Sostanze non volatili possono essere derivatizzate
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- Amando Sacchi
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1 Gascromatografia Permette la separazione di sostanze gassose o gassificabili variando la temperatura. Sono sostanze a basso peso molecolare, di natura poco polare, assolutamente non ionica. Eventualmente vengono trasformate. FASE STAZIONARIA SOLIDA (cromatografia di adsorbimento) LIQUIDA su supporto solido (cromatografia di ripartizione) FASE MOBILE GASSOSA Soluto volatile T iniezione : 50 C >T colonna T colonna : dipende dalla volatilità dei soluti Sostanze non volatili possono essere derivatizzate 1
2 R R H C COO - 3 N + CF 3 C NH CH COOCH(CH 3 ) 2 H O N-trifluoroacetilisopropilestere (volatile) All uscita del rivelatore i soluti possono essere raccolti per l identificazione (metodi spettroscopici; MS) 2
3 Cromatogramma Risposta registratore AB = W = 4σ LINEA DI BASE A B In gascromatografia si usa il tempo di ritenzione (t r ) più del volume di ritenzione (V r ). Linea di base: Picco: tratto di cromatogramma dove non viene registrato nessun componente segnale che si ottiene in corrispondenza dell uscita dell analita dalla colonna al rivelatore Tempo di ritenzione, t r : tempo trascorso dal momento dell introduzione del campione a quello di massima risposta Volume di ritenzione, V r : volume di gas passato attraverso la colonna dall introduzione alla massima risposta per un certo componente V r = t r u u = portata del carrier Tempo di ritenzione corretto, t r : t r' = t r t m 3
4 L equazione di van Deemter vale anche per la gascromatografia: B HETP = A + + Cu u Resistenza al trasferimento di massa Diffusione longitudinale Diffusione vorticosa In gascromatografia è molto importante la diffusione longitudinale. Calcolare quanti piatti teorici sono necessari per avere R=0.98 con =1.075 e =1.375 e k 2 grande. (3032;198) 2000 piatti teorici sono facilmente raggiungibili, ed è abbastanza facile arrivare a Iniezione 4
5 setto setto ingresso carrier fornetto dell iniezione liner colonna Caratteristiche della colonna cromatografia in funzione del tipo d impiego Diametro della colonna (mm) Tipo di riempimento Solo liquido Ripartizione (col. capillare) Quantità di sostanza introducibile 0.01 µl Impiego Pareti interne ricoperte con supporto più liquido di µl Per separazioni estremamente difficili 5
6 ripartizione (col. SCOT) Ad impaccamento µl Con rivelatori a ionizzazione o microcatarometrici µl Con catarometri µl Per scopi preparativi Materiali: Foggia: Lunghezza: acciaio inossidabile vetro (se il metallo interagisce) a U a spirale (con diametro della spirale almeno 10 volte superiore rispetto al diametro interno) 1-4 m per colonne impaccate m per colonne capillari Le colonne si possono preparare oppure acquistare già pronte. 6
7 Per quanto riguarda le colonne capillari: la fase stazionaria riveste la parte interna del capillare: cioè elimina la diffusione vorticosa. è inoltre diminuita la resistenza al flusso (si possono usare colonne molto lunghe). si possono trattare solo quantità di campione piccole (uso dei divisori che permettono l entrata in colonna di 0.1-5% del campione). 7
8 Esempi di applicazioni Influenza della temperatura sul tempo di analisi L aumento della temperatura porta ad un accorciamento dell analisi in quanto t r α 1/T secondo una funzione logaritmica. Approssimativamente t r diminuisce della metà per ogni 30 C di aumento della temperatura. Normalmente la temperatura della colonna è regolata al valore corrispondente alla media dei punti di ebollizione dei componenti la miscela. Per miscele di composti con punti di ebollizione molto distanti tra loro (>100 C) conviene quindi ricorrere ad una temperatura programmata. 8
9 ISOTERMA 10 C II isoterma I isoterma TEMPERATURA PROGRAMMATA 15 C 10 C ISOTERMA TEMPERATURA PROGRAMMATA 9
10 Rivelatori Rivelatore a conducibilità termica (o catarometro o a filo caldo), TCD Intervallo dinamico:10 4 Sensibilità modesta Non distruttivo controllo corrente filamento carrier azzeramento ponte campione + carrier alimentazione registratore Si basa sulla variazione di conducibilità termica del gas vettore dovuta alla presenza in esso di specie eluite dalla colonna. Si usa un filamento di tungsteno o tungsteno-renio riscaldato da una corrente continua, la cui resistenza varia in funzione della temperatura. La resistenza di misura e quella di riferimento sono collegate tra loro secondo il ponte di Weatstone: quando passa un gas con diversa conducibilità termica le resistenze si sbilanciano e si ha un segnale. Il segnale viene di solito registrato senza preamplificazione. 10
