In laboratorio si devono osservare delle norme necessarie ad evitare incidenti che talvolta possono rivelarsi estremamente pericolosi.

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1 In laboratorio si devono osservare delle norme necessarie ad evitare incidenti che talvolta possono rivelarsi estremamente pericolosi. 1. E ovviamente vietato fumare. 2. Non distrarsi in nessun caso, nè alzare la voce. Concentrarsi unicamente sulle operazioni da compiere al fine di evitare spiacevoli incidenti. 3. Esperienze semplici come questa possono rivelarsi pericolose. E necessario quindi: a. Evitare di respirare i vapori dei solventi organici. b. Fare estremamente attenzione agli accessori in vetro: pipette, capillari e vetreria da laboratorio in genere. c. Usare gli occhiali di protezione se si devono prelevare solventi, in particolare il cloroformio; quest ultimo può causare danni alla cornea. d. Non guardare direttamente la luce generata dalla lampada UV, in quanto i raggi UV sono dannosi per la retina. e. Usare i guanti, se in dotazione, al fine di evitare eventuali contatti di sostanze organiche pericolose con la pelle. Per qualsiasi dubbio o problema rivolgersi al docente o ai tecnici di laboratorio.

2 Le tecniche cromatografiche La nascita della cromatografia si deve al botanico russo Mikhail S. Tsvett, che per primo la utilizzò nel 1903 per separare i pigmenti naturali contenuti in estratti vegetali. La cromatografia è un metodo di separazione che si basa sulla differente ripartizione dei composti di una miscela tra una fase mobile ed una fase stazionaria fissa. Mikhail S. Tsvett ( ) La cromatografia è un metodo di separazione che si basa sulla differente ripartizione dei composti di una miscela tra una fase mobile ed una fase stazionaria fissa.

3 Natura della fase mobile Tipi di Cromatografia Fase mobile: LIQUIDA CROMATOGRAFIA LIQUIDA (LC) GASSOSA GAS-CROMATOGRAFIA (GC) e della fase stazionaria Fase mobile: Fase stazionaria: GASSOSA GAS-CROMATOGRAFIA (GC) SOLIDA CROMATOGRAFIA GAS-SOLIDO LIQUIDA CROMATOGRAFIA GAS-LIQUIDO Fase mobile: Fase stazionaria: LIQUIDA CROMATOGRAFIA LIQUIDA (LC) SOLIDA CROMATOGRAFIA LIQUIDO-SOLIDO LIQUIDA CROMATOGRAFIA LIQUIDO-LIQUIDO

4 Natura delle interazioni Tipi di Cromatografia Adsorbimento: interazioni di adsorbimento del soluto sulla superficie solida della fase stazionaria.

5 Natura delle interazioni Tipi di Cromatografia Ripartizione: interazioni di ripartizione del soluto tra la fase mobile ed una fase liquida che riveste la fase stazionaria solida e legata ad essa in maniera covalente.

6 Cromatografia Liquida Cromatografia su Strato Sottile, TLC La più semplice forma di cromatografia liquida è la cromatografia planare o cromatografia su strato sottile (TLC, Thin Layer Chromatography). È una tecnica estremamente semplice e veloce che consente l analisi qualitativa dei componenti di una miscela e trova ampia applicazione come supporto ad un gran numero di metodologie di laboratorio. La fase stazionaria è solida e tipicamente si tratta di un sottile strato di silice (biossido di silicio) o allumina (ossido di allumino) adsorbito su un supporto inerte di plastica, di alluminio (lastrina) o meno comunemente di vetro. La fase mobile detta anche eluente è un liquido organico che si muove lungo la fase stazionaria per capillarità.

7 Cromatografia Liquida Cromatografia su Strato Sottile, TLC

8 Le sostanze da analizzare, pure o in miscela, vengono depositate in soluzione diluita sulla fase stazionaria con l aiuto di un capillare.

9 La lastrina viene poi immersa alla base nella fase mobile, avendo cura che il liquido non ricopra le sostanze depositate:

10 La fase mobile sale lungo la fase stazionaria per capillarità trascinando con se le sostanze. La corsa di una sostanza dipenderà dal grado di interazione di questa con la fase stazionaria:

11 Una volta asciugato il solvente, le macchie di sostanza possono essere caratterizzate dal fattore di ritardo (R f ), che esprime l affinità relativa della sostanza per il sistema fase mobile/fase stazionaria:

12 Interazioni dei composti con la fase stazionaria La cromatografia su strato sottile è una cromatografia di adsorbimento, in cui la separazione viene determinata dalle differenti interazioni delle molecole con le particelle di fase stazionaria. Nella sua forma più comune, la fase stazionaria è un solido polare mentre la fase mobile è costituita da solventi organici a diversa polarità (cromatografia in fase diretta). La fase stazionaria di silice è polare dal momento che in superficie il polimero di biossido di silicio espone sia dei legami Si-O polarizzati che dei gruppi funzionali Si-OH (silanoli):

