MODULO 6 FOSFORILAZIONE OSSIDATIVA REAZIONI DI OSSIDORIDUZIONE

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1 MODULO 6 FOSFORILAZIONE OSSIDATIVA REAZIONI DI OSSIDORIDUZIONE Introduzione I sistemi viventi possono essere distinti, in base al consumo d ossigeno, in organismi aerobi ed organismi anaerobi. I primi necessitano di ossigeno per poter produrre l energia chimica necessaria per la vita stessa. Il termine di respirazione cellulare indica generalmente l insieme di reazioni che culminano con la riduzione dell ossigeno ad acqua determinando la concomitante produzione di ATP. Negli eucarioti la fase finale di tale processo avviene nei mitocondri, per questo definiti le centrali elettriche delle cellule, e viene denominata fosforilazione ossidativa. Essa rappresenta il principale meccanismo di produzione di energia per la cellula e si realizza attraverso una serie successiva di reazioni di ossidoriduzione, in cui gli elettroni forniti da NADH e FADH 2 sono trasferiti all ossigeno attraverso la cosiddetta catena respiratoria. Obiettivi La lezione presenta richiami essenziali sugli aspetti chimici delle reazioni di ossidoriduzione. Successivamente vengono analizzate le caratteristiche strutturali e funzionali della catena respiratoria mitocondriale, sede della fosforilazione ossidativa. Verranno spiegati i concetti di accoppiamento tra consumo di ossigeno e produzione di ATP e la teoria chemismotica, che descrive i meccanismi alla base di tale accoppiamento. Respirazione Cellulare Gli organismi aerobi necessitano di ossigeno per poter produrre l energia necessaria per le funzioni vitali. La respirazione cellulare rappresenta l insieme delle reazioni di natura catabolica che, demolendo le macromolecole apportate dall esterno attraverso l alimentazione, ne estraggono equivalenti riducenti (elettroni), da convogliare nei mitocondri per ridurre l ossigeno molecolare ad acqua. Quest ultima fase del processo è detta fosforilazione ossidativa e rappresenta la principale fonte di ATP per la cellula di esseri viventi eterotrofi. A differenza degli organismi autotrofi, che sfruttano l energia solare per produrre ATP (fotofosforilazione) e macromolecole organiche, gli eterotrofi utilizzano macromolecole esogene ed ossigeno per poter vivere. La demolizione dei nutrienti avviene attraverso processi di ossido-riduzione controllati, che consentono di estrarre con elevato rendimento energia chimica dalle macromolecole. Richiami chimici sulle reazioni di ossidoriduzione Reazioni di ossidoriduzione. Le reazioni di ossido-riduzione (redox) giocano quindi un ruolo fondamentale nei meccanismi cellulari di produzione di energia. Dal punto di vista chimico, affinché una reazione di ossidoriduzione possa verificarsi, è sufficiente che siano presenti due sostanze: una che cede elettroni ed una che acquista gli elettroni ceduti dalla prima sostanza. E importante che nelle reazioni di ossidoriduzione sia rispettato il principio di elettroneutralità ovvero che tutti gli elettroni messi in gioco da una sostanza siano accettati da un altra sostanza. In una reazione di ossidoriduzione possiamo distinguere due semireazioni: una semireazione di ossidazione ed una semireazione di riduzione, che possono essere separate solo da un punto di vista teorico. Reazioni di Ossidazione. La semireazione di ossidazione indica la perdita di elettroni da parte di un composto (o di un atomo all interno di un composto) che si trasforma in un altro composto. In alcuni casi (ma non in tutte le semireazione di ossidazione), la perdita di elettroni si associa ad un incremento del contenuto di ossigeno del composto. Da qui deriva il termine di ossidazione. Il glucosio (C 6 H 12 O 6 )

