Molecole che riconoscono gli antigeni nei Linfociti

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1 Molecole che riconoscono gli antigeni nei Linfociti Il riconoscimento dell antigene è altamente specifico Immunoglobuline: Libere (Anticorpi), prodotte dai Linfociti B Legate alla membrana dei Linfociti B a formare il BCR Recettore per l antigene dei Linfociti T (TCR)

2 Immunoglobuline Sono molecole glicoproteiche formate da 2 catene pesanti ( H ) e da due catene leggere ( L ) unite tra loro da ponti disolfuro. Ogni catena è formata da una Regione Variabile (V) e una Regione Costante (C) Ogni Regione è formata da una o più unità di peptidi omologhi detti Domini Immunoglobulinici

3 Schema generale della Struttura delle Immunoglobuline Cys-Cys V L V L N N C L V H V H Regione Cerniera C H 1 C H 2 Domini Variabili Domini Costanti C C H 3

4 Dominio Variabile delle Ig rappresentazione grafica della Variabilità (Kabat, 1970)

5 FUNZIONI DEI DOMINI DEGLI ANTICORPI FUNZIONI: V = Lega il determinante antigenico CH1 = stabilizza V e lega C4b CH2 = lega C1q CH3 (e CH4) = si legano al Recettore FcR

6 Classi Ig - umane Classi o Isotipi Catena Catene H IgG 1, IgG 2, IgG 3, IgG 4 γ 1, γ 2, γ 3,γ 4 IgM µ IgA 1, IgA 2 α 1, α 2 IgD IgE δ ε Catene L κ λ

7 RECETTORE PER L ANTIGENE DEI LINFOCITI B: BCR Struttura : Funzione : Finalità: Una Immunoglobulina di membrana (IgM o IgD) + due eterodimeri Igα (CD79a) e Igβ (CD79b) Riconoscimento Specifico dell antigene nativo Trasduzione del Segnale all interno del linfocita Internalizzazione del recettore con l antigene Attivazione cellulare o Delezione

8 STRUTTURA del BCR ITAM ITAM ITAM ITAM

9 Diversità degli anticorpi I determinanti antigenici delle Ig possono essere Comuni o Individuali: Isotipi: determinanti comuni presenti nelle Regioni Costanti. Rappresentano le variazioni nell ambito di specie differenti (Classi). Allotipi: varianti alleliche di un isotipo, specifiche per ciascun individuo della stessa specie. Idiotipi: determinanti individuali contenuti nelle Regioni Variabili di uno stesso individuo.

10 VARIABILITA dell IDIOTIPO Il sistema immune riconosce un numero virtualmente infinito di antigeni grazie alla elevata variabilità delle immunoglobuline sia libere che di membrana (BCR) e del TCR, Assicurando una risposta immune efficiente verso tutti i patogeni in continua evoluzione

11 Variabilità degli Anticorpi Cenno storico 1965 Dreyer e Bennet: due geni separati (V e C) per formare una molecola di Anticorpo 1970 Tonegawa: Pochi geni ricombinati per formare un Anticorpo specifico + taglio dei geni non espressi

12 GENERAZIONE DELLA VARIABILITA dell Idiotipo Utilizza un meccanismo di Ricombinazione Genica seguito dalla Rottura e dalla successiva Riparazione del Doppio Filamento del DNA (DSB): durante il differenziamento dei linfociti, diversi geni si ricombinano tra loro a caso per formare un solo gene.

13 GENI CHE CODIFICANO PER LE IMMUNOGLOBULINE NEI LINFOCITI B MATURI: GENI Geni della catena H Geni della catena k Geni della catena λ n geni che codificano per la regione V n geni che codificano per la regione C Cromosoma 3 (V - D- J) (V - J) (V - J) 1 22 V D H J H Cµ m Cδ Cγ3 Cγ 1 Cα1 Cγ2 Cγ4 Cε Cα2 V H C m V k J k Cκ Vλ Jλ Cλ

14 Origine della Regione Variabile: Si forma durante la maturazione dei Linfociti B nel midollo, indipendentemente dalla presenza dell antigene, tramite una Ricombinazione Somatica casuale tra elementi subgenici: segmenti genici V segmenti genici D segmenti genici J