13 Quando la fase mobile sale lungo la silice, i composti in essa disciolti sono in grado di interagire con i gruppi polari della silice. Le interazioni in gioco sono principalmente dipolo-dipolo e formazione di legami ad idrogeno e dunque quanti più polari sono i composti, tanto più verranno trattenuti dalla fase stazionaria. Fase Mobile

14 La CROMATOGRAFIA DI ADSORBIMENTO Le tecniche cromatografiche sono comunemente utilizzate per la separazione e la purificazione di composti organici. Esse si basano sulle differenze nei coefficienti di ripartizione dei componenti di una miscela fra una fase stazionaria ed una fase mobile. Tra le varie tecniche cromatografiche, la cromatografia di adsorbimento solido - liquido è quella più utilizzata per la separazione di una miscela di composti organici nei suoi costituenti in quanto è estremamente semplice e versatile. La fase stazionaria più comunemente usata è la silice, mentre la fase liquida (fase mobile), che viene fatta passare attraverso la fase stazionaria, è un solvente organico (normalmente definito eluente), come cloroformio, etere etilico, etere di petrolio (miscela di idrocarburi a basso peso molecolare), n-esano, acetato di etile, ecc., o una miscela di questi. Il principio alla base della cromatografia è la differente affinità che ciascuna sostanza organica ha nei confronti della fase mobile e della fase stazionaria. Tale affinità è una caratteristica intrinseca di ciascun composto organico, dipendente da polarità, dimensione e volume delle molecole, ecc. Pertanto alcune sostanze sono trascinate più rapidamente dalla fase mobile, altre più lentamente, permettendo di effettuare una completa separazione dei composti costituenti la miscela.

15 Ordine di eluizione di composti organici sulla silice

16 La Cromatografia su strato sottile (THIN LAYER CHROMATOGRAPHY o TLC) La Cromatografia su strato sottile (TLC - Thin Layer Chromatography) consente un analisi qualitativa della miscela utilizzando piccole quantità. In questo modo si può identificare il numero di componenti presenti, o anche riconoscere i composti costituenti la miscela in base alla loro affinità nei confronti delle due fasi (che si identifica in un parametro chiamato R f ). Può anche essere utilizzata come preliminare alla cromatografia su colonna (ricerca degli eluenti adatti per la separazione) o per controllare il decorso di una reazione (scomparsa dei reagenti/formazione dei prodotti).

17 ESECUZIONE L esercitazione consiste nell effettuare due lastrine TLC analitiche di una miscela binaria ed identificare sia i componenti costituenti la miscela, sia il migliore eluente, tra i due a disposizione, per una buona separazione. La miscela è composta da Bifenile e Benzofenone. O Bifenile Benzofenone I due eluenti sono: 1) Cloroformio; e 2) una miscela di Etere etilico/etere di petrolio (1:1, v/v).

18 Procedura 1) Tracciare delicatamente con la matita sulla TLC, facendo attenzione a non staccare la silice dal supporto in alluminio, una linea parallela al lato più stretto e distante 1-2 centimetri dal bordo. Sempre con la matita tracciare tre piccole crocette sulla linea già tracciata dove successivamente saranno caricati: A = Benzofenone B = Bifenile C= Miscela 2) Aggiungere ai campioni in provetta (Benzofenone, Bifenile e Miscela, che vi saranno consegnati all inizio dell esercitazione) una piccola quantità di cloroformio (circa 1 ml) ed accertarsi, dopo alcuni istanti, della loro completa dissoluzione.

19 3) Introdurre un capillare in una delle provette contenente i campioni e verificare che per capillarità parte del liquido venga prelevato dal capillare stesso. Depositare quindi delicatamente e con precisione il capillare caricato con la sostanza su una una delle crocette tracciate in precedenza sulla lastrina, controllando il trasferimento della soluzione sulla lastrina. Ripetere l operazione per gli altri campioni.

20 4) Attendere alcuni secondi che il solvente utilizzato per il caricamento sia evaporato. Porre la lastrina all interno della camera di sviluppo verticalmente, con il bordo dove vi sono i campioni rivolto verso il basso, fino ad adagiarla sul fondo della camera stessa.

21 5) Quando il fronte dell eluente ha raggiunto una distanza minima dal bordo superiore (circa 1 cm), prelevare la lastrina e con la matita segnare rapidamente (tracciando una linea) il fronte raggiunto dall eluente prima che questo evapori. 6) Attendere l evaporazione dell eluente ed osservare la lastrina alla luce UV. Evidenziare con la matita le macchie visualizzate e calcolare il valore di R f per ciascuna sostanza pura. 7) Ripetere l operazione utilizzando il secondo sistema eluente.

22 ANALISI DEI DATI 1) Identificare i due composti dal confronto degli R f e, dal confronto delle due lastre, selezionare l eluente più adatto per la separazione dei due composti. 2) Calcolare gli R f dei due composti. Quale dei due composti è più polare e perché? L' R f è il rapporto tra la distanza percorsa dalla sostanza ed la distanza raggiunta dal fronte Fronte R f = a/b b A = Benzofenone B = Bifenile C = Miscela a A B C Linea dove si effettua il caricamento il livello dell'eluente non deve superare questo punto