RICERCA SU OSSO E TESSUTO MOLLE ASSOCIATI AD OSTEOMIELITE

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1 METODO NAZIONALE STANDARD RICERCA SU OSSO E TESSUTO MOLLE ASSOCIATI AD OSTEOMIELITE BSOP 42 Emesso da Standards Unit, Department for Evaluations, Standards and Training Centre for Infections RICERCA SU OSSO E TESSUTO MOLLE ASSOCIATI AD OSTEOMIELITE Data di revisione: Emesso da: Standards Unit, Department for Evaluations, Standards and Training Pagina 1 di 19 Riferimento no. BSOP 42i1 Questo MNS deve essere usato congiuntamente con gli altri MNS emessi dalla Health Protection Agency

2 STATO DEI METODI NAZIONALI STANDARD I Metodi Nazionali Standard, che includono le procedure operative standard (POS), algoritmi e linee guida, promuovono l adozione di elevati livelli di qualità, contribuendo ad assicurare la possibilità di confronto delle informazioni diagnostiche ottenute in laboratori diversi. Ciò consente la standardizzazione della sorveglianza sostenuta dalla ricerca, sviluppo e verifica, promovendo nello stesso tempo la salute pubblica e la fiducia del paziente nelle proprie strutture sanitarie. I metodi sono ben referenziati e rappresentano un buon standard minimo per la microbiologia clinica e per la salute pubblica. Comunque, utilizzando i Metodi Nazionali Standard, i laboratori dovranno tenere in considerazione le esigenze locali e potranno intraprendere ricerche addizionali. I metodi forniscono inoltre un punto di riferimento per un loro ulteriore sviluppo. I Metodi Nazionali Standard sono stati sviluppati, revisionati ed aggiornati con una procedura aperta di consenso ove le opinioni di tutti i partecipanti sono state tenute in adeguata considerazione ed i documenti elaborati riflettono il consenso della maggior parte degli stessi. I rappresentanti di alcune organizzazioni professionali, incluse quelle il cui logo appare sulla prima pagina, sono membri dei gruppi di lavoro che sviluppano i Metodi Nazionali Standard. L inclusione del logo di una organizzazione nella prima pagina implica sostegno agli obiettivi ed al processo di preparazione dei metodi standard. I componenti di queste organizzazioni scientifiche hanno partecipato allo sviluppo dei Metodi Nazionali Standard ma le loro opinioni personali non rispecchiano necessariamente quelle dell organizzazione di cui sono membri. L elenco attuale delle organizzazioni professionali partecipanti può essere ottenuto tramite all indirizzo standards@hpa.org.uk. Le prestazioni dei metodi standard sono condizionate dalla qualità di reagenti, strumentazione, procedure commerciali o prove messe a punto in loco. I laboratori dovrebbero assicurare che queste siano state validate e dimostrate idonee allo scopo prefissato. Devono essere adottate procedure di controllo di qualità interno ed esterno. Nonostante siano state osservate le più scrupolose attenzioni nella preparazione di questa pubblicazione, la Health Protection Agency o qualsiasi organizzazione di sostegno non può essere ritenuta responsabile dell accuratezza o dell utilizzo o di qualsiasi conseguenza derivante dall uso o da modifiche delle informazioni contenute in questo documento. Queste procedure sono intese solamente come una risorsa generale per i professionisti che esercitano in questo settore, operanti nel Regno Unito, pertanto si dovrà ricorrere ad altri consulenti quando ritenuto necessario. Se si apportano modifiche a questa pubblicazione, si deve porre in evidenza dove sono state apportate modifiche al documento originale. La Health Protection Agency (HPA) dovrà essere informata in ogni circostanza. La HPA è una organizzazione indipendente che ha lo scopo di proteggere la salute della popolazione. Ad essa confluiscono esperienze professionali già appartenenti ad organizzazioni ufficiali. Maggiori informazioni riferibili alla HPA possono essere ottenute al sito La HPA è un organizzazione che mira ad essere completamente in accordo con le direttive Caldicott. Ciò significa prendere ogni possibile precauzione per prevenire la diffusione non autorizzata di informazioni sui pazienti e di garantire che le informazioni relative agli stessi siano mantenute in condizioni di sicurezza 1. Maggiori dettagli possono essere ottenuti dal sito web. Contributi allo sviluppo dei documenti possono essere forniti contattando l indirizzo standards@hpa.org.uk. Per cortesia prendere nota che la bibliografia è attualmente formattata con il software Reference Manager. Se si modifica o si cancella il testo senza avere installato nel computer il Reference Manager; la bibliografia non sarà aggiornata automaticamente. Riferimento suggerito per questo documento: Health Protection Agency (2008). Investigation of bone and soft tissue associated with osteomyelitis. National Standard Method BSOP 42 Emissione 1. RICERCA SU OSSO E TESSUTO MOLLE ASSOCIATI AD OSTEOMIELITE Data di revisione: Emesso da: Standards Unit, Department for Evaluations, Standards and Training Pagina 2 di 19 Questo MNS deve essere usato congiuntamente con gli altri MNS emessi dalla Health Protection Agency Riferimento no. BSOP 42i1

3 INDICE STATO DEI METODI NAZIONALI STANDARD... 2 INDICE... 3 PROCEDURA DI MODIFICA... 4 SCOPO DEL DOCUMENTO... 5 INTRODUZIONE... 5 INFORMAZIONE TECNICA/LIMITI CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA RACCOLTA DEL CAMPIONE TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE PROCEDURA ANALITICA SUL CAMPIONE PRELIEVO DEL CAMPIONE TEMPO OTTIMALE PER IL PRELIEVO DEL CAMPIONE TIPO DI CAMPIONE APPROPRIATO E METODO DI PRELIEVO QUANTITA ADEGUATA E NUMERO APPROPRIATO DI CAMPIONI TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE TEMPO FRA PRELIEVO DEL CAMPIONE E PROCEDURA ANALITICA ACCORGIMENTI PARTICOLARI PER RIDURRE IL DETERIORAMENTO PROCEDURA SUL CAMPIONE SELEZIONE DELLA PROVA ASPETTO MICROSCOPIA COLTURA E RICERCA IDENTIFICAZIONE PROVE DI SENSIBILITA AGLI ANTIMICROBICI PROCEDURA DI REFERTAZIONE MICROSCOPIA COLTURA PROVE DI SENSIBILITA AGLI ANTIMICROBICI SEGNALAZIONI ALLA HPA (LOCALE E SERVIZI NAZIONALI E CENTRO PER LE INFEZIONI) RINGRAZIAMENTI E CONTATTI APPENDICE BIBLIOGRAFIA Data di Revisione: Emesso da: Standards Unit, Department for Evaluations, Standards and Training Pagina 3 di 19