15 NELLE CELLULE B GERMINALI CIASCUN GENE DELLA REGIONE V è UN GENE MULTIPLO: Geni Regione V Geni della catena H Geni della catena k Geni della catena λ n segmenti del gene V n segmenti del gene D n segmenti del gene ~ ~ ~ /5 J

16 GENI delle catene Ig umane (nei B germinali) 46

17 Loci delle catene H e L umane

18 Locus Vh germinale umano Localizzato sul cromosoma 14, è formato da circa 81 segmenti genici Vh raggruppati in 7 famiglie. Altri segmenti Vh (circa 24) sono stati individuati sui cromosomi 15 e 16. Soltanto 39/46 sono geni funzionali Alcuni segmenti sono polimorfici (POLIMORFISMO ALLELICO)

19 Fasi del Riarrangiamento V(D)J 1. Ricombinazione tramite meccanismo di Giunzione 2. Rottura del doppio filamento di DNA 3. Riparazione

20 RICOMBINAZIONE DEI GENI DELLE Ig durante il differenziamento dei linfociti B nel midollo Tramite un MECCANISMO DI GIUNZIONE V(D)J : Per la catena H: 1. Un segmento del gene D è selezionato a caso insieme a un segmento del gene J. 2. Successivamente, un segmento del gene V è selezionato a caso con il segmento DJ Per le catene k e λ : 1. Un segmento del gene V è selezionato a caso insieme a un segmento del gene J I segmenti genici selezionati si uniscono insieme dopo il taglio del DNA segue: Trascrizione del DNA, formazione di RNAm e quindi Traduzione

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22 Fasi del MECCANISMO DI GIUNZIONE V(D)J APPAIAMENTO DELLE SEQUENZE SEGNALE DI RICOMBINAZIONE (RSS) ADIACENTI AD OGNI SEGMENTO GENICO CODIFICANTE V,D e J. Le RSS sono di due tipi : RSS 12 formata da 1 eptamero conservato + 12 basi variabili (sequenza spaziatrice) + 1 nonamero conservato RSS 23 formata da 1 eptamero conservato + 23 basi variabili (sequenza spaziatrice) + 1 nonamero conservato. Le RSS 12 si accoppiano solo con le RSS 23

23 Localizzazione delle RSS nei geni delle Ig dei B germinali

24 V k1 J k1 Meccanismo di Giunzione: appaiamento RSS 12/23 Sequenza spaziatrice di 12 nucleotidi nonamero Sequenza spaziatrice di 23 nucleotidi eptamero V k1 J k1 taglio ricombinazione V k1 J k1

25 COMPONENTI DEL MECCANISMO V(D)J: Proteine specifiche dei linfociti: 1. RAG-1 e RAG-2 attività endonucleasica: provocano una rottura della doppia elica (DSB) del DNA 2. TdT Inserisce nucleotidi nelle giunzioni V(D)J (nucleotidi N). Proteine ubiquitarie di riparazione della DSB del DNA: 1. Ku70+ Ku80: DNA elicasi - si legano alle estremità tagliate del DNA stimolando la polimerizzazione del DNA - Reclutano gli altri membri della riparazione. 2. DNA PK: si lega al DNA - fosforila Artemis. 3. Artemis: attività endonucleasica 4. DNA-ligasi IV: lega le estremità del DNA

26 ROTTURA DEL DOPPIO FILAMENTO DI DNA (DSB) 1. RAG1 riconosce RSS 12, RAG2 si associa a RAG1 e all eptamero (Complesso Sinaptico). 2. Legame di un secondo complesso RAG1/RAG2 su RSS23 3. Interazione tra i due complessi 4. Rottura della doppia elica di DNA a livello dell Eptamero +RAG2 RAG1 5 3 V J RAG2 RAG1

27 5. Formazione delle Forcine tra le due estremità di DNA Tagliate : RAG1 + RAG2 5 3 V RAG J RAG2 Delezione