2 trasformandosi in anidride carbonica si ossida in quanto perde elettroni (il n di ossidazione del carbonio passa da 0 a +4) ed incrementa il contenuto in ossigeno (rapporto C/O nel glucosio = 1/1, rapporto C/O 2 nella CO 2 =1/2). Reazioni di Riduzione. La semireazione di riduzione indica invece il guadagno di elettroni (persi dal composto che ha subito l ossidazione) da parte di un composto che si trasforma in un altro composto. In alcuni casi (ma non in tutte le semireazioni di ossidazione), l acquisto di elettroni si associa ad una riduzione del contenuto di ossigeno del composto. Nella combustione del glucosio l ossigeno molecolare trasformandosi in acqua si riduce: l atomo di ossigeno guadagna due elettroni (il numero di ossidazione passa da 0 a 2, poiché gli elettroni condivisi nel legame covalente con l idrogeno possono essere attribuiti in toto all ossigeno, in quanto atomo più elettronegativo). Reazioni Redox. La sostanza che si riduce viene detta ossidante (agente ossidante) in quanto acquistando elettroni determina l ossidazione di un altra sostanza. La sostanza che si ossida viene detta riducente (agente riducente) in quanto acquistando gli elettroni permette ad un'altra sostanza di ridursi. Nella reazione tra Mg e F 2 a dare MgF 2, il Mg perdendo elettroni si ossida ed agisce da agente riducente, mentre il F acquista elettroni e quindi si riduce ed agisce da ossidante. Poiché molte reazioni di ossidoriduzione sono reversibili, una volta che il donatore di elettroni (agente riducente) ha ceduto i suoi elettroni, ossidandosi, è diventato un accettore di elettroni. Analogamente un accettore di elettroni diviene un donatore di elettroni. Lo stesso concetto si esprime dicendo che in una reazione di ossidoriduzione, ciascun reagente esiste in una forma ridotta (donatore di elettroni) e in una forma ossidata (accettore di elettroni). Mg + F 2 -> MgF 2 : Mg -> Mg e - (ossidazione) F 2 + 2e - -> 2F - (riduzione)

3 Agente ossidante Agente riducente A) donatore (1) <- -> accettore (1) + e - B) accettore (2) + e - fecciasx -> donatore (2) C) donatore (1) + accettore (2) <- -> accettore (1) + donatore (2) Potenziale standard di riduzione. Essendo reazioni reversibili, le redox sono caratterizzate da una costante di equilibrio (Keq), che indica quale direzione della reazione è spontaneamente favorita; possiamo generalizzare che Keq dipende dalle affinità relative dei due composti accettori per gli elettroni. Riferendosi alla reazione complessiva (Mg + F 2 -> MgF 2 ), se l accettore (2) ha maggiore affinità per gli elettroni dell accettore (1), la reazione decorrerà prevalentemente verso destra. Il Potenziale di riduzione standard (E ) è una misura quantitativa dell affinità per gli elettroni. Esso viene determinato per ciascuna semi-reazione di riduzione misurando, tramite un voltmetro, quantità e direzione del flusso di elettroni generato dall accoppiamento (tramite l unione di semi celle attraverso un cavo elettrico) di una semi-reazione di riferimento e una semi-reazione di interesse. La semi-reazione di riferimento è per convenzione quella dell idrogeno (H + <- -> ½ H 2 ), cui è stato conferito, in condizioni standard (25 C, concentrazione di H + = 1M, pressione di H 2 = 1 atm), valore zero; la semi cella di misura contiene una coppia donatore accettore alla stessa molarità o pressione. Il flusso di elettroni lungo il cavo elettrico si sposterà verso la cella contenente l accettore di elettroni con maggiore affinità per gli stessi. Per convenzione il Potenziale di riduzione standard (E ) della coppia in esame avrà valore positivo se il flusso di elettroni avviene dalla cella di riferimento a quella di misura, valore negativo nel caso opposto.