11 Conducibilità termica di vari gas a 100 C Rivelatore a ionizzazione di fiamma, FID Intervallo dinamico: 10 7 (il più ampio che si conosca) Sensibilità*: g/sec (100 volte migliore di TCD) Distruttivo Selettivo per composti organici contenenti il gruppo -CH catodo Aria (comburente) ugello=anodo Idrogeno (combustibile) fine colonna * quantità di sostanza che dà un picco 2 volte più grande del rumore di fondo, diviso la larghezza del picco (g/sec) 11
12 La conducibilità elettrica di un gas è direttamente proporzionale alla concentrazione di particelle cariche in esso contenute. In assenza di composti organici, si formano soltanto radicali liberi H, OH, O. Gas di trasporto: azoto (inerte), genera una debole corrente di fondo. Il potenziale tra gli elettrodi (300 V) deve essere alto in modo da catturare tutte le cariche senza provocare ulteriori ionizzazioni. In presenza di composti organici, la fiamma provoca combustione e successiva formazione di intermedi ionici (ioni positivi ed elettroni) che generano un segnale elettrico. La corrente di ionizzazione deve essere amplificata, tenendo conto delle concentrazioni da determinare. La risposta del FID è proporzionale al numero di atomi di carbonio presenti nella sostanza. Gas non combustibili (H 2 O, CO 2, SO 2, NO X ) non danno segnale. 12
13 In gascromatografia il carrier gassoso ha la sola funzione di trasportare gli analiti lungo la colonna. Solo nella gas-solido si è notata una influenza del carrier su t r. Dato che i gas più polari danno tempi di ritenzione più corti, si pensa che competano con l analita per i siti attivi della fase solida (esattamente come il solvente nella LC di adsorbimento). Analisi gascromatografica qualitativa I picchi vengono identificati da t r. Tuttavia t r assoluto non ha significato perché dipende dalle condizioni, alcune delle quali non esattamente controllabili (impiccamento, invecchiamento,..) t r relativo rapporto tra t r della sostanza e t r di una sostanza assunta come standard (di solito N-pentano) indice di ritenzione di Kovats Metodi di identificazione: 13
14 o arricchimento con componenti noti se un picco aumenta per aggiunta di un componente si può pensare che tale aumento sia dovuto a quel componente. Non è sicuro, tuttavia se lo stesso effetto si ha su colonne diverse è un forte indizio. o modificazione chimica del campione si fa reagire opportunamente il campione e si confrontano i gascromatogrammi ottenuti prima e dopo modificazione (es. alcoli per acetilazione) o uso di rivelatori selettivi: rivelatore a cattura di elettroni (sostanze clorurate, polinucleari, nitroderivati) rivelatore a fotometria di fiamma (FPD, per sostanze solforate e fosforate) rivelatore termoionico (sostanze azotate e fosforate) spettrometro di massa per una identificazione più sicura Analisi gascromatografica quantitativa l area dei picchi è proporzionale alla quantità di analita meno influenzata dalle condizioni sperimentali più difficile da misurare l altezza dei picchi è influenzata da molti fattori 14
15 a) TARATURA DIRETTA: A picco curva di standarizzazione concentrazione stdandard Si introduce una quantità nota di campione e si paragonano le aree con quelle degli standard. Valido solo se le quantità introdotte sono riproducibili. b) STANDARIZZAZIONE INTERNA: si aggiunge alla miscela da analizzare una quantità esatta di un componente diverso (standard) A : c = S s A X : c X cs AC c X = AC S X AC = area corretta, è quella che si otterrebbe se il componente considerato desse al rivelatore una risposta uguale a quella di un 15
16 riferimento. Può essere calcolata utilizzando un fattore di correzione. Sostanze volatili Le sostanze volatili contenute in un campione liquido possono essere introdotte nel GC col metodo dello spazio di testa. Chiusura: gomma autosaldante perforabile con l ago di una siringa o microsiringa con cui si fa il prelievo (pochi µl di vapore). La standardizzazione si esegue con lo stesso metodo. Ovviamente permette di prelevare solo i campioni volatili. 16
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