METODI BIOCHIMICI ESERCIZI D ESAME (by NewSgrunt)

Transcript

1 METODI BIOCHIMICI ESERCIZI D ESAME (by NewSgrunt) A) SPETTROSCOPIA UV/vis, LAMBERT-BEER, STUDIO DELLE PROTEINE 1A) Il Citocromo c è caratterizzato dai seguenti coefficienti di estinzione molare: ε 280 = mol -1 cm.1 ε 415 = mol -1 cm -1 Una soluzione di citocromo c in una cuvetta da 1 ml assorbe A 280 = 0.17 A 415 = Calcolare la concentrazione della proteina. - Perché i valori ottenuti utilizzando i 2 coefficienti non sono uguali? - Se il Citocromo c pesa Da, quanti mg sono presenti in 1ml? 2A) Trovare la concentrazione di NAD + e NADH in una soluzione miscelata basandosi sui seguenti dati ottenuti in una cuvetta da 1 cm. I coefficienti di estinzione molare a 260 nm sono 1.5 x 10 4 mol -1 dm 3 cm -1 per il NADH e 1.84 x 10 4 mol -1 dm 3 cm -1 per il NAD +. A 340 nm solo il NADH assorbe con ε di 6.22 x 10 3 mol -1 dm 3 cm -1. La soluzione miscelata da assorbanze di 1.36 e 0,382 a 260 e 340 nm, rispettivamente. 3A) Il coefficiente di estinzione molare a 420 nm dell'enzima catalasi isolato da Aspergillus niger è pari a 150mM -1 cm -1. Sapendo che il peso molecolare della proteina è pari a Da, calcolare quanti mg di proteina sono presenti in una soluzione la cui assorbanza a 420 nm è pari a 1,5 in una cuvetta con un cammino ottico di 0.5 cm. 4A) Il coefficiente di estinzione molare a 420 nm dell'enzima catalasi isolato da Aspergillus niger è pari a 150mM -1 cm -1. Qual è la concentrazione molare di una soluzione dell'enzima la cui assorbanza a 420 nm è pari a 1.8 una cuvetta con un cammino ottico di 1 cm? Sapendo che il peso molecolare della proteina è pari a Da, calcolare quanti mg/ml di proteina sono presenti in soluzione? 5A) Quale di questi residui aminoacidici fornisce più importante contributo all'assorbimento delle proteine a 280 nm? - Prolina - Fenilalanina - Lisina - Metionina Spiegare quali caratteristiche chimiche di questo aminoacido spiegano la sua capacità di interagire con la luce ultravioletta? 6A) Determinare la concentrazione di una proteina che, analizzata in una cuvetta con un cammino ottico pari a 0.5 cm, assorbe 0,54 a 280 nm, sapendo che il suo ε 280 è pari a 2x10 5, quanti mg di proteina sono presenti in 1 ml se la proteina pesa 32 kda? 7A) Se una soluzione contenente ATP in una cuvetta da 1 cm ha un'assorbanza di 0.45 e un coefficiente di estinzione molare 1.54x10 4 mol -1 cm -1, determinare: - La concentrazione della soluzione di ATP - L'assorbanza di una soluzione di ATP 2.5x10-2 M in una cuvetta da 0,5 cm 1