4 PROCEDURA DI MODIFICA Documento di riferimento controllato Titolo del documento controllato BSOP 42 Ricerca su osso e tessuto molle associati ad osteomielite Ciascun documento controllato possiede una registrazione separata con le correzioni specificate in modo dettagliato in questa Procedura di Modifica. Le precedenti modifiche sono disponibili presso la standards@hpa.org.uk. Sull emissione di pagine nuove o rivedute ciascun documento controllato deve essere aggiornato dal proprietario del Laboratorio. Modifica Numero/ Data Emissione no. Scartata Inserita Emissione no. Pagina Sessione(i) interessate Modifica Data di Revisione: Emesso da: Standards Unit, Department for Evaluations, Standards and Training Pagina 4 di 19

5 Tipo di campione RICERCA SU OSSO E TESSUTO MOLLE ASSOCIATO AD OSTEOMIELITE SCOPO DEL DOCUMENTO Campioni intra-operatori d osso, o biopsie ossee inviate per diagnosi clinica. (Per Biopsie ed aspirati inviati per ricerca di infezione della protesi articolare consultare BSOP 44 Investigation of prosthetic joint infection samples). Questo metodo Nazionale Standard (MNS) descrive la procedura e la ricerca microbiologica dell osso e del tessuto molle associato. INTRODUZIONE L osteomielite è un infiammazione dell osso, di solito causata da infezione. Può essere acquisita per via ematogena (sistema circolatorio) o per inoculo diretto da una sede contagiata (trauma penetrante od ulcera locale) 2,3. Quest ultima può essere associata ad insufficienza vascolare (piede diabetico) 4. Inoltre l osteomielite può essere associata ad un dispositivo ortopedico quale il fissaggio di una frattura o ad una protesi. Molti dei principi descritti nel MNS della protesi articolare (BSOP 44 Investigation of prostheti' joint infection samples) sono applicabili anche al dispositivo coinvolto dall osteomielite. In particolare, nell osteomielite cronica e nelle infezioni croniche ed in quelle croniche del dispositivo, i microrganismi possono essere presenti all interno di un biofilm associato al dispositivo o all osso ammalato/necrotico. La presenza del biofilm ha implicazioni tecniche per il campionamento e nella procedura ed interpretazione dei risultati colturali. Osteomielite ematogena L osteomielite ematogena è stata classicamente descritta nell infanzia, ma si può manifestare in ogni età, specialmente se sono presenti fattori di rischio quali l inserimento recente di un dispositivo intra-vascolare, emodialisi, uso di droga endovena od infezioni ricorrenti (quali infezioni del tratto urinario). Nella classica osteomielite ematogena dell infanzia sono coinvolte le estremità di crescita delle ossa lunghe (metafisi). Lo Staphylococcus aureus è il microrganismo di più frequente riscontro, sono comunque importanti agenti eziologico come gli streptococchi -emolitici e gli HACEK. I microrganismi presenti nel sistema circolatorio giungono all asso per mezzo delle arterie che forniscono nutrimento. Passano tramite i rami di questi vasi nei piccoli vasi terminali ciechi in prossimità della placca epifisaria (parte terminale della crescita dell osso. Si ritiene che questa sede abbia una circolazione rallentata ed i batteri possono qui depositarsi, innescando il processo infettivo. Poi questo si estende ad altre aree e si mobilita la risposta infiammatoria di difesa dell ospite. Si ha formazione di pus che si espande sotto pressione, determinando di conseguenza un ulteriore ostacolo alla circolazione e la necrosi dell osso. In alcune aree come l anca, si manifesta spesso un precoce interessamento infettivo dell articolazione perché la placca epifisaria è situata all interno della capsula articolare. Il pus sotto pressione può scollare il periostio, (limite esterno dell osso). In risposta a ciò, si forma nuovo osso immaturo, e, nei casi più gravi, l osso completo può essere racchiuso in una formazione di osso nuovo, definita involucro. Nel caso in cui la maggior parte della diafisi sia stata esclusa del rifornimento ematico, si forma un sequestro (osso necrotico) che è contenuto all interno dell involucro. Vie di fuga all interno dell osso consentono la fuoruscita del pus, causando ascessi, sepsi sistemiche ed in alcuni casi il decesso. Un attacco acuto di osteomielite può evolvere in ostiomielite cronica, caratterizzata da aree di osso necrotico e tragitti fistolosi 5,6. Questa situazione può comportare il fallimento alla risposta terapeutica e persistere per un lungo periodo 7. Le infezioni possono ripresentarsi molti anni dopo il primo episodio 3. Le specie batteriche coinvolte nell osteomielite ematogena variano con l età del paziente. Streptococchi di gruppo B, Staphylococcus aureus ed Escherichia coli causano infezione nei neonati 8. In questi pazienti sono frequenti sedi multiple d infezione 9. S. aureus, ed Haemophilus influenzae tipo B predominano fra uno e sedici anni (sebbene questo ultimo sia raro dopo i cinque anni e sempre meno frequente al di sotto dei cinque anni per il miglioramento ottenuto con la campagna vaccinale) Data di Revisione: Emesso da: Standards Unit, Department for Evaluations, Standards and Training Pagina 5 di 19

