LOCALIZZAZIONE in situ DI PROTEINE IN CELLULE E TESSUTI

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Linda Manzo
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1 LOCALIZZAZIONE in situ DI PROTEINE IN CELLULE E TESSUTI 1

2 Che cosa sono le proteine? Indispensabili per il corretto funzionamento 2

3 Dove si trovano le proteine? Le proteine sono macromolecole ubiquitarie, essenziali per la costituzione di tutti gli organismi, dai più semplici ai più complessi VIRUS PROCARIOTI EUCARIOTI 3

4 Dove si trovano le proteine? EUCARIOTI UNICELLULARI PLURICELLULARI 4

5 Dove si trovano le proteine? Le proteine sono presenti in ogni regione della cellula - sia a livello della MEMBRANA (plasmatica e dei vari organuli) - sia nel CITOSOL o nel lume degli organuli dotati di membrana 5

6 Dove si trovano le proteine? Negli organismi pluricellulari, in cui le singole cellule si organizzano a costituire i tessuti, le proteine sono presenti anche nella sostanza extracellulare 6

7 Che funzioni svolgono le proteine? In tutti gli organismi le proteine svolgono molteplici funzioni: RECETTORI - CANALI - TRASPORTATORI STRUTTURALI MOVIMENTO TRASPORTO ENZIMATICHE 7

8 Come si studiano le proteine? La struttura e le funzioni delle proteine possono essere studiate con metodiche biochimiche e di biologia molecolare, ma per localizzare le proteine nella loro sede cellulare o extracellulare specifica ( in situ ) occorrono tecniche particolari che impiegano reazioni visualizzabili mediante l impiego di vari tipi di microscopi. 8

9 LOCALIZZAZIONE in situ 9

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12 Entrambe le tecniche: 12

13 Preparazione di campioni biologici per l indagine istologica Per l osservazione al microscopio sono necessari campioni 1. sottili (attraversabili dalla luce) 2. colorati campione 13

14 1. CAMPIONI SOTTILI (micrometri µm) Solo CELLULE ISOLATE in sospensione o COLTURE CELLULARI sono sufficientemente sottili per poter essere direttamente osservate al microscopio Sangue PIASTRE FIASCHE Striscio CITOLOGIA ESFOLIATIVA - PAP test - Broncoaspirato 14

15 1. CAMPIONI SOTTILI (micrometri µm) Per avere un campione sottile bisogna normalmente tagliarlo mediante speciali apparecchi (MICROTOMI) I campioni biologici in genere sono molli e non possono essere facilmente tagliati ad uno spessore adeguato 2. CAMPIONI COLORATI I campioni biologici non sono normalmente colorati NECESSITA DI TRATTAMENTI PRELIMINARI Pericolo di alterare la proteina in esame 15

16 Fasi della preparazione Prelievo Fissazione Disidratazione Inclusione Taglio Colorazione Prelievo E l operazione con la quale si ottiene il campione. Deve essere eseguito il più velocemente possibile da materiale biologico vivente (tranne le autopsie). Pericolo di alterare la proteina in esame 16

17 Prelievo Fissazione Disidratazione Inclusione Taglio Colorazione Fissazione Pericolo di alterare la proteina in esame 17

18 Prelievo Fissazione Disidratazione Inclusione Taglio Colorazione Disidratazione SCOPO: sostituzione dell acqua contenuta nel tessuto con un solvente del mezzo di inclusione (paraffina) MODALITA : 1. scala alcolica crescente Etanolo 70% Etanolo 90% Etanolo 100% 2. Chiarificazione in solvente della paraffina 3. Infiltrazione in paraffina fluida diluita in solvente Pericolo di alterare la proteina in esame 18

19 Prelievo Fissazione Disidratazione Inclusione Taglio Colorazione Inclusione SCOPO: permette di inglobare il campione in un materiale abbastanza duro ed omogeneo per poter essere tagliato in sezioni sottili PARAFFINA Miscela di idrocarburi saturi solida a T ambiente punto di fusione a insolubile in H 2 O, solubile in xilolo Il campione viene - immerso in paraffina pura liquida - trasferito in stampini, fatti poi solidificare a temperatura ambiente CAMPIONE PERMANENTE Pericolo di alterare la proteina in esame 19

20 Prelievo Fissazione Disidratazione Inclusione Taglio Colorazione Taglio delle sezioni MICROTOMO Strumento che permette di sezionare i blocchetti di paraffina contenenti il campione in fette spesse 3-10 µm (micrometri o micron) Sezioni distese in acqua tiepida, raccolte su vetrini CAMPIONE PERMANENTE 20

21 Prelievo Fissazione Disidratazione Inclusione Taglio Colorazione Taglio delle sezioni VIBRATOMO Consente di tagliare campioni non inclusi in sezioni spesse µm (micrometri o micron) Sezioni raccolte e conservate libere in una Soluzione Tampone, in frigorifero o in congelatore CAMPIONE NON PERMANENTE 21

22 Prelievo Fissazione Disidratazione Inclusione Taglio Colorazione Taglio delle sezioni CRIOSTATO Consente di tagliare a freddo (-20 C) campioni non inclusi e non fissati in sezioni di 5-30 µm (micrometri o micron) Sezioni raccolte su vetrino o conservate libere in una Soluzione Tampone IN CONGELATORE CAMPIONE NON PERMANENTE 22

23 Prelievo Fissazione Disidratazione Inclusione Taglio Colorazione COLORAZIONE 1. PRETRATTAMENTI I coloranti sono in soluzione acquosa, quindi le sezioni devono essere prima - sparaffinate in xilolo (10 min) - reidratate con scala decrescente di alcool (5 min) - 95 (5 min) - 75 (5 min) - acqua (5 min) 2. COLORAZIONE (o REAZIONE CITOCHIMICA/IMMUNOCITOCHIMICA) 3. MONTAGGIO Per avere campioni permanenti nel tempo, le sezioni devono essere poi - disidratate con scala crescente di alcool - 75 (5 min) - 95 (5 min) (5 min) - Ricoperte da vetrino coprioggetto, sigillato da colla CAMPIONE PERMANENTE 23

24 MICROSCOPIO A FLUORESCENZA E CONFOCALE MICROSCOPIO ELETTRONICO 24

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