2 8A) Per ciascuna coppia di lunghezze d'onda elencate di seguito, specificare quale è ad energia più alta e spiegare la ragione della risposta: (a) 280 nm (UV); 360 nm (VIS) (b) nm (microonda); 800 nm (VIS) 9A) Determinare la concentrazione di una proteina che, analizzata in una cuvetta con un cammino ottico pari a 0.5 cm, assorbe 0,84 a 280nm, sapendo che il suo ε 280 è pari a 2x10 3. Quanti mg di proteina sono presenti in 1 ml se la proteina pesa 32 kda? 10A) Sulla base dei seguenti dati sperimentali, ottenuti in un saggio con il metodo di Lowry, calcolare il valore della concentrazione (in mg/ml) del campione X. Assorbanza BSA 1mg/ml Campione X diluito 1:8 5 μl μL μL μL μL A) (2007) Il coefficiente di estinzione molare a 280nm di una proteina X è pari a M -1 cm -1 in una cuvetta da 1cm. Calcolare: - L assorbanza a 280nm di una soluzione 0.5M. - Dato che gli spettrofotometri convenzionali danno risultati significativi con assorbanze che vanno da 0 a 2, quanto diluireste la proteina perché si abbia un valore accettabile? - Se la proteina pesa 13400Da quanti mg sono presenti in 1 ml di una soluzione che assorbe 0.74 a 280nm? B) DETERMINAZIONE DELLA STRUTTURA PROTEICA 1B) Supponete di analizzare tramite SDS-PAGE una proteina purificata all omogeneità, il cui peso molecolare determinato per gel-filtrazione è pari a Da. L'analisi elettroforetica, dopo denaturazione del campione in assenza di agenti riducenti, evidenzia la presenza di due bande del peso molecolare pari a circa e Da, rispettivamente Lo stesso campione analizzato dopo denaturazione in presenza di ditiotritolo evidenzia una singola banda di peso pari a circa Da. - Quale potrebbe essere la struttura quaternaria della proteina e come potrebbero unite tra loro le diverse subunità? - Quale tecnica alternativa utilizzereste per calcolare il peso molecolare assoluto della proteina? 2B) Supponete di analizzare tramite SDS-PAGE una proteina purificata all'omogeneità. L'analisi elettroforetica dopo denaturazione del campione in assenza di agenti riducenti, evidenzia la presenza di una singola banda del peso molecolare pari a circa Da. Lo stesso campione analizzato dopo denaturazione in presenza di ditiotritolo evidenzia due bande di peso pari a circa e Da, rispettivamente. - Quale potrebbe essere la struttura quaternaria della proteina e come potrebbero essere unite tra loro le diverse subunità? - Il peso molecolare di questa stessa proteina determinato tramite gel filtrazione è pari a circa Da. Come potreste spiegare questa discrepanza? 3B) Spiegare la funzione di ciascuno dei seguenti composti chimici usati nell elettroforesi su gel delle proteine: - Acrilammide - Temed 2

3 - Blue coomassie 4B) Spiegare la funzione di ciascuno dei seguenti composti chimici usati nell'elettroforesi denaturante su gel delle proteine: - Metylen-bis-acrilammide - Sodio dodecil solfato - Blue di bromofenolo 5B) Supponete di analizzare tramite SDS-PAGE una proteina altamente purificata il cui peso molecolare determinato tramite gel filtrazione sia pari a circa Dalton. L analisi elettroforetica, dopo denaturazione del campione in presenza di ditiotritolo, evidenzia la presenza di due catene polipeptidiche di massa molecolare pari a circa e Da, rispettivamente. Lo stesso campione analizzato in seguito a denaturazione in assenza di agenti riducenti evidenzia due bande di peso pari a circa e Da, rispettivamente. - Quale potrebbe essere la struttura quaternaria della proteina e come sono unite tra loro le diverse subunità? 6B) Schematizzare un esperimento per determinare se un enzima purificato è monomerico o composto da subunità, ed eventualmente se è composto da subunità uguali o diverse. 7B) Da quale dei seguenti fattori è influenzata la velocità di migrazione di una molecola in un gel di poliacrilammide denaturante (SDS-PAGE)?. - coefficiente frizionale - peso molecolare - forma della molecola - campo elettrico applicato - presenza di agenti riducenti - forza ionica del tampone - punto isoelettrico 8B) Quali frammenti vengono prodotti dal trattamento con bromuro di cianogeno (CNBr) del seguente peptide: Val-Lys-Glu-Met-Ser-Trp-Arg-Ala - Val-Lys + Glu-Met-Ser-Trp-Arg-Ala - Val-Lys-Glu-Met-Ser-Trp + Arg-Ala - Val-Lys-Glu-Met + Ser-Trp-Arg-Ala - Val-Lys-Glu + Met-Ser-Trp-Arg-Ala - Val-Lys-Glu-Met-Ser + Trp-Arg-Ala C) METODI CROMATOGRAFICI 1C) La carica di una resina scambiatrice cationica è: - Positiva - Negativa - Neutra Sapendo che gli analizzatori automatici di aminoacidi sono strumenti che separano automaticamente gli amino acidi tramite, cromatografia per scambio cationico, predire l'ordine di eluizione (dal primo all'ultimo) per i seguenti aminoacidi a ph 4.0: Glicina, Acido aspartico, Istidina 3

