Domande. Come avviene la replicazione del DNA? Quali enzimi sono necessari? Quali sono le differenze fra procarioti ed Eucarioti?

Transcript

1 Domande Come avviene la replicazione del DNA? Quali enzimi sono necessari? Quali sono le differenze fra procarioti ed Eucarioti?

2

3 Tre modelli di replicazione del DNA

4 Meselson e Stahl 1958

5

6 Figura box 3.1 Centrifugazione in CsCl per la separazione di molecole di diversa densità

7 La replicazione del DNA è semiconservativa

8

9 Tre fasi nella replicazione del DNA 1. Inizio 2. Allungamento della catena 3. Fine

10

11

12

13

14 La DNA girasi di E.coli La girasi di E.coli è una topoisomerasi di tipo II che usa l idrolisi di ATP per fornire l energia necessaria all introduzione di superavvolgimenti in una molecola circolare chiusa rilassata Si lega al DNA e lo superavvolge processivamente e cataliticamente Continua ad introdurre superavvolgimenti nella stessa molecola di DNA Può introdurre circa 100 superavvolgimenti al minuto

15 Mechanismo di Azione I chinoloni sono farmaci battericidi. Inibiscono la DNA girasi batterica detta anche topoisomerasi IV inibendo così la replicazione e la trascrizione del DNA batterico. I chinoloni entrano nel batterio attraverso dei canali detti porine e perciò vengono usati nel trattare infezioni batteriche di patogeni che si replicano all interno di cellule umane quali la legionella ed il micoplasma pneumonie. Per molti batteri gram negativi la DNA girasi è il target di questi antibatterici mentre per molti gram positivi il target è la DNA topoisomerasi IV Le cellule eucariotiche non contengono ne DNA girasi e ne DNA topoisomerasi IV

16 Spettro di azione dei chinolonici 1 Generazione Acido nalidissico: Escherichia coli, Proteus, Shigella, Enterobacter, e Klebsiella. 2 Generazione Ciprofloxacina: Come quelli della prima generazione ed nei confronti della salmonella typhy 3 Generazione Gatifloxacina: Chlamydophila pneumoniae e Mycoplasma pneumoniae 4 Generazione Gemifloxacina: Moraxella catarrhalis, Acinetobacter lwoffii, Klebsiella oxytoca, Legionella pneumophila, Proteus vulgaris. - Chlamydia pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae

17 Arthur Kornberg Scoprì la polimerasi I ed il meccanismo della sintesi del DNA, lavorando con Escherichia coli Sono necessari quattro componenti: 1. dntp: datp, dttp, dgtp, dctp (deossribonucleoside 5 -trifosfato) (zucchero-base + 3 fosfati) 2. DNA stampo 3. DNA polimerasi I (chiamata anche enzima di Kornberg) (DNA polimerasi II e III scoperte successivamente) 4. Mg 2+ (ottimizza l attività della DNA polimerasi)

18

19 LA REPLICAZIONE DEL DNA La polimerizzazione del DNA avviene sempre in direzione 5-3 L elicasi si muove in una sola direzione, srotolando progressivamente l elica I due filamenti antiparalleli non possono essere duplicati nello stesso modo uno puo essere sintetizzato nella stessa direzione in cui si muove l elicasi, in direzione 5-3 (filamento guida) l altro non possiede un gruppo ossidrile 3 al punto di biforcazione, non puo essere sintetizzato in maniera continua, in direzione 3-5 (filamento in ritardo), seguendo direzione elicasi ? l elicasi

20 LA REPLICAZIONE DEL DNA Il filamento in ritardo viene invece sintetizzato in direzione opposta a quella in cui si muove la forchetta di replicazione, mediante la sintesi progressiva di una serie di piccoli frammenti (frammenti di Okazaki), ciascuno polimerizzato in direzione 5-3 le estremita dei frammenti di Okazaki vengono ricongiunte mediante formazione di legami covalenti ad opera dell enzima DNA ligasi 3 direzione elicasi

21

22

23 La sintesi di un filamento di DNA richiede un innesco ad RNA ed avviene sempre in direzione 5 ->3

24

25

26 LA REPLICAZIONE DEL DNA

27 Proteine alla forca replicazione in E. coli Proteina Rep (elicasi) pol III proteine leganti singolo-filamento (SSB) primasi G 27 C DNAc Primosoma B DNAb elicasi DNA girasi questa è una topoisomerase II, che rompe e risalda il DNA per introdurre superavvolgimenti negativi a monte della forca pol III DNA ligasi pol I