4 Il suo valore numerico sarà invece un indice della quantità di elettroni scambiati nella reazione redox complessiva. Coniugando le coppie donatore/accettore possibili con quella di riferimento, se ne sono misurati i rispettivi E. Conoscendo il loro valore, si può stabilire in quale direzione avverrà lo scambio di elettroni quando si uniscono due coppie accettore/donatore qualsiasi. La coppia con E maggiore accetterà gli elettroni, ovvero la semi-reazione avverrà nel senso della riduzione, mentre quella con E minore donerà gli elettroni e la semi reazione procederà nel senso della ossidazione. La differenza algebrica dei singoli potenziali di riduzione corrisponde al potenziale complessivo della redox in esame ( Δ E ). Potenziale redox. Da quanto detto precedentemente redox spontanee avranno Δ E totale positivo. Esiste una correlazione tra Δ E e variazione di energia libera (Δ G ), infatti Δ E Δ G = -nf (n= numero di elettroni scambiati nella redox, F = costante di Faraday). Come si vede, quando Δ E >0 e Δ G <0 la redox è spontanea. Il valore del potenziale di riduzione varia al variare delle concentrazioni dei reagenti, della temperatura e del ph. Il potenziale di riduzione biologico standard E è misurato mantenendo nella cella di misura ph 7 (concentrazione degli H + =10-7 molare) e reagenti sempre in concentrazioni 1 molare. Un apposita formula consente di calcolare i valori dei potenziali di coppie redox quando la concentrazione ( o la pressione) dei singoli reagenti è diversa da 1 (quello che accade nelle cellule).

5 L elenco presenta i E di diverse semi-reazioni di riduzione che avvengono all interno delle cellule. La presenza dell ossigeno in cima alla lista, con il valore più alto di E (0,82), spiega il fatto che l ossigeno molecolare sia l accettore finale degli elettroni liberati dalle varie ossidazioni nella cellula. Esso rappresenta l accettore con maggiore affinità per gli elettroni (agente ossidante più forte). Sistemi E (Volt) NAD + /NADH -0,32 Piruvato/Lattato -0,19 Ossalacetato/malato -0,17 Fumarato/succinato +0,03 Citocromo b; Fe 3+ /Fe 2+ +0,08 Ubichinone; formaossid/forma rid. +0,10 Citocromo c1; Fe 3+ /Fe 2+ +0,22 Citocromo a; Fe 3+ /Fe 2+ +0,29 Ossigeno/H 2 O +0,82 Il potenziale redox complessivo delle respirazione Redox totale della Respirazione. Comprese meglio alcune caratteristiche fondamentali delle reazioni, possiamo analizzare la chimica della respirazione più nel dettaglio. Nell ambito della respirazione mitocondriale, la catena respiratoria convoglia gli elettroni sull ossigeno, che si riduce ad acqua. La semireazione di riduzione è quindi: ½ O 2 +2e - -> H 2 O. Il suo E è pari a 0.82 volt. Gli elettroni prodotti dalla demolizione ossidativa dei nutrienti sono convogliati per lo più sul trasportatore di elettroni NADH. Questo coenzima rappresenta quindi il donatore di elettroni per l ossigeno, secondo la seguente reazione di ossidazione: NADH + H + -> 2H + + 2e -. E di questa semireazione è pari a 0,32 volt (essendo scritta nel verso opposto a quello presente nella tabella della pagina precedente, si deve cambiare il segno). Il Δ E complessivo sarà la somma algebrica dei due valori, pari a 1,14 volt. ½ O H + + 2e - -> H 2 O (Eo = 0.82 V) NADH + H + -> NAD H + + 2e - (Eo = 0,32 V) si ha: ½ O 2 + NADH + H + -> H 2 O + NAD + Δ (Eo = 1.14 V) Δ G = -nf Δ Eo = -2 x kcal / V Mol x 1.14 V = = kcal/mol Il suo valore positivo conferma che il flusso degli elettroni dal NADH all ossigeno è un fenomeno spontaneo. Il calcolo della variazione di energia libera dà un valore di 219 kj/mole (-52,6 kcal/mole). Tale energia rappresenta la forza termodinamica che consente l accoppiamento della catena respiratoria con la produzione di ATP tramite la fosforilazione ossidativa.