6 Streptococcus pneumoniae è coinvolto solo occasionalmente. Negli adulti, S. aureus è il microrganismo più frequente e, negli anziani, si riscontano bastoncini aerobi Gram negativi. Se si usano dispositivi intravenosi possono essere riscontrate specie Candida 4. Di solito si isola un solo microrganismo patogeno, ma in molti casi di osteomielite cronica, specialmente in quelle associate a ferrite ed ulcere, la malattia può essere di tipo polimicrobico. Osteomielite da Salmonella Le specie Salmonella sono una rara causa di osteomielite nei pazienti immunocompetenti, ma si riscontano nei pazienti con anemia falciforme e negli immunodepressi 10. Osteomielite nei tossicodipendenti per via endovena Nei tossicodipendenti per via endovena l artrite settica, l osteomielite delle ossa lunghe o la discite vertebrale sono associate ad infezione ematogena. Il microrganismo di più comune riscontro è S. aureus. In questo gruppo possono essere riscontrate anche infezioni da Pseudomonas aeruginosa 11. Osteomielite nei pazienti emodializzati In questi pazienti si possono manifestare infezioni ematogene conseguenti all uso di dispositivi per accesso intravascolare di solito dovute a S. aureus o a stafilococchi coagulasi negativi 4. Ascesso di Brodie Specifica presentazione di osteomielite, si manifesta con ascesso osseo piogenico intramidollare cronico, localizzato, circoscritto alla parte distale della tibia. S. aureus spesso è l agente eziologico coinvolto, si manifesta in pazienti con meno di 25 anni. Sono risolutivi gli antibiotici e l intervento chirurgico 12. Osteomielite vertebrale Nelle persone adulte l osteomielite non conseguente a dispositivi in sede circolatoria coinvolge più frequentemente la colonna vertebrale. I fattori di rischio comprendono, età avanzata, inserimento recente di un dispositivo intravascolare, emodialisi, diabete, tossicodipendenza per via endovena (fattore di rischio per infezione da Pseudomonas 13 ), infezioni in qualsiasi sede ed immuno-compromissione. Le infezioni del tratto lombare della colonna vertebrale possono originare da quelle del tratto urinario, per possibile traslocazione di batteri tramite il plesso venoso (plesso di Batson) che unisce la vescica alla colonna. Dopo la comparsa dell infezione iniziale, il pus può fuoruscire dalla corteccia anteriormente e formare un ascesso paravertebrale o posteriormente per formare un ascesso epidurale. Il battere di più comune riscontro è lo S. aureus 14, seguito dagli streptococchi e dai bastoncini Gram-negativi 15. Nei pazienti con fattori di rischio, si deve sempre considerare la possibilità di tubercolosi. Le specie Brucella sono causa frequente di Infezione vertebrale e pertanto l anamnesi deve tenere in considerazione l eventualità di un soggiorno nelle aree endemiche per questo microrganismo. Altri bastoncini Gram negativi esigenti 15 quali quelli del gruppo HACEK (Haemophilus species, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Cardiobacterium hominis, Eikenella corrodens e le specie Kingella; (consultare BSOPID 12 Identification of Haemophilus species and the HACEK group of organisms) possono rappresentare cause occasionali di osteomielite vertebrale 16 Osteomielite tubercolare La tubercolosi extra-polmonare può manifestarsi in numerose sedi, compreso il sistema muscoloscheletrico 17,18. E rilevabile in qualsiasi struttura ossea o articolare. La diagnosi è ottenuta con biopsia, accertamento istologico, ed esame microbiologico. Le colture sono spesso positive e sono fondamentali per definire la presenza di resistenza a farmaci anti-tubercolari. La decisione del trattamento comunque è spesso determinata in prima istanza dagli aspetti clinici ed istopatologici. Altri micobatteri, quali Mycobacterium marinum, Mycobacterium avium-intracellulare, Mycobacterium fortuitum e Mycobacterium gordonae sono stati spesso associati ad infezioni dell osso 19, in modo particolare nei pazienti immunocompromessi. Considerare la specie Nocardia come causa rara di osteomielite negli ospiti immuno-compromessi o nei diabetici. Osteomielite per contiguità Data di Revisione: Emesso da: Standards Unit, Department for Evaluations, Standards and Training Pagina 6 di 19