28

29 Componenti dell apparato di replicazione dnaa Primosoma dnab dnac dnag DNA gyrase Rep protein SSB DNA pol III DNA pol I DNA ligasi lega all origine la sequenza di DNA elicasi (svolge il DNA all origine) lega dnab primasi (sintetizza RNA primer) introduce superavvolgimenti negativi in testa alla forca di replicazione elicasi (svolge il DNA alla forca) si lega al singolo-filamento di DNA principale polimerasi replicante rimuove i primer e riempe gli intervalli risalda gli intervalli formando legami 3, 5 -fosfodiesterei 29

30

31 La correzione di bozze

32 I superavvolgimenti sono un problema per la replicazione di cromosomi circolari 100 superavvolgimenti

33 Azione della topoisomerasi

34

35 Schema dei passaggi enzimatici nella replicazione di E. coli 1. La topoisomerasi fa rilassare il filamento 2. La proteina iniziatrice si lega a ori-c 3. Due elicasi (una per ciascuna forca replicativa) denaturano e svolgono un tratto della doppia elica 4. Le single-strand binding proteins stabilizzano il DNA ad elica singola, senza coprire le basi 5. La RNA polimerasi (primasi) si lega all elicasi e sintetizza un innesco di circa 30 paia di basi 6. La DNA P III lo estende da 5 a 3 7. Ad ogni passaggio la DNA P III rimuove gli appaiamenti sbagliati (proof-reading) 8. La DNA P I degrada l innesco ed estende il frammento adiacente, procedendo da 5 a 3 9. La ligasi salda i filamenti adiacenti, senza aggiungere alcun nucleotide

36

37

38 Il replicone è un segmento di DNA che possiede un inizio di replicazione e si replica una volta ad ogni divisione cellulare

39 I repliconi dei genomi di vari organismi

40 Durante la replicazione, la stessa elica è, in tratti diversi, leading e lagging

41 La bolla replicativa

42 In sintesi: Peter J Russell, Genetica 2010 Pearson Italia S.p.A Figura 3.5

43 Filamento leading e filamento lagging occupano entrambe le eliche, in posizioni diverse Figura 3.9 Peter J Russell, Genetica 2010 Pearson Italia S.p.A

44 Fine della replicazione: la ligasi Figura 3.7 Peter J Russell, Genetica 2010 Pearson Italia S.p.A

45 Fine della replicazione Figura 3.6 Peter J Russell, Genetica 2010 Pearson Italia S.p.A

46 Replicazione di cromosomi circolari Nella foto: SV40 Figura 3.10 Peter J Russell, Genetica 2010 Pearson Italia S.p.A

47 Ciclo cellulare in Eucarioti e procarioti (ore) Organismo M G1 S G2 Totale E. coli 1 Lievito Piante Uomo Il genoma umano è circa 1000 volte più grande di quello di E. coli Velocità di replicazione: E. coli: basi al minuto Drosophila: 2600 basi al minuto Topo: 2200 basi al minuto

48 Negli eucarioti superiori DNA P α: sintesi del primer DNA P β: riparazione del DNA nucleare DNA P γ: replicazione, solo nei mitocondri DNA P δ: sintesi dell elica lagging DNA P ε: sintesi dell elica leading* * Finora dimostrato solo nel lievito SPECIE Dimens. genoma N repliconi velocità replicazione/min E. coli: 4,2 Mb Drosophila: 140 Mb Topo: 3200 Mb

49 E alla fine? Peter J Russell, Genetica 2010 Pearson Italia S.p.A Figura 3.15

50 LA REPLICAZIONE DEL DNA Oltre la parte piu estrema di un filamento di DNA non c e piu spazio per la sintesi di un innesco! Quindi la replicazione del DNA rimane incompleta, ovvero un frammento terminale di un cromosoma resta a singola elica a questo ovvia la replicazione dei telomeri ad opera dell enzima telomerasi, che utilizza come stampo un RNA parte dell enzima stesso

51 I telomeri sono delle strutture formate da DNA e proteine presenti alle estremità dei cromosomi lineari costituiti da ripetizioni in tandem della sequenza TTAGGG