28 RIPARAZIONE del DNA 6. Associazione di Ku alle estremità del DNA. Attivazione della DNA-PK Fosforilazione di Artemis ê 7. Apertura delle forcine con perdita a caso di nucleotidi 5 3 V 3 5 J 8. Congiunzione delle estremità aperte di DNA Codificanti, tramite DNA-Ligasi IV. 9. Aggiunta di nucleotidi mediata da DNA-Polimerasi (nucleotidi P) o da Tdt (Nucleotidi N) Nucleotidi N Nucleotidi P Nucleotidi P 5 3 V 3 5 J

29 Schema degli eventi della ricombinazione V(D)J

30 RAG1 e RAG2 Catalizzano la ricombinazione V(D)J Sono espressi nei linfociti solo durante il riarrangiamento che avviene: Durante il differenziamento nel midollo nei centri germinativi 1.Differenziamento dei linfociti pro-b = riarrangiamento primario del DNA della catena H 2. Differenziamento dei linfociti pre-b = riarrangiamento primario del DNA della catena L 3. Revisione del recettore che riconosce il self = riarrangiamento secondario del DNA 4. Dopo il contatto con l antigene: Revisione del recettore per aumentarne l affinità = riarrangiamento secondario DNA

31 Revisione del Recettore Funzioni A livello centrale: per mantenere la Tolleranza, eliminando l autoreattività I linfociti B reattivi verso il Self mantengono elevati livelli di RAG producono nuovi recettori che non riconoscono il self In caso di fallimento, vengono eliminati per Apoptosi A livello periferico: per aumentare l Affinità degli Anticorpi I linfociti B dei Centri Germinativi con recettori a bassa affinità esprimono nuovamente RAG1 e RAG2 E producono recettori ad alta affinità che sfuggono all apoptosi. Circa il 25% dei B maturi deriva dalla Revisione del Recettore

32 DIFETTI DEL MECCANISMO V(D)J NELL'UOMO: SCID (Severe combined immunodeficiency) In circa il 30% dei pazienti vi può essere una mancanza di linfociti B in circolo (SCID B-). In questi casi è bloccata la ricombinazione V(D)J a vari livelli : mutazioni ereditarie nei geni RAG1 o 2 mutazioni del gene che codifica per Artemis

33 CAUSE DELLA DIVERSITA ANTICORPALE A) VARIAZIONI DELLA DIVERSITA IDIOTIPICA 1. Ricombinazione V(D)J (>10 10 ): Frequenza combinatoria dei geni V,D,J Diversita Giunzionale: a) delezioni ai punti di giunzione b) inserimento di nucleotidi addizionali (P e N) 1. Associazione casuale tra catena H e L 2. Revisione del recettore 3. Ipermutazioni somatiche B) VARIAZIONI DI FORMA E DI CLASSE Processazione (splicing) alternativa dell RNA a) forme di secrezione o di membrana b) co-espressione IgM E IgD 1. Scambio isotipico

34 Inserimento di Nucleotidi P e N durante l apertra delle forcine DNA polimerasi Tdt

35 Corrispondenza tra Segmenti Genici e Dominio V nelle Catene H Nucleotidi N e P 5 3 P L V J 3 H D C µ 5 CDR-H3 FR1 CDR1 F FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4 C H 1 N C V H

36 Sito Combinatorio per l Antigene

37 IPERMUTAZIONI SOMATICHE Mutazioni somatiche dei geni V nei linfociti B attivati dall esposizione all antigene e dalla cooperazione con i Linfociti T hanno una frequenza 100 volte maggiore delle mutazioni spontanee Funzione: Maturazione Affinità Meccanismo: attivazione del gene aid che codifica per l enzima AID (deaminasi). deaminazione dei residui di Citidina in Uridina nel ssdna formazione di diverse mutazioni punto selezione dei cloni ad alta affinità

38 Azione dell enzima AID nella Ipermutazione con intervento degli enzimi UNG e APE1 per creare una mutazione punto

39 Frequenza Ipermutazione Somatica

40 Aumento delle Ipermutazioni con le immunizzazioni nelle Regioni V

41 Ipermutazioni e Affinità Risposta Immune prima fase della risposta immune primaria fase tardiva della risposta immune primaria risposta secondaria e successive immunizzazioni Concentrazione antigenica Affinità degli anticorpi Origine dei cloni elevata bassa Riarrangiamento bassa alta Riarrangiamento Ipermutazione alta/bassa elevata Ipermutazione