7 Nell osteomielite secondaria ad un focus contiguo, i microrganismi possono essere inoculati al momento del trauma o nel corso di procedure intra-operatorie o peri-operatorie. Altrimenti, possono estendersi da un focus infettivo presente nel tessuto molle adiacente 2. I fattori predisponenti includono di solito riduzione chirurgica e fissaggio di fratture, dispositivi protesici, fratture aperte ed infezioni croniche dei tessuti molli (consultare BSOP 14 Investigation of abscesses and post-operative wound and deep seated wound infections). La microbiologia dell osteomielite per contiguità è in generale più complessa rispetto a quella ematogena ed è di solito polimicrobica. Ferite da puntura del piede da calzature sportive sono spesso associate ad osteomielite da Pseudomonas aeruginosa Ciò è di comune riscontro nei bambini, ma anche negli adulti 24,25. I batteri anaerobi possono causare osteomielite conseguente a morsi prodotti dall uomo, infezioni della cavità dentaria che interessano la mandibola, quelle del piede diabetico e fratture conseguenti ad ischemia dei tessuti 26. Le specie Actinomyces sono una delle cause di osteomielite da anaerobi di più comune riscontro, coinvolgono più frequentemente la mascella. Infezioni correlate a dispositivi sanitari La flora cutanea, a cui appartengono gli stafilococchi coagulasi negativi, spesso considerati in laboratorio come contaminanti, assume ruolo patogeno nel caso di coinvolgimento di un dispositivo sanitario. Essa espica lo stesso ruolo svolto nelle infezioni della protesi articolare e nei principi descritti nella BSOP 44 Investigation of prosthetic joint infection samples. Per fissare le fratture delle ossa lunghe o in altre sedi sono usati diversi tipi di dispositivi protesici. Se divengono infetti, l esordio della patologia può essere acuto, con evidente formazione di pus. Altrimenti un infezione di tipo moderato, quale quella sostenuta dalla flora cutanea da parte dello stafilococco coagulasi negativo, potrà indurre fratture composite ritardate o disgiunte. I microrganismi possono essere presenti in numero ridotto e le colture spesso richiederanno brodi di arricchimento. Quando un paziente portatore di protesi subisce una rimozione e/o la sostituzione, prelevare campioni multipli (4-5), usando strumentazione separata. In caso di colture positive, qualunque sia il microrganismo(i), questo è probabilmente da considerare il vero agente causale dell infezione. Infezioni del piede diabetico Le infezioni del piede diabetico sono responsabili di molti ricoveri ospedalieri e in un numero significativo possono condurre ad amputazione dell arto e conseguente disabilità. La neuropatia e la vasculopatia (deficit circolatorio) sono complicazioni diabetiche. La prima induce la perdita della sensazione di protezione, consentendo ai traumatismi cutanei di realizzarsi senza essere percepiti. Ciò può condurre in definitiva alla frammentazione, distruzione e dislocazione delle ossa del piede (neuro-osteoartropatia di Charcot). Nei diabetici, la deformità del piede sostenuta dalla neuropatia è anche un importante fattore di rischio per la comparsa di ulcere e di infezione. Le indicazioni principali nel trattamento del piede diabetico sono l educazione e la prevenzione, conseguibili con un efficace controllo glicemico, calzature comode, ispezione regolare e adattabilità generale. Una volta manifestatasi l infezione, gli ascessi possono richiedere drenaggio, e biopsie se richieste, per fornire indicazioni sulla scelta degli antibiotici; l osso danneggiato dalla malattia può essere asportato. L infezione acuta è spesso monomicrobica nei pazienti ai quali non sono stati recentemente somministrati antibiotici (quasi sempre cocchi gram positivi aerobi quali S. aureus e streptococchi -emolitici), mentre le infezioni croniche sono spesso polimicrobiche. Le colture dei campioni prelevati a pazienti con infezione mista di solito contengono 3-5 isolati, inclusi gram positivi e gram negativi aerobi ed anaerobi. Possono contenere enterococchi, diverse Enterobatteriaceae, anaerobi obbligati, Pseudomonas aeruginosa e talvolta altri bastoncini gram negativi non fermentanti. Ospedalizzazione, interventi chirurgici, ed in modo particolare terapie prolungate o con antibiotici a largo spettro possono predisporre i pazienti a colonizzazione e/o infezione da microrganismi antibiotico-resistenti (MRSA o enterococchi vancomicinaresistenti [VRE]). La diminuzione delle difese dell ospite attorno al tessuto molle necrotizzato o all osso può consentire di assumere ruolo patogeno a microrganismi colonizzanti a bassa virulenza, quali gli stafilococchi coagulasi-negativi e le specie Corynebacterium ( difteroidi ) 27. Le infezioni del piede diabetico sono spesso trattate dai podologi. Questi possono eseguire l asportazione del tessuto profondo ed inviare il tessuto molle per l esame colturale, specificando comunque sul modulo di richiesta la presenza di osteomielite. Osteomielite fungina In alcune aree endemiche i funghi possono causare osteomielite. Fra questi le specie Cryptococcus, Blastomyces e Sporothrix. Nei pazienti immunodepressi o in quelli con interventi chirurgici multipli precedenti nella stessa sede, funghi più comuni, quali le specie Candida 4 o Aspergillus possono causare osteomielite 28. Il micetoma è un infezione cutanea granulomatosa cronica della cute del tessuto sottocutaneo e dell osso nella fase avanzata. E prevalente ai tropici e nei paesi africani subtropicali, Asia Data di Revisione: Emesso da: Standards Unit, Department for Evaluations, Standards and Training Pagina 7 di 19

8 ed America centrale. L infezione è di solito successiva ad inoculo traumatico nel tessuto sottocutaneo di microrganismi da sorgenti quali il suolo od i vegetali 29. Sono stati implicati numerosi generi, comprendenti specie Madurella, Acremonium, Pseudoallescheria e Actinomadura. I micetomi fungini sono definiti eumicetomi a differenza da quelli prodotti alle specie Nocardia. Diagnosi di osteomielite La diagnosi di osteomielite richiede di solito una completa valutazione clinica, evidenza radiologica e possibilmente accertamenti successivi, principalmente con Risonanza Magnetica, Tomografia Computerizzata, ed in alcune situazioni, (come nel caso di un bambino l ecografia), emocolture (in modo particolare nei casi acuti), biopsie dell osso e/o tessuto molle e/o campionamenti chirurgici. In particolari situazioni, quale quella di infezione da brucella, possono essere richiesti altri accertamenti, quali quelli sierologici. Se si sospetta la tubercolosi, si richiede un completo accertamento clinico, comprendendo, se opportuno, una radiografia del torace. Trattamento dell osteomielite La forma acuta può richiedere l intervento chirurgico per drenare il pus. Nella forma cronicizzata le aree necrotiche possono essere l asportate. Entrambe le manifestazioni cliniche richiedono l utilizzo di terapia antibiotica specifica definita dagli esami colturali. Molto spesso, inizialmente, è utilizzata la somministrazione per via venosa. In alcuni casi si può somministrare terapia con antibiotici biodisponibili per un lungo periodo se la malattia è troppo estesa per un asportazione totale, o il paziente non è in grado d affrontare un intervento chirurgico o è ritenuto un dispositivo. E opportuno saggiare i microrganismi con un ampia varietà di antibiotici, in quanto spesso i pazienti non tollerano uno o più antibiotici. INFORMAZIONE TECNICA/LIMITI Biopsie ossee ottenute per via percutanea con controllo radiologico Queste possono essere eseguite presso un dipartimento di radiologia dove sono assistite dall immagine ottenuta con ultrasuoni, fluoroscopia o TC. Per confermare l infezione ed ottenere indicazioni per infezioni insolite e/o escludere forme maligne, di consuetudine si dovrebbe inviare un campione in istologia,. Non sempre per la microbiologia è disponibile più di un campione, ma se ciò è possibile, ciascuno deve essere analizzato separatamente. E importante fornire informazioni cliniche dettagliate per poter assicurare che le colture siano predisposte per favorire lo sviluppo dei microrganismi. Ciò significa inviare informazioni quali la presenza di un dispositivo protesico (ove qualsiasi microrganismo, come lo stafilococco coagulasi negativo, può assumere ruolo patogeno ed anche quando le colture richiedono tempi prolungati). Si deve informare per ogni sospetto clinico o rischio di tubercolosi, brucella, nocardia, micobatteri atipici o funghi. Biopsie ossee intra-operatorie Sono prelevate in sala chirurgica essenzialmente come procedura diagnostica, o come primo tempo di una più estesa procedura di sbrigliamento/resezione. Prelevare campioni multipli (4-5) per le colture microbiologiche con strumenti sterili separati. Prelevare campioni simili dalle stesse sedi per l accertamento istopatologico. E richiesta una valutazione del rischio-beneficio concernente il tempo di somministrazione dell antibiotico. Se l infezione è probabile e/o è possibile che la diagnosi microbiologica possa influire in modo significativo sul risultato, la profilassi con antibiotici può essere evitata fino a campionamento compiuto. Non si conosce l effetto di una sola dose di antibiotico sulla sensibilità dell esame colturale. Inoltre i campioni ossei ed i tessuti molli profondi sono di solito prelevati contemporaneamente. Dovrebbero essere evitati i campioni da fistola perché non si è in grado di differenziare i microrganismi colonizzanti da quelli infettanti. Campioni in prossimità di dispositivi Campioni d osso e di tessuti molli possono essere prelevati attorno ad una protesi, ad esempio una piastra di fissazione di una frattura o ad un chiodo. Questo può essere sbrigliato e lasciato in situ (sbrigliamento e ritenzione) o rimosso. Se la frattura non è composta di solito è richiesto un successivo dispositivo interno od esterno. I campioni correlati ad un tale dispositivo devono essere analizzati in modo analogo a quello utilizzato per le protesi articolari. (BSOP 44 Investigation of prosthetic joint infection samples). Obiettivo della procedura analitica dei campioni d osso è quello di ridurre al minimo la manipolazione. I campioni devono essere inviati al laboratorio secondo i tempi di routine usuali (ore piuttosto che minuti). Data di Revisione: Emesso da: Standards Unit, Department for Evaluations, Standards and Training Pagina 8 di 19