52 La replicazione dei telomeri

53 Premio Nobel per la Medicina 2009 Carol W. Greider Jack W. Szostak Elizabeth H. Blackburn

54 Telomerasi La telomerasi, la trascrittasi inversa che aggiunge ripetizioni TTAGGG alle sequenze telomeriche, è il maggior regolatore della lunghezza telomerica nelle cellule di mammifero (collins & mitchell 2002). Consiste di due componenti principali: TERT (Telomerase Reverse Transcriptase) - una subunità con attività di trascrittasi inversa conosciuta come trascrittasi inversa telomerasica TERC (Telomerase RNA component) - una molecola di RNA conosciuta come il componente ad RNA della telomerasi che serve da copia per la sintesi di nuove ripetizioni telomeriche. Nell uomo l attività telomerasica è stata riscontrata nelle cellule della linea germinale ed in cellule embrionali ma non nella maggior parte dei tessuti adulti Il 90% dei tumori presentano attivazione della telomerasi

55 LA TELOMERASI La telomerasi permette di risolvere il problema della replicazione delle estremità cromosomiche aggiungendo ripetizioni telomeriche ad ogni ciclo di sintesi del DNA

56 Telomerasi Le regioni terminali dei cromosomi (telomeri) contengono sequenze ripetute: Ciliati (Tetrahymena): n(ttgggg) Flagellati (Trypanosoma), uomo: n(ttaggg) L enzima telomerasi contiene un tratto di RNA complementare alla sequenza ripetuta e lo usa come primer per replicare l estremità telomerica 5 : è una DNA P RNA dipendente Carol Greider

57 Come funziona la telomerasi

58 Senescenza e neoplasia

59 Trends in Genetics 15:93-94, 1999

60 Figure 12.6 The Biology of Cancer ( Garland Science 2007)

61 Deaminazione

62 Depurinazione

63 Ossidazione

64 Dimeri di pirimidine

65 Formazione di addotti del DNA

66 MAP: Myh-associated polyposis

67 Figure 12.23b The Biology of Cancer ( Garland Science 2007) Xeroderma pigmentos altissima incidenza di maligni della pelle esp a raggi UV.

68 Figure 12.8c The Biology of Cancer ( Garland Science 2007) Mismatch repair

69 Mismatch repair Hereditary non-polyp colon cancer (HNPCC Difetti del mismatch r nel 15% dei tumori sp del colon, dello stoma dell'ovaio e dell'endom Figure 12.8a The Biology of Cancer ( Garland Science 2007)

70 Homology-directed repair Difetti di BRCA1 o BRCA prevengono la riparazion dall'omologia. Carcinomi della mamme dell'ovaio. Figure The Biology of Cancer ( Garland Science 2007)

71 Non-homologous end joining (NHEJ) Difetto della proteina (nibrina). Linfomi. Figure The Biology of Cancer ( Garland Science 2007)

72 Sistemi di correzione e riparo del DNA Correzione di bozze ( proofreading ) durante la replicazione la DNA polimerasi può eliminare una base incorretta attraverso l attività 3-5 fosfodiesterasica Riparo dei misappaiamenti le coppie di basi non corrette sul filamento nuovo vengono riparate da un complesso proteico che segue la polimerasi in duplicazione. La metilazione del DNA consente di distinguere il filamento vecchio dal nuovo. Riparo per escissione le basi modificate da agenti chimici successivamente alla replicazione del DNA vengono riconosciute e riparate.

73 CH3 Meccanismi di correzione e riparo nel DNA

74 Causa delle mutazioni Errori di replicazione Danni chimici. Il DNA è una molecola fragile: perdita o alterazioni di basi, rottura dello scheletro Inserimento di trasposoni.

75 Riparazione del mismatch Mismatch repair è parte della replicazione. In E. coli il DNA viene analizzato per distorsioni da Mut S (un dimero), lo distorce ulteriormente Recluta MutL, che recluta MutH che taglia il filamento vicino al mismatch Poi intervengono: elicasi, esonucleasi, DNA Pol (III) e ligasi.

76 Mismatch repair in E. coli Come fa a identificare il filamento nuovo su cui operare il taglio ed escissione? Dalla metilazione della A nella sequenza CTAG ad opera della Dam metilasi MutS si lega al filamento non metilato

77 Mismatch repair in Eucarioti Gli eucarioti hanno omologhi di Mut(s) con più alta specificità (per mismatch, indels etc) Non hanno Dam Metilasi, riconoscono il filamento stampo dalle incisioni dei frammenti di Okazaki. Sono associate al sliding clamp Mutazioni dei geni predispongono ai tumori