42 Espressione dei diversi Isotipi: il cambio di classe e di forma varia le Funzioni ma non la Specificità Prima del contatto con l antigene: - Co-espressione IgM e IgD Dopo il contatto con l antigene: Produzione di forme secrete e di membrana Scambio isotipico (Switch)

43 Co-espressione IgM e IgD Le IgM (BCR con catene µ) e le IgD (BCR con catene δ) sono co-espresse dai Linfociti B al termine del differenziamento (B-mature) Meccanismo: splicing alternativo dell RNA

44 Coespressione IgM e IgD

45 Formazione di Ig Secrete e di Membrana Quasi tutte le Ig possono essere prodotte nelle due forme Meccanismo: Splicing alternativo dell RNA

46 IgM secrete e di membrana

47 SCAMBIO (" Switch") ISOTIPICO Dopo successivi contatti con lo stesso antigene, alcuni cloni di linfociti B sintetizzano isotipi diversi dalle IgM. Avviene sotto stimolo dei Linfociti T e delle citochine (IL-4, TGF e IFNγ ) Gli anticorpi variano la regione costante ma mantengono invariata la regione variabile della catena H = variano la funzione effettrice ma non variano la specificità

48 Induzione dello Scambio Isotipico

49 Meccanismo dello Switch Isotipico Ricombinazione e Delezione del DNA tra le Regioni switch (S) (sequenze geniche ricche di CG) Ogni Regione Costante, eccetto Cδ, è preceduta da un esone non traslato (esone I) e da una Regione S 1. Il segnale esterno indotto dalle Citochine attiva l esone I che apre l elica del DNA della Regione S 2. Intervento dell enzima AID che deamina la Citidina convertendola in Uridina 3. Intervento dell enzima riparatore del DNA (UNG) che rimuove l Uracile 4. Rottura del doppio filamento di DNA tramite l Endonucleasi (APE1) 5. Ricongiunzione delle due estremità di DNA tramite i meccanismi di riparazione

50 meccanismo dello Switch Isotipico I

51 Meccanismo di Rottura del DNA nello Switch Isotipico

52 Esclusione Allelica le cellule B esprimono una molecola di Ig con una sola specificità Il riarrangiamento avviene solo su un set genico La formazione di una catena (H ol) produttiva dà un segnale inibitorio sul riarrangiamento dell allele.

53 Controlllo trascrizionale durante lo sviluppo dei B (gene catena k) P P P E E P P P

54 CONTROLLO DELLA TRASCRIZIONE del gene della catena k Promotore Enhancer 5 -- OTTAMERO TATA -LVJ----- OTTAMERO --- MOTIVI kb --- MOTIVI ke ---Ck E OCT-1 OCT-1 NFkB HLH OCT-2 OCT-2 (Proteine E) Fattori di Trascrizione Lectine,IL-1,TNF,IL-2,ecc.

55 CONTROLLO DELLA TRASCRIZIONE del gene della catena H OTTAMERO --- TATA --LVDJ MOTIVI µ B -- OTTAMERO -- MOTIVI µ E Cµδγεα E ---3 OCT-1 bhlh OCT-1 bhlh (Proteine E) OCT-2 (Proteine E) OCT-2

56 Alcuni Fattori di Trascrizione attivi nei linfociti B Fattori Proteine E (bhlh) (E2A, EBF,E47.) Pax5 OCT1 e OCT2 GATA-2 PU.1 Ikaros IRF NFkB Azioni principali di controllo su: Espressione dei geni dei linfociti B, riarrangiamento locus H, sviluppo linfociti B Sviluppo progenitore linfoide B Si legano all ottamero Sviluppo cellule emopoietiche pluripotenti. Sviluppo cellule emopoietiche Maturazione linfociti Riarrangiamento della catena L pleiotropico

57 Fattori di Trascrizione nel riarrangiamento VDJ nei B E2A e EBF : controllano l iniziale riarrangiamento D H -J H attivano l espressione dei geni Rag promuovono l accessibilità della regione D-J Pax5 controlla il riarrangiamento secondario V-DJ,