4 2C) Spiegare il principio della cromatografia per interazione idrofobica. In che modo viene comunemente favorito il legame delle proteine solubili alle resine utilizzate in questo tipo di cromatografia? 3C) Definite il concetto di coefficiente di ripartizione in cromatografia 4C) Quale/i delle seguenti tecniche si potrebbero utilizzare per purificare le proteine contenute nella seguente miscela : Mioglobina di cavallo (PM 16.9 kd; pi 7.0) + Citocromo c (PM 11.7 kd; pi 10.6) + Albumina (PM 68 kd; pi 4.9) - Colorazione secondo il metodo di Lowry - SDS-PAGE + colorazione secondo Coomasie - Isoelectrofocusing - Cromatografia in scambio ionico - Cromatografia in gel filtrazione - Immunoprecipitazione Spiegare perchè e quale tecnica ha maggiore probabilità di successo. 5C) Determinare il peso molecolare approssimativo di una proteina che eluisce da una colonna cromatografica per gel filtrazione (eluita a flusso costante) con tempo di ritenzione t R = 40 min, sulla base dei seguenti dati sperimentali su proteine utilizzate come standard: PM proteina (D) t R (min) C) Quali tecniche si potrebbero utilizzare per purificare le 3 proteine (di cui è riportata la composizione aminoacilica) contenute nella seguente miscela: 1) Ala 10%, Gly 20%, Asp 20%, Glu 15%, Pro 5%, Ser 20 %, Cys 10% 2) Ala 30%, Gly 20%, Asn 5%, Glu 20%, Ser 10 %, Val 10%, Thr 5% 3) Ala 20%, His 10%, Lys 10%, Ser 10%, Vai 10%, Thr 5%, Arg 10%. Non disponendo di anticorpi contro la proteina 3? Spiegare perchè e quale tecnica ha maggiore probabilità di successo. 7C) (2007) Una proteina eluisce da una colonna cromatografica per gel filtrazione (eluita a flusso costante), viene usato un Tampone generico (ph 8.0, TRIS) ed ha V R di 24 min. La stessa proteina eluita allo stesso modo ma con un tampone contenente NaCl 0.3 M ha un V R di 41 min. Non sono rilevate variazioni nella forza ionica. Sulla base dei seguenti dati sperimentali su proteine utilizzate come standard PM proteina (D) V R (min) (a) Calcolare i PM ai V R rispettivi (b) Spiegare la differenza di eluizione dalla colonna. 4