9 Per ridurre il rischio di contaminazione si consiglia di processare i campioni in Cabina Microbiologica di sicurezza di Classe 2. Non sono note pubblicazioni su confronti di validazione di metodi messi a punto nell attività ortopedica su tipi diversi di tessuto. Lo scuotimento con biglie di vetro sterili (Ballotini) è abbastanza semplice e comporta un rischio ridotto di contaminazione. Un altro metodo suggerisce di macinare il campione in esame. La macinazione può deteriorare e costituire comunque un rischio per la salute e la sicurezza, può anche produrre aerosol rilasciato dal miscelatore. Il calore prodotto dal miscelatore crea problemi (può essere sufficiente ad uccidere alcuni microrganismi) e la potenza insufficiente dello strumento che omogeneizza il tessuto nelle provette del miscelatore di Griffiths rendono difficile la standardizzazione di questa tecnica; non sono note inoltre le possibilità d isolamento. Nelle provette di macina di Griffiths è stato pure studiato l impatto della frammentazione sull osso e sui frammenti di cemento. La ricerca ha valutato la procedura di sonicazione come mezzo di disaggregazione del biofilm batterico nelle protesi vascolari ed ortopediche. Non si conoscono studi su campioni d osso. L arricchimento in brodo è importante specialmente nelle osteomieliti croniche, per dispositivi correlati ad infezioni o quando i pazienti sono già in trattamento antibiotico 30. Le brodocolture si possono contaminare 31 e pertanto si ottiene un risultato non interpretabile se di due brodocolture solo una fornisce risultato colturale positivo. Se sono stati prelevati alcuni campioni (4-5), per questo paziente sarà più facile definire la positività dell esame microbiologico. Per un dispositivo o per un frammento di osso non vitale, qualsiasi microrganismo cresciuto in più di un campione può essere significativo e deve essere identificato, saggiato con prove estese di sensibilità e refertato. Le prove di sensibilità estese sono di grande importanza nei pazienti con osteomielite cronica, o per dispositivi metallici ritenuti, casi questi che richiedono terapia antibiotica orale prolungata. Sierologia Nei casi in cui si sospettano specifici patogeni, come la brucella, si può ricorrere agli esami sierologici. Metodi molecolari Le attuali valutazioni preliminari dei metodi molecolari applicati ai tessuti suggeriscono che queste tecniche sono meno sensibili dell esame colturale. La validazione comparativa su materiale asportato da protesi articolari sezionate ed inviate in laboratorio per la coltura senza arricchimento in fase liquida, l immunofluorescenza diretta per stafilococchi coagulasi negativi e propionibatteri e la 16S rrna PCR, ha riscontrato rispettivamente sensibilità del 22%, 63% and 72% 32. Ciò può essere estrapolato ai dispositivi di fissaggio e all osteomielite. La 16S rrna PCR può assumere un ruolo clinico nelle colture negative, ma, in generale, i metodi molecolari non sono ancora idonei per la gestione della routine clinica. Sono richiesti ulteriori studi di valutazione dei metodi molecolari, effettuati su consistenti definizioni cliniche e patologiche dell infezione. Data di Revisione: Emesso da: Standards Unit, Department for Evaluations, Standards and Training Pagina 9 di 19

