta con l età in genere a partire dalla quinta decade di vita Incidenza maggiore nei maschi con un rapporto 10:1

3 Fattori etiologici conosciuti cattiva igiene orale e infezioni virali consumo di tabacco e di alcol

4 Il cancro è una patologia complessa In molti casi dipende dall esposizione a fattori ambientali fumo, asbesto In alcuni casi dipende da fattori genetici BRCA1, RB1

5 Il cancro è una patologia complessa In molti casi dipende dall interazione di fattori ambientali con i fattori genetici Molti geni possono essere considerati come fattori di rischio XPD+UV

6 La variabilità genetica Molti geni esistono in forme diverse detti alleli Un solo GENOMA Ogni persona ha essenzialmente lo stesso pacchetto di geni Molti GENOTIPI diversi Ogni persona ha un diverso pacchetto di alleli

7 Malattie genetiche Bassa frequenza nella popolazione (<1%) Difetto genetico con effetti pesanti Alta penetranza Ricorrente nelle famiglie

8 Malattie genetiche Spesso la malattia segue uno schema di trasmissione mendeliano Autosomico X-linked Si può studiare nelle famiglie Dominante Codominante Recessivo Mutazioni di BRCA1

9 Suscettibilità genetica Frequenza nella popolazione variabile (1-50%) Variazioni genetiche con effetto modesto Bassa penetranza Non ricorrente nelle famiglie Si può studiare nelle popolazioni SNP in geni candidati

10 Che cos è uno SNP? Single Nucleotide Polymorphism Un cambiamento di un singolo nucleotide che si è prodotto per mutazione e si è diffuso nella popolazione

11 Che cos è uno SNP? Single Nucleotide Polymorphism Ci sono centinaia di migliaia di SNP molto frequenti In media tra due persone c è uno SNP ogni 1250 nucleotidi Anche nei due cromosomi omologhi di uno stesso individuo ci sono molti SNP

12 Identificazione di geni di suscettibilità per HNSCC HNSCC Casi L analisi degli SNP Controlli Profilo A T TG C A T G C C A G T A G G SNP A T TG C A T G C C A G T A G G Ricerca dei geni implicati T A T G A T T G C C G C T A G G

13 Lo studio Caso-Controllo Controllo CASI Una serie di pazienti selezionati in base ad una diagnosi CONTROLLI Soggetti sani selezionati con criteri di appaiamento con i casi età genere origine o residenza stile di vita La potenza dello studio dipende dal numero di soggetti esaminati

14 Campionamento DATI CLINICI Localizzazione del tumore Istologia, tipo e grado Storia clinica DATI DEMOGRAFICI E STILE DI VITA Età Genere Professione Abitudine al fumo Uso di alcol Dieta Hobby CAMPIONE BIOLOGICO Sangue Saliva o mucosa orale Estrazione del DNA dai campioni biologici

15 Analisi del genotipo PROFILO GENETICO INDIVIDUALE A T TG C A T G C C A G T A G G Analisi di SNP multipli dei geni candidati selezionati Si possono analizzare centinaia o migliaia di SNP dal DNA estratto da un piccolo campione

16 Analisi dei dati Se la frequenza di un certo genotipo è diversa tra i casi ed i controlli è possibile che quel gene sia implicato nella eziopatogenesi della malattia GENOTIPO A RISCHIO se un certo genotipo è più frequente tra i casi GENOTIPO PROTETTIVO se un certo genotipo è meno frequente tra i casi

17 Quali geni candidati? Controllo della divisione cellulare Controllo della integrità del genoma e dei processi apoptotici Controllo della replicazione e della trascrizione del DNA Processi infiammatori e stress ossidativo Metabolismo dei cancerogeni

18 Suscettibilità individuale E un carattere multifattoriale in cui una componente genetica (poligenica) ed una ambientale stabiliscono un complesso intreccio di interazioni, in cui anche una componente stocastica gioca un ruolo di primo piano. Non è misurabile ma si può cercare di stimarla studiando i rischi relativi dei fattori che la determinano. La suscettibilità individuale dipende anche dal fatto che numerosi geni sono polimorfici, con varianti alleliche che in alcuni popolazioni raggiungono frequenze estremamente elevate.