5 D) TECNICHE CENTRIFUGATIVE 1D) Spiegare il principio della centrifugazione in gradiente di densità ed illustrare alcune delle sue applicazioni nella ricerca biochimica. 2D) Descrivere brevemente l'utilizzo di tecniche centrifugative per la concentrazione di soluzioni proteiche E) METODI CHE UTILIZZANO ANTICORPI 1E) Spiegare brevemente il principio del dosaggio ELISA 2E) Descrivere brevemente una tecnica immunochimica utilizzabile per la localizzazione di un antigene in un tessuto 3E) Spiegare brevemente il metodo che si utilizza per generare anticorpi monoclonali 4E) Descrivete brevemente il principio del Radio Immuno Assay (RIA) 5E) (2007) Descrivere brevemente il principio del Western blotting F) PRODUZIONE DI PROTEINE RICOMBINANTI 1F) Quale(i) di queste affermazioni è corretta? - Le proteine prodotte in E.coli non possiedono legami disolfuro; - Le proteine prodotte in E.coli non possiedono modificazioni glucidiche; - Le proteine di mammifero devono essere espresse necessariamente in cellule in coltura perché nei batteri non riescono ad avvolgersi nella loro conformazione tridimensionale corretta: - Produrre proteine di mammifero in E.coli è conveniente perché ci sono meno proteasi: - La produzione di proteine da organismi superiori in E.coli può essere complicata da un diverso uso del codice genetico. 2F) Produrre una proteina come fusione con un'altra sequenza aminoacidica può essere utile per: - Ottenere la proteina nella conformazione corretta - Facilitare la purificazione della proteine ricombinante - Indirizzare la proteina nel periplasma batterico - Stabilizzare proteine di basso peso molecolare altrimenti degradate nei batteri - Rendere possibile la formazione di legami disolfuro in un ambiente riducente 3F) Indicate schematicamente un protocollo da seguire per produrre una proteina ricombinante in E.coli a partire dall RNA messaggero per tale proteina 4F) A cosa serve il gene per la resistenza ad un antibiotico in un vettore di clonaggio? (Spiegare brevemente la risposta): - Permette al vettore di replicarsi - E un marcatore di selezione - Consente la crescita dei batteri 5F) Disegnate in modo schematico la mappa di un plasmide per l'espressione di una proteina periplasmatica in E. coli. Quali elementi deve contenere? In che ordine? 5

6 6F) Per quale di queste ragioni può essere conveniente produrre una proteina ricombinante nel periplasma piuttosto che nel citoplasma di E.coli? - la produzione della proteina è sempre più abbondante - nel periplasma le proteine non aggregano formando i corpi di inclusione - il periplasma è un ambiente ossidante che favorisce la formazione di legami disolfuro - nel periplasma non ci sono proteasi - il numero di proteine presenti nel periplasma è basso, rendendo quindi più facile la purificazione della proteina d interesse G) PURIFICAZIONE, CONCENTRAZIONE, CARATTERIZZAZIONE DELLE PROTEINE 1G) Spiegare il principio della purificazione frazionata delle proteine con solfato d'ammonio. Per. quale motivo la precipitazione frazionata con sali viene generalmente utilizzata nelle prime fasi della purificazione delle proteine? 2G) Spiegare brevemente il principio su cui si basa la spettrometria di massa 3G) Le tecniche di spettroscopia ESR consentono: - Di identificare metalli presenti nella proteina - Misurare l'attività catalitica delle proteine - Di identificare il tipo di strutture secondarie presenti nelle proteine - Identificare protoni che interagiscono tra di loro - Misurare la produzione di radicali liberi H) ANALISI DELLA STRUTTURA 3D DELLE PROTEINE 1H) Le tecniche NMR di tipo bidimensionale consentono: - Di identificare metalli presenti nella proteina - Misurare l'attività catalitica delle proteine - Di identificare il tipo di strutture secondarie presenti nelle proteine - Identificare protoni che interagiscono tra di loro - Misurare la produzione di radicali liberi 2H) Discutere i vantaggi e gli svantaggi dell'utilizzo dell'nmr nella determinazione della struttura tridimensionale delle proteine rispetto alla cristallografia a raggi X. 3H) Spiegare brevemente il principio della risonanza magnetica nucleare (NMR). Che tipo di proteine sono analizzabili mediante questa tecnica? Che informazioni fornisce? I) GENOMICA E PROTEOMICA 1I) Descrivere in modo schematico e sintetico le diverse fasi di un esperimento di analisi di espressione genica che utilizzi dei microarray. L) ENZIMI 1L) Calcolo della V max e K M. I seguenti dati sperimentali sono stati raccolti durante lo studio dell attività catalitica di una peptidasi intestinale capace di idrolizzare il dipeptide glicilglicina: Gligilglicina + H 2 O -> 2 Glicina 6