6 Connessione tra processi catabolici e catena di trasporto degli elettroni Molecole che donano elettroni alla catena respiratoria. I nucleotidi piridinici NAD + e FAD rappresentano i coenzimi su cui vengono convogliati la maggior parte degli elettroni ceduti dalle macromolecole nutritive nel corso della loro demolizione ossidativa. Il meccanismo prevede l intervento di deidrogenasi NAD (o FAD) dipendenti, che realizzano la reazione generalmente reversibile: substrato ridotto + NAD + <- -> substrato ossidato + NADH + H + Il trasferimento di elettroni dal substrato al coenzima avviene contemporaneamente al distacco di 2 atomi di idrogeno dal substrato; uno sotto forma di ione idruro (:H - ), che si lega al NAD +, l altro sotto forma di idrogenione (H + ), che si libera nello spazio circostante. Nel caso di reazioni citosoliche (per esempio, nel corso della glicolisi, quella catalizzata dall enzima gliceraldeide-3-p-deidrogenasi) il NADH ridotto si dissocia dall enzima e, essendo solubile, diffonde verso i mitocondri, sede della fosforilazione ossidativa. Tuttavia il coenzima non entra nell organello, ma cede gli elettroni a trasportatori presenti sulla membrana esterna del mitocondrio. Molte reazioni di deidrogenazione NAD + dipendenti avvengono però all interno del mitocondrio (ciclo di Krebs, β ossidazione degli acidi grassi) e quindi gli elettroni sono in questo caso già nella sede della catena respiratoria. Anche FAD (o FMN) si comportano in modo simile al NAD +, con la differenza che possono accettare anche un solo elettrone e che, spesso, sono legati saldamente all enzima con cui operano.

7 Il metabolismo e la fosforilazione ossidativa. I mitocondri sono la sede in cui avviene la fosforilazione ossidativa e quindi la produzione della maggior parte dell ATP cellulare: sono le centrali elettriche della cellula. Presentano una doppia membrana; quella esterna facilmente permeabile e quella interna che, essendo molto più impermeabile, può essere superata solo tramite molecole che fungono da trasportatori specifici. L impermeabilità della membrana interna alle molecole in genere e agli ioni in particolare è un fenomeno estremamente rilevante per il meccanismo che consente di accoppiare riduzione dell ossigeno a produzione di ATP.

8 La membrana interna è sede delle proteine che costituiscono la cosiddetta catena respiratoria o catena di trasporto degli elettroni (CTE) dai coenzimi purinici ridotti all ossigeno. La matrice mitocondriale, delimitata dalla membrana interna, contiene molti enzimi (ciclo di Krebs, β ossidazione, altre vie ossidative) capaci di produrre coenzimi purinici ridotti. I mitocondri contengono quindi l insieme dei catalizzatori (CTE) che raccolgono gli equivalenti riducenti e li trasportano all accetore finale, l ossigeno. Contengono anche il meccanismo che realizza la trasformazione dell energia liberata dalle ossidoriduzioni della CTE in ATP ed anche la maggior parte dei sistemi enzimatici che realizzano la semplificazione di molte molecole organiche (acetil-coa nel ciclo di Krebs, acidi grassi nella β ossidazione) con contemporanea generazione di coenzimi NADH e FADH 2. Alcuni di questi coenzmi sono generati anche all esterno del mitocondrio, nel citoplasma. Il loro ingresso nella CTE mitocondriale prevede sistemi di trasporto specifici che consentono di superare la barriera delle membrane mitocondriali. Analizzeremo tali meccanismi in dettaglio in seguito. La catena di trasporto degli elettroni (CTE) La redox complessiva della catena respiratoria può essere riassunta in un processo di riduzione dell ossigeno con concomitante deidrogenazione (ossidazione) di NADH (o FADH 2 ). Tuttavia questa reazione, fortemente esoergonica (Δ G = -219 kj/mole) non avviene in un unica reazione, ma è distinta in cicli successivi di deidrogenazione, in cui coppie accettore/donatore con E via via più elevati si susseguono cedendo elettroni l una all altra, fino ad arrivare alla riduzione finale dell ossigeno. Questo meccanismo complesso, mantenendo una differenza di potenziale complessiva e quindi un energia libera uguale a quella che si avrebbe in una reazione unica, consente una liberazione progressiva e meglio controllata dell energia, che può così essere pienamente sfruttata per produrre energia.