10 1 CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA RACCOLTA DEL CAMPIONE Porre attenzione per evitare traumatismi accidentali quando si utilizzano taglienti 1.2 TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE Contenitore approvato per microbiologia in sacchetto di plastica chiuso PROCEDURA SUL CAMPIONE N/D 2 PRELIEVO DEL CAMPIONE 2.1 TEMPO OTTIMALE PER PRELIEVO DEL CAMPIONE Prima della terapia antibiotica, se possibile. Sospendere la terapia antibiotica, se possibile, per almeno 1-2 settimane prima di eseguire il prelievo e considerare di non effettuare profilassi chirurgica di routine fino a campionamento effettuato. Per maggiori informazioni sulla terapia antibiotica ed il campionamento chirurgico fare riferimento alla BSOP 44 Investigation of prosthetic joint infection samples. 2.2 TIPO DI CAMPIONE E METODO DI PRELIEVO APPROPRIATI Il campione deve essere inserito in un contenitore approvato per microbiologia 44 ed inviato al laboratorio (prelievo diretto in sala chirurgica in un contenitori approvati per microbiologia 44 contenente soluzione di Ringer o fisiologica, e come alternativa, palline di Ballotini; i contenitori per campione microbiologico ed istologico possono comunque essere confusi e condurre a difficoltà nella procedura analitica del campione). 2.3 QUANTITA ADEGUATA E NUMERO APPROPRIATO DI CAMPIONI Per le biopsie intra-operatorie è importante il prelievo di campioni multipli (4-5) con strumentazione separata (di solito pinze e bisturi). Devono essere prelevati campioni duplicati per l istologia. I tamponi non sono consigliati. La dimensione minima del campione dipende dal numero degli accertamenti richiesti. 3 TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE 3.1 TEMPO FRA PRELIEVO DEL CAMPIONE E PROCEDURA ANALITICA I campioni devono essere trasportati e processati il più presto possibile. Il volume del campione condiziona il tempo accettabile per il trasporto. Ampi frammenti d osso possono mantenere più a lungo la vitalità degli anaerobi 45. I campioni non devono comunque superare le dimensioni del contenitore microbiologico approvato ACCORGIMENTI PARTICOLARI PER RIDURRE IL DETERIORAMENTO Se la procedura è ritardata, la refrigerazione è preferibile alla conservazione a temperatura ambiente. Evitare ritardi superiori a 48 ore. 4 PROCEDURA SUL CAMPIONE 4.1 SELEZIONE DELLA PROVA Selezionare una parte rappresentativa del campione per procedure appropriate, quali l esame colturale per specie Mycobacterium (BSOP 40 - Investigation of specimens for Mycobacterium species) o funghi, in funzione delle informazioni cliniche. 4.2 ASPETTO N/D Data di Revisione: Emesso da: Standards Unit, Department for Evaluations, Standards and Training Pagina 10 di 19

11 4.3 MICROSCOPIA STANDARD Colorazione Gram (consultare BSOPTP 39 - Staining Procedures) Se il campione ricevuto è in quantità sufficiente, preparare secondo quanto raccomandato nella Sezione 4.4. Con una pipette sterile deporre una goccia del campione su un vetrino da microscopio pulito. Diffondere il campione con un ansa sterile per ottenere uno striscio sottile per la colorazione Gram. 4.4 COLTURA E RICERCA PRE-TRATTAMENTO Esaminare il campione per presenza di tessuto molle. Rimuovere il tessuto molle con un bisturi o forbici sterili ed omogeneizzare, usando come appropriato, una macina sterile (provetta di Griffith od alternativa infrangibile), un bisturi sterile o (preferibilmente) forbici sterili e piastra di Petri. L aggiunta di un piccolo volume (circa 0.5 ml) di acqua sterile filtrata, fisiologica o di soluzione Ringer nutriente aiuterà il processo d omogeneizzazione. L omogeneizzazione deve essere effettuata per 15 minuti su porta provette posto su un agitatore in cabina con scarico protetto di Classe 1. Prove supplementari Funghi e specie Mycobacterium (BSOP 40 - Investigation of specimens for Mycobacterium species) PROCEDURA SUL CAMPIONE Osso (biopsia percutanea o campione intra-operatorio) o tessuto molle associato ad osteomielite. L obiettivo è quello di ridurre al minimo la manipolazione (ad esempio numero e volte d apertura di ciascun contenitore), riducendo in tal modo il rischio d esposizione del campione a potenziale contaminazione. Per questo motivo non deve essere eseguita la concentrazione del campione con centrifugazione, ma la divisione del campione intero in quantità appropriate per le prove. Per le unità operative con elevato carico di lavoro su questi campioni può essere considerata la fornitura alla sala operatoria di contenitori appropriati di microbiologia 44 contenenti circa 10 biglie di Ballottini. e 5 ml di brodo. In queste condizioni, l omogeneizzazione può essere eseguita nel contenitore originale. Non è infrequente, comunque, che i contenitori del campione per la microbiologia ed istologia siano confusi causando difficoltà nella procedura analitica del campione. In alternativa, i campioni possono essere inviati al laboratorio in un comune contenitore approvato per la microbiologia 44. Questi richiedono trasferimento, omogeneizzazione e successiva semina nei terreni di coltura, inclusi quelli liquidi. Se si segue questa metodologia, sarà richiesta particolare attenzione all asepsi durante il trasferimento, l omogeneizzazione o la procedura analitica. E opportuna la disponibilità di aria pulita. L omogeneizzazione con le microsfere di Ballotini può essere ottenuta con agitazione a 250 rpm per 10 minuti in un portaprovette coperto ed agitazione circolare, o, in alternativa, con vortex per 15 secondi (40 Hz). Il diluente per le microbiglie di Ballotini ed i tessuti può essere la soluzione di Ringer o la soluzione fisiologica. Se si devono eseguire analisi molecolari devono essere utilizzati acqua sterile per analisi molecolari e contenitori ad uso generale. In caso di esame molecolare il volume non deve superare 2 ml. Seminare ogni piastra di agar ed il vetrino per la colorazione Gram con una goccia di materiale usando una pipetta sterile. (consultare QSOP 52 - Inoculation of culture media). Diffondere l inoculo con un ansa sterile per ottenere colonie separate. Seminare il brodo con il resto della sospensione comprendendo ogni frammento di tessuto. Data di Revisione: Emesso da: Standards Unit, Department for Evaluations, Standards and Training Pagina 11 di 19