19 Polimorfismi metabolici Quando la componente ambientale di una data patologia si configura come l esposizione a sostanze cancerogene (come il fumo e l alcool per il cancro orale), che possono essere trasformate in vivo in composti più o meno genotossici, diventa ragionevole supporre che i polimorfismi METABOLICI possano avere un ruolo nell etiopatogenesi

20 Il metabolismo dei cancerogeni METABOLITA ATTIVO CANCEROGENO PRODOTTO IDROSOLUBILE

21 NH 2 Ammine aromatiche Tutti siamo esposti alle ammine aromatiche Cottura dei cibi ad alte temperature Fumo di tabacco PIROLISI Inquinamento atmosferico Processi industriali della gomma L esposizione a queste sostanze è associata con un alto rischio di cancro

22 Metabolismo delle ammine aromatiche Le N-acetiltransferasi sono enzimi chiave del metabolismo delle ammine Ammina NH 2 NAT NH-Ac Ammina-N-acetilata acetilata

23 Metabolismo delle ammine aromatiche Idrossilammina Idrossilammina CYP Aryl-NH NH-OH Aryl-NH 2 Ammina aromatica NAT Aryl-NH NH-Ac Ammina -N-acetilata CYP Aryl-NH NH-Ac escrezione NAT Aryl-NH NAT OH Estere acetossi O-Ac Acido idrossammico Aryl-NH + Ione nitronio attacco al DNA cancerogenesi

24 Le N-acetiltransferasiN (NAT) Ci sono due isoforme polimorfiche NAT1 NAT2 Allele Frequenza nei Caucasici Allele Frequenza nei Caucasici NAT1*4 73.8% NAT2*4 24.9% NAT1*3 3.6% NAT2*5 43.9% NAT1* % NAT2*6 26.8% NAT1*11 1.9% NAT2*7 2.0% attività maggiore nessuna attività (Wikman et al., 2001)

25 Classificazione degli acetilatori Veloci acetilatori portatori di almeno un allele NAT1*10 o NAT1*11 (alta attività) portatori di almeno un allele NAT2*4 (alta attività) Lenti acetilatori tutte le altre combinazioni alleliche

26 Suscettibilità al cancro e genotipi NAT I veloci acetilatori NAT1 sono più suscettibili al cancro alla vescica e al colon (Cascorbi et al., 2001; Hirvonen,1999) I lenti acetilatori NAT2 sono più suscettibili al cancro alla vescica e al polmone, meno suscettibili al cancro del colon-retto (Hirvonen, 1999; Houlston et al.,2002)

27 Genotipizzazione tramite PCR-RFLP RFLP Estrazione di DNA genomico da cellule Amplificazione del gene NAT1 Controllo dell'amplificato su gel elettroforesi Digestione enzimatica per l'individuazione dell'allele NAT1*4 Digestione enzimatica per l'individuazione dell'allele NAT1*11 Individuazione degli aplotipi.

28 IDENTIFICAZIONE DELL'ALLELE SELVATICO NAT1*4 Si amplifica una sequenza di 435 pb nella regione non tradotta in 3' (3'-UTR) del gene NAT1 Si utilizzano i primers NAT1-4F e NAT1-4R Questa sequenza bersaglio contiene una sostituzione C1095A, presente in tre alleli mutati, NAT1*10, *3 e *11 e non nell'allele NAT1*4 NAT1-5F *3, *10, * / /710 C1095A NAT1-IIR

29 Il frammento amplificato contiene il sito di taglio riconosciuto dall'enzima BbsI quando la sequenza bersaglio corrisponde agli alleli che portano la sostituzione C1095A. 435pb C 1095 A BbsI 405 pb 30 pb 435 pb 405 pb *4/*4 *4/m m/m 30 pb