9 La CTE è formata da una serie di proteine (o complessi proteici) integrali della membrana mitocondriale interna, cui sono legati gruppi prostetici o cofattori capaci di legare e cedere elettroni. NADH e FADH 2 sono i coenzimi trasportatori iniziali, cui seguono e si associano ubichinone, gruppi eme e gruppi ferrozolfo. L ubichinone (o coenzima Q) è una molecola lipofilica, capace di diffondere liberamente nella membrana mitocondriale interna. Si riduce accettando 1 o 2 elettroni (QH* o QH2), che poi cede ad un altro trasportatore, riossidandosi. Il gruppo eme e i gruppi ferro-zolfo contengono un atomo di ferro quale centro di ossidoriduzione: ovvero passa reversibilmente dallo stato ossidato (Fe 3+ ) allo stato ridotto (Fe 2+ ). CTE: ΔE e ΔG. Questi cofattori capaci di legare e cedere elettroni sono inseriti nei quattro complessi proteico-lipidici che costituiscono la CTE. Sono denominati complesso I, II, III e IV e, quasi tutti, sono intrinseci alla membrana mitocondriale interna.

10 Essi realizzano il passaggio progressivo di elettroni dal primo componente, il complesso I, all ultimo accettore, l ossigeno. Il meccanismo prevede una serie di passaggi complicati tra diversi coenzimi e cofattori con una variazione di energia libera complessiva pari a circa 50 Kcal/mole. CTE: complesso I

11 Il complesso I, chiamato anche NADH:ubichinone-ossidoreduttasi media il trasferimento di elettroni dal coenzima NADH all ubichinone. Tale trasferimento avviene sotto forma di ione idruro (:H - ), che passa dal NADH a un coenzima flavinico (FMN) e poi a centri ferro-zolfo associati al complesso I. Contemporaneamente il complesso I determina il trasferimento di 4 protoni idrogeno (H + ) dalla matrice allo spazio intermembrana mitocondriale. Agisce quindi da pompa protonica, sfruttando l energia liberata dalla cessione di elettroni da una coppia donatore/accettore (NAD + /NADH) con E minore (-0,32) ad una (Q/QH 2 ) con E maggiore (+0,1). CTE: complessi II e III Il complesso II corrisponde ad un enzima del ciclo di Krebs, la succinato deidrogenasi, che trasferisce equivalenti riducenti dal succinato al coenzima FAD e quindi, probabilmente attraverso proteine con centri Fe-S, all ubichinone. Altre deidrogenasi mitocondriali (acil-coa deidrogenasi della β ossidazione o la glicerolo-fosfato deidrogenasi) trasferiscono elettroni all ubichinone. L ubichinone ridotto, potendo fluire nell ambito della membrana mitocondriale interna, agisce da connettore tra complesso I e II e citocromo c. Il complesso III (ubichinone:citocromo c ossidoreduttasi) è il sistema enzimatico che realizza tale trasferimento: esso contiene cofattori eme (citocromi) e Fe-S, che, con un meccanismo complesso consentono l ossidazione del QH 2 a Q (E = + 0,10) con contemporanea riduzione del citocromo c (E = +