12 4.4.3 TERRENI DI COLTURA, CONDIZIONI E MICRORGANISMI PER TUTTI I CAMPIONI Aspetti clinici/ condizioni Terreni standard Incubazione Lettura colture Microrganismo(i) ricercato Temp C Atmosfera Tempo Osteomielite Sbrigliamento di dispositivo di fissaggio frattura, Biopsia ossea. Ascesso di Brodie, Osteomielite del piede diabetico Discite Agar sangue e agar cioccolato Agar per anaerobi esigenti *Brodo per anaerobi esigenti, brodo di carne bollita o equivalente Sottocoltura quando torbido o a 5 giorni come di seguito specificato % CO ore Giornaliera Stafilococchi Streptococchi Enterobatteriaceae Pseudomonadi Gruppo HACEK Specie Nocardia Anaerobica 5 giorni* Giornaliera Anaerobi aria 5 giorni N/D Stafilococchi Streptococchi Enterobatteriaceae Pseudomonadi Anaerobi Piastre di sottocoltura Agar per anaerobi esigenti Anaerobica 2 giorni Giornaliera Anaerobi Cioccolato % CO 2 2 giorni Giornaliera Qualsiasi Micetoma Osteomielite fungina Agar Sabouraud aria 2 5 giorni 40 ore fino a 8 settimane Funghi Considerare sempre altri microrganismi quali le specie Mycobacterium (BSOP 40 - Investigation of specimens for Mycobacterium species), funghi e actinomiceti. Devono essere considerati accertamenti di routine per micobatteri per tutte le infezioni della colonna vertebrale non successive ad interventi chirurgici. La maggior parte dei casi chirurgici con biopsie intra-operatorie, quali la fissazione della frattura con dispositivi o l osteomielite cronica, richiedono campioni multipli. Se si isola un microrganismo non differenziabile in due o più campioni è probabile che sia clinicamente significativo Note: *Può richiedere incubazione per altri 3 giorni Data di Revisione: Emesso da: Standards Unit, Department for Evaluations, Standards and Training Pagina 12 di 19

13 4.5 IDENTIFICAZIONE LIVELLO MINIMO DI IDENTIFICAZIONE IN LABORATORIO Actinomiceti AnaerobI livello genere BSOPID 15 Idetification of anaerobic actinomycetes species livello genere BSOPID 14 - Identification of non-sporing, non-branching anaerobes BSOPID 8 Identification of Clostridium species BSOPID 25 - Identification of anaerobic Gram-negative rods BSOPID 15 Idetification of anaerobic actinomycetes species Streptococchi -emolitici livello gruppo di Lancefield Altri streptococchi livello specie Enterococchi livello specie Enterobatteriaceae livello specie Fungi livello specie Haemophilus livello specie Pseudomonadi livello specie S. aureus livello specie Stafilococchi livello genere (non aureus) Mycobacterium BSOP 40 - Investigation of specimens for Mycobacterium species I microrganismi possono essere successivamente identificati su indicazione clinica od epidemiologica. Nota: Qualsiasi microrganismo considerato contaminante non richiede l identificazione a livello di specie INVIARE AL LABORATORIO DI RIFERIMENTO Per informazioni sulle prove disponibili, tempi di risposta, procedure per il trasporto ed altre richieste del laboratorio di riferimento, click here for user manuals and request forms. Inviare all appropriato laboratorio di riferimento microrganismi con resistenze inusuali o inattese, ove sussista un problema di laboratorio o clinico od anomalie che richiedano approfondimenti. 4.6 PROVE DI SENSIBILITA AGLI ANTIMICROBICI Refertare la sensibilità come clinicamente indicato. Consultare Sezione PROCEDURA DI REFERTAZIONE 5.1 MICROSCOPIA COLORAZIONE GRAM Refertare i GB ed i microrganismi riscontrati TEMPO REFERTO MICROSCOPICO Referto scritto Microscopico urgente ore telefonare quando disponibile Data di Revisione: Emesso da: Standards Unit, Department for Evaluations, Standards and Training Pagina 13 di 19

14 5.2 COLTURA Refertare qualsiasi crescita. Refertare assenza di crescita Refertare anche i risultati delle prove supplementari TEMPO DI REFERTO COLTURALE Referto scritto: 16 72ore, segnalando, se appropriato, che verrà inviato un referto successivo Ricerche supplementari; Funghi e specie Mycobacterium (BSOP 40 - Investigation of specimens for Mycobacterium species). Risultati clinicamente urgenti: telefonare quando disponibili 5.3 PROVE DI SENSIBILITA AGLI ANTIMICROBICI E importante utilizzare un ampio spettro di antibiotici, particolarmente per quei pazienti che possono richiedere prolungati trattamenti orali con farmaci attivi verso i biofilm (consultare introduzione). Questi antibiotici comprendono gli antimicrobici di prima scelta saggiati nella maggior parte dei laboratori. Per i Gram positivi questi possono comprendere la MIC della teicoplanina ed altri antibiotici quali rifampicina, tetracicline, chinoloni, co-trimossazolo, acido fusidico, linezolid, quinupristin/dalfopristin ed altri. Per dettagli tecnici, consultare BSOP 45 - Susceptibility Testing. 6 SEGNALAZIONI ALLA HPA 46 (LOCALE E SERVIZI NAZIONALI ED AL CENTRO CDSC PER LE INFEZIONI) Fare riferimento a: Singolo MNS per l identificazione del microrganismo Pubblicazioni della Health Protection Agency: Reporting to the CDR: A guide for laboratories Hospital infection control: guidance on the control of infection in hospital Fare riferimento alle linee guida attuali del CDSC ed alle indicazioni del COSURV Repertare tutti li isolati nel modo seguente: Specie Mycobacterium Specie Brucella Data di Revisione: Emesso da: Standards Unit, Department for Evaluations, Standards and Training Pagina 14 di 19

15 RINGRAZIAMENTI E CONTATTI Si ringraziano per il loro contributo personale nella realizzazione di questo documento il Dr. Bridge Atkins, il Dr. Ivor Byren ed il Dr. Tony Berendt, Bone Infection Unit, Nuffield Orthopaedic Centre, Oxford, per la realizzazione di questo documento. Questo Metodo Nazionale Standard è stato sviluppato, revisionato e controllato dal National Standard Methods Working Group for Clinical Bacteriology ( org.uk/wg bacteriology.asp). Si ringraziano per il contributo le numerose persone appartenenti a laboratori clinici di microbiologia ed alle organizzazioni specialistiche che hanno fornito informazioni e commenti nel corso della preparazione di questo documento, ed infine il Redattore Medico. I Metodi Nazionali Standard sono emessi dalla Standards Unit, Department for Evaluations, Standards and Training, Centre for Infections, Health Protection Agency London. Per ulteriori informazioni contattateci a: Standards Unit Evaluations and Standards Laboratory Centre for Infections Health Protection Agency Colindale, London NW9 5EQ standards@hpa.org.uk Data di Revisione: Emesso da: Standards Unit, Department for Evaluations, Standards and Training Pagina 15 di 19