7 [S] (mm) Prodotto Formato / Velocità (μmol/min) Da questi dati determinate tramite un analisi in grafico i valori di V max e di K M per questa preparazione enzimatica e per questo substrato. 2L) La cinetica allo stato stazionario di un enzima viene studiata in presenza ed assenza di un inibitore. La velocità è data in funzione della concentrazione di substrato nella tabella riportata: [S] (mm) V 0 Senza Inibitore V 0 Inibitore 5mM (a) Calcolare i valori di V max e K M in assenza di inibitore (b) Di che tipo di inibitore si tratta? V 0 Inibitore 3mM 1,25 1,54 2,0 2, L) Purificazione di un enzima. Supponiamo che abbiate purificato un enzima seguendo le tappe descritte nella tabella di purificazione riportata qui sotto. Calcolare dopo ogni tappa della procedura di purificazione: - l attività specifica (U/mg) della soluzione enzimatica - la resa dell enzima - il livello di purificazione dell enzima (è una misura di quanto aumenta l attività specifica nei vari passaggi) Riportate i dati in tabella 7

8 Quale tra le procedure utilizzate è risultata, a vostro giudizio, più efficace? E perché? Quale tra le procedure utilizzate è risultata, a vostro giudizio, la meno efficace? E perché? Dai dati mostrati in tabella vi sono indicazioni che dopo l ultima tappa di purificazione l enzima sia allo stato puro? 4L) Purificazione di un enzima. Supponiamo che abbiate purificato un enzima seguendo le tappe descritte nella tabella di purificazione riportata qui sotto. Calcolare dopo ogni tappa della procedura di purificazione: - l attività specifica (U/mg) della soluzione enzimatica - la resa dell enzima - il livello di purificazione dell enzima (è una misura di quanto aumenta l attività specifica nei vari passaggi) Riportate i dati in tabella Quale tra le procedure utilizzate è risultata, a vostro giudizio, più efficace? E perché? Quale tra le procedure utilizzate è risultata, a vostro giudizio, la meno efficace? E perché? Dai dati mostrati in tabella vi sono indicazioni che dopo l ultima tappa di purificazione l enzima sia allo stato puro? 8

9 M) GENERICHE 1M) Quale tra le tecniche elencate può essere utilizzata per gli obiettivi indicati? È possibile indicare anche più di una tecnica. 2M) Descrivere schematicamente il procedimento per determinare il peso molecolare di una proteina 9

10 N) LABORATORIO DI METODI BIOCHIMICI 1N) L enzima superossido dismutasi da Haemophilus ducreyi è caratterizzato dai seguenti coefficienti di estinzione molare: ε 280 = M -1 cm -1 ε 408 = l00000 M -1 cm -1 Il coefficiente di estinzione a 280 nm è essenzialmente dovuto alla parte proteica, mentre quello a 408 nm è attribuibile alla presenza del cofattore eme. A partire da una preparazione dell'enzima ottenuta tramite cromatografia di affinità caratterizzata dai seguenti valori di Assorbanza: A 280 = 0.63, A 408 = 1.33 Determinare: - La concentrazione molare della proteina - La percentuale di molecole che legano il cofattore eme - La concentrazione in mg/ml della proteina, sapendo che il suo peso molecolare è Da. 2N) L'enzima superossido dismutasi da Haemophilus ducreyi è caratterizzato dai seguenti coefficienti di estinzione molare: ε 280 = M -1 cm -1 ε 408 = l00000 M -1 cm -1 Il coefficiente di estinzione a 280 nm è essenzialmente dovuto alla parte proteica, mentre quello a 408 nm è attribuibile alla presenza del cofattore eme. A partire da una preparazione dell'enzima ottenuta tramite cromatografia di affinità, caratterizzata dai seguenti valori di Assorbanza: A 280 = 0.44, A 408 = 1.28 Determinare: - La concentrazione molare della proteina - La percentuale molecole che legano il cofattore eme - La concentrazione di mg/ml della proteina sapendo che il suo peso molecolare è Da. Dalle dispense del N) Come può essere purificata una proteina in un solo passaggio cromatografico? 4N) E possibile modificare le proteine per favorirne la purificazione? 5N) Come si può controllare il successo della procedura? 6N) Come è possibile verificare la purezza di una proteina purificata? 7N) Come è possibile determinarne il PM approssimativo? 8N) Come è possibile determinare la composizione in subunità di una proteina? 10

11 Free Multi-Width Graph Paper from

12 Free Multi-Width Graph Paper from