12 0,22). Contemporaneamente il sistema enzimatico utilizza l energia liberata dall ossidoriduzione esorgonica per pompare 4 idrogenioni (H + ) dalla matrice allo spazio intermembrana. È da notare che i centri eme dei citocromi trasportano un elettrone alla volta, per cui l ossidazione dell ubichinone comporta la riduzione di due molecole di citocromo c. CTE: citocromo c e complesso IV. Il citocromo c è una proteina solubile dello spazio intermembrana che, come l ubichinone, realizza una connessione tra complessi meno mobili nella membrana mitocondriale interna. Infatti realizza la connessione tra complesso III e complesso IV, trasferendo elettroni a quest ultimo. Il complesso IV, denominato citocromo ossidasi, realizza la fase finale della CTE, ovvero la riduzione dell ossigeno ad acqua. La riduzione di 4 molecole di citocromo c ossidato (E = +0,22 V) fornisce 4 elettroni che, associati a 4 H + provenienti dalla matrice mitocondriale, consentono la riduzione dell ossigeno molecolare (O 2, E = +0,82 V) ad H 2 O. L energia liberata dall ossidoriduzione viene utilizzata per far fluire altri 4 protoni H + attraverso la membrana mitocondriale interna verso lo spazio intermembrana. Fosforilazione Ossidativa (Teoria chemiosmotica) La riduzione dell ossigeno ad acqua a partire dagli equivalenti riducenti donati dai coenzimi purinici o flavinici è una reazione fortemente esoergonica (Δ G = 219 kj/mole). L energia viene liberata progressivamente attraverso il passaggio graduale di elettroni tra coppie redox con potenziale via via maggiore. L energia liberata da ciascun passaggio consente l espulsione di protoni H + dalla matrice allo spazio intermembrana (la membrana interna è impermeabile ai protoni). L accumulo di H + nello spazio intermembrana rappresenta una forma di energia, detta forza motrice protonica, per due fattori: 1. l energia potenziale correlata al gradiente di concentrazione di una specie chimica (H +) a cavallo di una membrana, 2. l energia legata al potenziale elettrico dovuto alla differenza di carica che si realizza ai due lati della stessa membrana; all esterno si ha infatti un accumulo di cariche positive, mentre all interno un accumulo di cariche negative (OH - ).

13 Questi gradienti rappresentano forme di energia potenziale in cui è trasformata l energia liberata dall ossidoriduzione e che sono sfruttate per produrre ATP. Sono quindi la forza motrice della fosforilazione ossidativa. Catena di trasporto degli elettroni (ETC). La CTE produce, per ogni mole di coppie di elettroni trasportata all ossigeno, una quantità di energia (circa 200kJ) elevata, conservata quale energia potenziale nel gradiente elettrochimico a cavallo della membrana interna mitocondriale. Tale energia è termodinamicamente sufficiente per produrre ATP. Solo recentemente il meccanismo che associa tale forza elettrochimica alla produzione di ATP è stato, almeno in parte, delucidato e viene comunemente definito modello o teoria chemiosmotica.

14 Tale modello prevede che la forza motrice elettrochimica generata dall espulsione di protoni consenta la sintesi di ATP attraverso il flusso inverso degli stessi protoni, dallo spazio intermembrana alla matrice. Tale flusso avviene attraverso un canale protonico che fa parte dell enzima ATP sintasi. Il blocco di tale canale protonico (per esempio tramite sostanze quali l oligomicina), rende impossibile la sintesi di ATP. ATP sintasi. L ATP sintasi è un enzima complesso, in cui si distinguono due componenti, denominate F 1 e F o. La porzione F 1 è costituita da 9 subunità, di cui quella β contiene l attività catalitica. Si associa alla membrana mitocondriale interna solo grazie ad un interazione con la componente F o.