16 APPENDICE Preparare i campioni Osteomielite Sbrigliamento di dispositivo per fissaggio frattura Biopsia ossea Ascesso di Brodie Osteomielite piede diabetico Discite Terreni addizionalii Micetoma Osteomielite fungina Agar sangue e Cioccolato Agar anaerobi esigenti Brodo anaerobi esigenti brodo di carne cotta o equivalente Agar Sabouraud Incubare a C 5-10% CO ore Lettura giornaliera Tutti i microrganismi Riferimento BSOP ID Incubare a C Anaerobiosi Lettura giornaliera Anaerobi Riferimento BSOP ID 8 BSOP ID 10 BSOP ID 25 Agar anaerobi esigenti Incubare a C Anaerobiosi 2 giorni Lettura iornaliera Incubare a C Aerobiosi 5 giorni Agar cioccolato Incubare a C 5-10% CO 2 2 giorni Lettura giornaliera Incubare a C Aerobiosi 2-5 giorni Lrggre >40 ore fino a 8 settimane Funghi Anaerobi Riferimento BSOP ID 8 BSOP ID 10 BSOP ID 25 Tutti i microrganismi Riferimento BSOP ID RICERCA SU OSSO E TESSUTO CONNETTIVO LASSO ASSOCIATI AD OSTEOMIELITE Data di revisione: Emesso da: Standards Unit, Department for Evaluations, Standards and Training Pagina 16 di 19 Questo MNS deve essere usato congiuntamente con gli altri MNS emessi dalla Health Protection Agency Riferimento no. BSOP 42i1

17 BIBLIOGRAFIA 1. Department of Health NHS Executive: The Caldicott Committee. Report on the review of patientidentifiable information. London. December Lew DP, Waldvogel FA. Osteomyelitis. N Engl J Med 1997;336: Waldvogel FA, Papageorgiou PS. Osteomyelitis: the past decade. N Engl J Med 1980;303: Mader JT, Calhoun J. Osteomyelitis. In: Mandell GL, Bennett JE, Dolin R, editors. Mandell, Douglas and Bennett's Principles and Practice of Infectious Diseases. 5 th ed. Edinburgh: Churchill Livingstone; p Mackowiak PA, Jones SR, Smith JW. Diagnostic value of sinus-tract cultures in chronic osteomyelitis. JAMA 1978;239: Mousa HA. Evaluation of sinus-track cultures in chronic bone infection. J Bone Joint Surg Br 1997;79: Cierny G, Mader JT. Adult chronic osteomyelitis. Orthopaedics 1984;7: Ish-Horowicz MR, McIntyre P, Nade S. Bone and joint infections caused by multiply resistant Staphylococcus aureus in a neonatal intensive care unit. Pediatr Infect Dis J 1992;11: Morrey BF, Peterson HA. Hematogenous pyogenic osteomyelitis in children. Orthop Clin North Am 1975;6: Tsui HF, Chiu KH, Leung KS. Osteomyelitis of the spine due to Salmonella infection--conservative treatment with quinolone: a case report. Can J Surg 1997;40: Chandrasekar PH, Narula AP. Bone and joint infections in intravenous drug abusers. Rev Infect Dis 1986;8: Dunn EC, Singer L. Operative treatment of Brodie's abscess. J Foot Surg 1991;30: Holzman RS, Bishko F. Osteomyelitis in heroin addicts. Ann Intern Med 1971;75: Sapico FL, Montgomerie JZ. Pyogenic vertebral osteomyelitis: report of nine cases and review of the literature. Rev Infect Dis 1979;1: Musher DM, Thorsteinsson SB, Minuth JN, Luchi RJ. Vertebral osteomyelitis. Still a diagnostic pitfall. Arch Intern Med 1976;136: Farrington M, Eykyn SJ, Walker M, Warren RE. Vertebral osteomyelitis due to coccobacilli of the HB group. Br Med J (Clin Res Ed) 1983;287: Wallace R, Cohen AS. Tuberculous arthritis: A report of two cases with review of biopsy and synovial fluid findings. Am J Med 1976;61: Gorse GJ, Pais MJ, Kusske JA, Cesario TC. Tuberculous spondylitis. A report of six cases and a review of the literature. Medicine (Baltimore) 1983;62: Marchevsky AM, Damsker B, Green S, Tepper S. The clinicopathological spectrum of nontuberculous mycobacterial osteoarticular infections. J Bone Joint Surg Am 1985;67: Rahn KA, Jacobson FS. Pseudomonas osteomyelitis of the metatarsal sesamoid bones. Am J Orthop 1997;26: RICERCA SU OSSO E TESSUTO MOLLE ASSOCIATI AD OSTEOMIELITE Data di revisione: Emesso da: Standards Unit, Department for Evaluations, Standards and Training Pagina 17 di 19 Questo MNS deve essere usato congiuntamente con gli altri MNS emessi dalla Health Protection Agency Riferimento no. BSOP 42i1

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19 40. BS EN 12469: Biotechnology - performance criteria for microbiological safety cabinets. London: British Standards Institution (BSI); BS 5726: Microbiological safety cabinets. Part 2. Recommendations for information to be exchanged between purchaser, vendor and installer and recommendations for installation. London: British Standards Institution (BSI); BS 5726: Microbiological safety cabinets. Part 4. Recommendations for selection, use and maintenance. London: British Standards Institution (BSI); Advisory Committee on Dangerous Pathogens. The management, design and operation of microbiological containment laboratories. Suffolk: HSE Books; Directive 98/79/EC of the European Parliament and of the Council of 27 October 1998 on in vitro diagnsotic medical devices. Official Journal of the European Communities 1998; Holden J. Collection and transport of clinical specimens for anaerobic culture. In: Isenberg HD, editor. Clinical Microbiology Procedures Handbook.Vol 1. Washington D.C.: American Society for Microbiology; p Health Protection Agency. Laboratory Reporting to the Health Protection Agency. Guide for diagnostic laboratories (as amended) RICERCA SU OSSO E TESSUTO MOLLE ASSOCIATI AD OSTEOMIELITE Data di revisione: Emesso da: Standards Unit, Department for Evaluations, Standards and Training Pagina 19 di 19 Questo MNS deve essere usato congiuntamente con gli altri MNS emessi dalla Health Protection Agency Riferimento no. BSOP 42i1