30 IDENTIFICAZIONE DELL'ALLELE NAT1*11 Si amplifica un segmento di 289 pb con i primers NAT1-11F e NAT1-11R All amplificazione segue una digestione enzimatica i cui prodotti sono due frammenti di 17 pb e 272 pb per l allele NAT1*3 I frammenti tagliati sono analizzati in gel di agarosio al 2.5 % in presenza di Bromuro di Etidio: 289 bp PshAI 272 pb 17 pb

31 *3/*3 *3/*11 *11/*11 289pb 272pb 17pb Dalla combinazione dei patterns ottenuti dalle due fasi, si ottengono i genotipi al locus NAT1 per i 2 alleli studiati, una successiva analisi permetterà di individuare gli alleli *10.

32 Suscettibilità all HNSCC e genotipi NAT Esiste una relazione tra polimorfismo delle N-acetiltransferasi e suscettibilità al cancro del tratto oro-faringeo-laringeo? Studio caso-controllo 216 pazienti con HNSCC 318 soggetti sani usati come controllo reclutati all IST di Genova

33 Localizzazione dei tumori Laringe 130 Incluse le corde vocali Cavo orale 86 Pavimento, mucosa boccale, palato molle e duro, gengive superiori ed inferiori, lingua e labbra

34 Suscettibilità al cancro e NAT Frequenza (%) NAT1_veloce NAT2_lento CONTROLLI HNSCC LARINGE CAVO ORALE

35 Quanto aumenta il rischio di cancro? HNSCC Laringe Cavo orale Controlli N (%) Casi N (%) OR a (95% CI) Laringe N(%) OR a (95% CI) Cavo Orale N(%) OR a (95% CI) NAT1 lento veloce NAT2 veloce lento 194 (61) 124 (39) NAT1 Veloce 186 (58.5) 132 (41.5) NAT2 Lento 98 (45.4) 118 (54.6) 100 (46.3) 116 (53.7) (50.7) ( ) (49.3) (53.8) ( ) (46.2) (37.2) ( ) (62.8) (34.9) ( ) (65.1) ( ) ( ) Analisi di regressione logistica incondizionata aggiustando per età, genere, alcol e fumo

36 Effetti dei polimorfismi genetici Il rischio associato ad un singolo polimorfismo può non essere molto alto ma una combinazione di genotipi sfavorevoli può portare ad un notevole incremento di rischio effetti additivi e sinergici

37 Suscettibilità al cancro e NAT1 & NAT2 Frequenza (%) NAT1_lento/NAT2_veloce NAT1_veloce/NAT2_veloce NAT1_lento/NAT2_lento NAT1_veloce/NAT2_lento CONTROLLI HNSCC LARINGE CAVO ORALE

38 Quanto aumenta il rischio di cancro? HNSCC Cavo orale NAT1/NAT2 Controlli N (%) Casi N (%) OR a (95% CI) Laringe N (%) OR a (95% CI) Cavo orale N (%) OR a (95% CI) lento/veloce veloce/veloce lento/lento 108 (33.96) 78 (24.53) 82 (25.79) (16.67) 62 (28.70) 70 (32.41) 48 (22.22) NAT1 veloce/lento Veloce/ / NAT2 Lento (15.72) 20% ( ) 2.70 ( ) 2.84 ( ) 30 (23.07) 40 (30.77) 42 (32.31) 18 (13.85) ( ) 2.41 ( ) 1.38 ( ) 6 (6.98) 22 (25.58) 28 (32.56) 30 (34.88) ( ) 5.84 ( ) 9.99 ( ) Analisi di regressione logistica incondizionata aggiustando per età, genere, alcol e fumo

39 Effetti dei polimorfismi genetici Il rischio associato ad un certo genotipo può non essere molto elevato a livello del singolo individuo ma data l alta frequenza di genotipi sfavorevoli il loro impatto sul rischio di cancro può essere notevole a livello di popolazione