15 Quest ultima è un complesso multimerico, saldamente inserito nel foglietto lipidico della membrana mitocondriale; rappresenta il vero canale attraverso cui fluiscono gli elettroni. Il meccanismo con cui la proteina sfrutta il gradiente elettrochimico quale energia per sintetizzare ATP è complicato e prevede modifiche conformazionali successive della subunità β di F 1, che determinano prima il legame con ADP e fosfato inorganico, poi la formazione del legame anidridico ed infine il distacco dell ATP. Caratteristica peculiare di questo processo è il fatto che, quando avviene nel contesto dell ATP sintasi, la reazione ADP + Pi <- -> ATP + H 2 O risulta reversibile (in condizioni normali, la sintesi di ATP è fortemente endoergonica). Il flusso di protoni attraverso il canale sembra essere necessario per il distacco dell ATP neosintetizzato. CTE e Fosforilazione Ossidativa (Chemiosmosi per FADH 2 ). Quando la CTE riceve elettroni dal NADH, li trasferisce all ossigeno con la contemporanea espulsione di 10 protoni dalla matrice: 4 pompati dal complesso I, 4 dal complesso III e 2 dal complesso IV. Se gli equivalenti riducenti giungono invece dal FADH 2 attraverso la succinato deidrogenasi, il complesso I non interviene nell ossidoriduzione e quindi il numero di protoni pompati nello spazio intermembrana è inferiore (6).

16 È stato calcolato che per la produzione di una molecola di ATP è necessario il flusso di protoni attraverso il canale dell ATP sintasi. Si può quindi calcolare che ciascuna molecola di NADH, quando viene riossidata tramite la CTE, porta alla produzione di 2,5 molecole di ATP. La riossidazione del FADH 2, partendo più a valle nella CTE (viene saltato l intervento del complesso I) ha invece una resa inferiore, pari a 2 molecole di ATP per molecola riossidata. Il gradiente elettronico: altre funzioni L energia potenziale del gradiente protonico creato ai due lati della membrana mitocondriale interna viene utilizzata, o almeno facilita, anche per scopi diversi da quello della produzione di ATP. In particolar modo viene impiegata per favorire il trasporto di molecole attraverso la membrana mitocondriale interna. ATP e ADP sono trasportati in direzione opposta (antiporto) dalla traslocasi dei nucleotidi purinici: l ADP dallo spazio intermembrana verso la matrice, l ATP in senso opposto. Poiché l ATP ha 4 cariche negative e l ADP tre, lo scambio realizzerebbe una differenza di cariche negative nei due ambienti; la presenza nello spazio intermembrana di una maggiore concentrazione di cariche positive facilita il flusso delle due molecole. Altro esempio è il trasporto nella matrice del fosfato inorganico necessario per la sintesi di ATP, che avviene contemporaneamente a quello di un protone H +. La maggiore concentrazione di questo all esterno rende più semplice il trasporto; in questo caso, a differenza di quanto avviene nell antiporto di ADP/ATP, una parte dell energia del gradiente elettrochimico, viene effettivamente consumata, poiché un protone torna nella matrice. Trasporto attraverso le membrane mitocondriali: i sistemi navetta I coenzimi purinici rappresentano la fonte di equivalenti riducenti che alimenta la CTE e la fosforilazione ossidativa. La maggior parte di questi viene prodotto nella matrice mitocondriale dal ciclo di Krebs e dalla

17 β ossidazione degli acidi grassi. Altri equivalenti riducenti sono tuttavia generati nel citosol, soprattutto dalle reazioni ossidoriduttive della glicolisi. La riossidazione di tali coenzimi è fondamentale per il proseguimento delle attività metaboliche aerobie; si pone tuttavia il problema del loro ingresso nei mitocondri. Ingegnosi sistemi navetta superano tale ostacolo. Tali sistemi sfruttano trasformazioni chimiche uguali, che avvengono in direzioni opposte ai lati della membrana mitocondriale, generando molecole che possono superare quest ultima. Nel rene, nel cuore e nel fegato il sistema più utilizzato è la navetta del malato-aspartato. Malato ed aspartato possono essere trasportati attraverso la membrana interna (l aspartato con contemporaneo flusso di protoni H + ) e trasformati l uno nell altro attraverso alcune reazioni, che, nel complesso, risultano nel trasporto netto di equivalenti riducenti (NADH) nella matrice mitocondriale. Nel muscolo e nel cervello il sistema navetta per il NADH coinvolge glicerolo-fosfato e diidrossiacetonefosfato. In questo caso, il ciclo di reazioni che fanno fluire gli equivalenti all interno del mitocondrio, porta alla trasformazione del NADH citoplasmatico in FADH 2 mitocondriale. Dal punto di vista energetico si ha una minore produzione di ATP (2 molecole invece di 2,5).

18 Regolazione della fosforilazione ossidativa La velocità con cui gli elettroni fluiscono lungo la CTE e l ATP viene prodotto dalla ATP sintasi è strettamente correlata alle esigenze energetiche della cellula, così come in genere lo è l insieme delle reazioni ossidative a carico dei nutrienti, da cui derivano gli equivalenti riducenti per la fosforilazione ossidativa stessa. Tale connessione esigenze/consumo di ossigeno si realizza attraverso la concentrazione dell ADP quale regolatore principale. Quale substrato necessario per la sintesi di ATP, la sua disponibilità regola e limita direttamente la reazione finale. In caso di mancata o ridotta sintesi di ATP (per assenza/carenza di ADP), l accumulo di H + nello spazio intermembrana raggiunge livelli massimi, oltre i quali non può procedere, e quindi la CTE viene bloccata/rallentata. Esiste quindi un accoppiamento fisico irrinunciabile tra CTE e sintesi di ATP e viceversa. Agenti capaci di dissociare i due fenomeni vengono detti disaccoppianti e sono generalmente veleni. Solo in condizioni particolari tale stretto connubio può venir meno. Un esempio è quanto succede nel grasso bruno (tessuto adiposo tipico dei neonati e degli animali che vanno in letargo), dove i mitocondri possiedono un disaccoppiante naturale (termogenina), che consente il trasferimento di elettroni lungo la CTE senza che venga prodotto ATP. La termogenina è un canale per protoni, che consentendo il flusso di H + dallo spazio intermembrana alla matrice, dissipa l energia del gradiente elettrochimico sotto forma di calore.

19 Riepilogo Le ossidoriduzioni sono reazioni chimiche fondamentali per il metabolismo cellulare e soprattutto per la produzione di energia. Sono reazioni caratterizzate da uno scambio di elettroni tra un donatore (agente riducente, che si ossida) e un accettore (agente ossidante, che si riduce). Essendo reazioni generalmente reversibili, quando un donatore cede elettroni, si trasforma in un accettore, e viceversa. Ciascuna coppia donatore/accettore è caratterizzata da un preciso valore di Potenziale di riduzione (E ), un parametro sperimentale (misurato in Volt) che misura l affinità di ciascun accettore per gli elettroni. Quando si uniscono due coppie donatore/accettore in una reazione redox il flusso di elettroni avverrà spontaneamente verso l accettore con maggiore affinità per gli stessi (E più positivo). La misura della differenza di potenziale (Δ E ) tra le due coppie (differenza tra i due E 0 ) è un indice della spontaneità o meno della reazione: se Δ E > 0 anche Δ G > 0. La catena di trasporto degli elettroni è un sistema di complessi proteici localizzati nella membrana mitocondriale interna che realizza, attraverso una serie di ossidoriduzioni successive, il flusso progressivo di elettroni dal NADH e FADH 2 all ossigeno, con produzione finale di H 2 O. Tale flusso avviene tra coppie redox con E via via più positivo, per una Δ E complessiva pari a 1,14 Volt. I complessi mitocondriali, mentre trasferiscono elettroni all ossigeno, pompano H + nello spazio intermembrana dei mitocondri. L accumulo di protoni in questa sede crea un gradiente elettrochimico ai due lati della membrana, che rappresenta una forma di energia potenziale. Tale energia è sfruttata dall enzima ATP sintasi per produrre ATP (fosforilazione ossidativa). Il meccanismo richiede il rientro di protoni nella matrice attraverso un canale costituito dall enzima stesso. In questo modo il trasporto di equivalenti riducenti lungo la CTE e la sintesi di ATP sono strettamente accoppiate. La riossidazione del NADH genera 2,5 molecole di ATP, quella del FADH 2 2 molecole.